一株乳酸乳球菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株乳酸乳球菌乳亚种及其应用。


背景技术：

2.joseph在1983年将世界上第一个被认识和科学描述的细菌纯培养物l. lactis 称为“乳酸细菌”。l.lactis 为革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，不生芽孢，不运动，无荚膜，细胞对称生长，呈球形或卵圆形的兼性厌氧菌，属于嗜温性乳酸菌，在25-30℃的温度下有最优良的生长曲线，在10℃的低温环境下可以存活，但在45℃及0.5%nacl的环境中不能存活。分类学上隶属于硬壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，乳球菌属。乳酸乳球菌乳亚种乳亚种(l.lactis subsp.lactis)是乳酸乳球菌乳亚种（l. lactis）的一个亚种，另外2个亚种分别是乳酸乳球菌乳亚种乳脂亚种(l. lactissubsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳亚种霍氏亚种(l.lactisubspsubsp.hordniae)。
3.l.lactis subsp.lactis能够提供酶驱动发酵乳制品中风味化合物的产生，主要代谢途径是糖代谢、蛋白质水解和脂肪分解。糖代谢过程产生有机酸（主要是乳酸）能够赋予发酵乳令人愉快的酸味，l.lactis subsp.lactis中的乳酸乳球菌乳亚种乳酸亚种双乙酰变种（l.lactis subsp.lactis biovar diacetylactis）能够通过碳水化合物和柠檬酸盐共代谢途径分解柠檬酸盐，产生风味化合物双乙酰和乙偶姻。passerini等依据双乙酰变种的基因组分析结果表明，大多数驯化以及野生l.lactis 都可以产生双乙酰或乙偶姻或两者都有。有菌株产生一种抗菌素——尼生素（nisin）(hirsch，1951)，它抑制许多阳性菌。在含4.0%的nacl培养基中生长，而在6.5%时不生长。在ph9.2时能开始生长，而在ph9.6时不能生长。在后两项特征中有些变化。在0.3%的美蓝牛奶中生长。有些菌株能够代谢亮氨酸产生3-甲基丁醇，它具有乳制品中所没有的麦芽味（jackson and morgon，1954）。l.lactis 中芳香族和支链氨基酸转移酶发别转化芳族氨基酸、亮氨酸和蛋氨酸以及异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸；天冬氨酸氨基转移酶用于代谢天冬氨酸。不同氨基酸在代谢过程中能够产生不同风味，如代谢天冬氨酸时能够形成黄油风味，代谢支链氨基酸会形成麦芽风味。
4.乳脂肪是一类重要的前体风味物质，乳脂肪在脂肪酶的作用下被分解成游离氨基酸，脂肪酸进一步转化为多种风味物质，如甲基酮、仲醇、酯和内酯等。最近研究表明，l.lactis 的某些野生菌株比驯化菌株有着更高的脂肪酶活性水平，在干酪成熟过程中产生甲基酮等风味化合物。
5.乳酸乳球菌乳亚种在决定发酵乳制品的货架期和感官时发挥着重要作用，是发酵食品特别是干酪制作中主要的菌株之一，它常被用作稀奶油、酸奶、乳饮料等乳制品的生产，同时也是制备干酪常用的发酵剂，例如切达干酪、农家干酪、夸克等，并且已被食品和药品管理局（fda）授予gras地位。
6.本发明基于西藏理塘酥油样品中分离获得的乳酸菌，从中筛选出来具有高产3-甲基丁醇的乳酸乳球菌乳亚种。该菌株具有优良的发酵特性和良好的感官特性，尤其在产香方面相较其他乳酸菌有明显的优势。本发明的乳酸乳球菌乳亚种可为我国发酵剂的研究及
应用提供理论基础。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的在于：针对上述问题，提供了一株乳酸乳球菌及其应用。本发明的乳酸乳球菌乳亚种与市场发酵剂相比，在柠檬酸钠和（或）亮氨酸存在条件下，该菌具有更高的特定风味物质水平。
8.本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
9.本发明的一方面提供了一株乳酸乳球菌，该菌株为乳酸乳球菌乳亚种（lactococcus lactissubsp.lactis）wg-lla 26，于2022年11月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no. 26090。
10.优选地，所述乳酸乳球菌具有更优前体利用能力、产生特定风味物质的能力，在牛乳发酵制品中有麦芽香特征风味；所述特定风味物质为以3-甲基丁醛、3-甲基丁醇主，2,3-丁二酮为辅的挥发性物质。
11.本发明所用的菌株来源于南京传统发酵食品。
12.以下是对乳酸乳球菌乳亚种（lactococcus lactissubsp.lactis）wg-lla 26菌株的形态特征、生理生化特征以及16s rrna基因序列的说明：（1）菌株的形态特征：乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26在m17固体培养基培养48 h后，表面边缘均光滑，形状规则呈圆形，乳白色；乳酸乳球菌乳亚种菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，球状。成对或成链状。
13.（2）菌株的16s rrna基因序列：乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26与ncbi中genbank乳酸乳球菌乳亚种的鉴定的16s rdna序列同源性超过99%。
14.本发明的另一方面还提供了一种乳酸乳球菌乳亚种在制备发酵食品中的应用。
15.优选地，所述发酵食品包括发酵乳，所述发酵乳的制备方法，包括以下步骤：（1）发酵剂的制备：将甘油管保藏的乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26接入m17液体培养基，42℃培养24h，经2～3次活化培养后，无菌条件下，接入灭菌脱脂乳中，42℃培养6h，备用；（2）接种发酵：将发酵剂按2%（v/v）比例接种于以上制备的脱脂乳培养基，混匀，43℃静置培养，以滴定酸度达到75-85
ꢀ°
t为发酵终点，置于4℃冷藏24h，即得发酵乳。
16.优选地，所述脱脂乳培养基按照以下方法制备：首先配制12％脱脂乳粉复原培养基，然后在60℃、20mpa的条件下进行均质，接着在95℃下灭菌300s，得到脱脂乳培养基。
17.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明的乳酸乳球菌是以3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2,3-丁二酮为特征风味指标筛选而来，命名为乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26。经过发酵时间、发酵温度、传代稳定性、后酸化初筛，感官分析、风味物质代谢差异、前体物利用能力复筛，具有较高的前体利用能力和特征风味物质代谢能力，其在牛乳制品中发酵可以产有麦芽香特征风味。
18.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，
并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并结合附图详细说明如后。
附图说明
19.图1为不同氨基酸加对发酵乳特定风味代谢的影响图；图2为不同菌株代谢亮氨酸发酵乳产生特定风味物质的差异研究；图3为乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26单独或协同代谢亮氨酸和柠檬酸钠发酵乳产生特定风味物质的差异研究；图4为市售发酵剂单独或协同代谢亮氨酸和柠檬酸钠发酵乳产生特定风味物质的差异研究。
实施方式
20.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
21.本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
22.本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
23.实施例1乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26的分离及鉴定1.样品来源本实施例所用的菌株来源于南京传统发酵食品（一种发酵乳，为本专利申请人自有产品），样品共采集29份。
24.2.菌株的分离纯化取约5 g样品于无菌管中收集，立即送至实验室进行菌株分离纯化。样品中优势乳酸菌在mrs和m17培养基中分别分离纯化乳酸杆菌和乳酸球菌。分离时取1 g样放入9 ml的mrs/m17液体培养基中，涡旋混匀后于37 ℃下富集培养48 h；然后在超净台中吸取培养液1 ml，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取105、106、107三个稀释梯度，每个稀释梯度分别取菌悬液100 μl涂于mrs/m17固体培养基上，于37℃培养48 h。培养结束后，从mrs/m17固体培养基中选择生长有30~300个单菌落的平板，挑取典型菌落，在mrs/m17琼脂平板上多次划线分离，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到mrs/m17液体培养基中扩大培养。得到的菌株在含有30% (w/v)甘油的mrs/m17液体培养基的-80℃冰箱中冷冻保存。
25.3.菌株鉴定3.1 菌落特征乳酸乳球菌乳亚种在m17固体培养基培养48 h后，表面边缘均光滑，形状规则呈圆形，乳白色。
26.3.2 显微镜下形态乳酸乳球菌乳亚种菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，球状。成对或成链状。
27.3.3 16s rdna鉴定用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取目标菌株基因组dna，将提取的乳酸乳
球菌乳亚种基因组dna作为pcr扩增的模板，采用细菌通用引物27f和1492r进行16s rdna 的pcr实验，pcr反应扩增结束后，取pcr产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1500bp左右。pcr产物送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序，结果如seq id no.1所示，将序列在ncbi网站上进行blast序列比对，结果显示该序列与乳酸乳球菌乳亚种的鉴定的16s rdna序列同源性超过99%。
28.seq id no.1：ataca tgcaa gttga gcgct gaagg ttggt acttg accga ctgga tgagc agcga acggg tgagt aacgc gtggg gaatc tgcct ttgag cgggg gacaa cattt ggaaa cgaat gctaa taccg cataa aaact ttaaa cacaa gtttt aagtt tgaaa gatgc aattg catca ctcaa agatg atccc gcgtt gtatt agcta gttgg tgagg aaagg ctcac caagg cgatg ataca tagcc gacct gagag ggtga tcggc cacat tggga ctgag acacg gccca aactc ctacg ggagg cagca gtagg gaatc ttcgg caatg gacga aagtc tgacc gagca acgcc gcgtg agtga agaag gtttt cggat cgtaa aactc tgttg gtaga gaaga acgtt ggtga gagtg gaaag ctcat caagt gacgg taact accca gaaag ggacg gctaa ctacg tgcca gcagc cgcgg taata cgtag gtccc gagcg ttgtc cggat ttatt gggcg taaag cgagc gcagg tggtt tatta agtct ggtgt aaaag gcagt ggctc aacca ttgta tgcat tggaa actgg tagac ttgag tgcag gagag gagag tggaa ttcca tgtgt agcgg tgaaa tgcgt agata tatgg aggaa caccg gtggc gaaag cggct ctctg gcctg taact gacac tgagg ctcga aagcg tgggg agcaa acagg attag atacc ctggt agtcc acgcc gtaaa cgatg agtgc tagat gtagg gagct aaagt tctct gtatc gcagc taacg caata agcac tccgc ctggg gagta cgacc gcaag gttga aactc aaagg aattg acggg ggccc gcaca agcgg tggag catgt ggttt aattc gaagc aacgc gaaga acctt accag gtctt gacat actcg tgcta ttcct agaga tagga agttc cttcg ggaca cggga tacag gtggt gcatg gttgt cgtca gctcg tgtcg tgaga gttgg gttaa gtccc gcaac gagcg caacc cctat tgtta gttgc catca ttaag ttggg cactc aacga gactg ccggt gataa accgg aggaa ggtgg ggatg acgtc aaatc atcat gcccc ttatg acctg ggcta cacac gtgct acaat ggatg gtaca acgcg cgaga cagtg atgtt tagct aatct cttaa aacca ttctc agttc ggatt gtagg ctgca actcg cctac atgaa gtcgg aatcg ctagt aatcg cggat cagca cgccg cggtg aatac gttcc cgggc cttgt acaca ccgcc cgtca cacca cggga gttgg gagta cccga agtag gttgc ctaac cgcaa ggagg gcgct tccta aggta agacc gatga ctggg gtgaa gtcgt aacaa g基于以上，将该乳酸乳球菌乳亚种命名为乳酸乳球菌乳亚种（lactococcus lactis subsp.lactis）wg-lla 26，于2022年11月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no. 26090。
29.实施例2 发酵剂的制备将甘油管保藏的乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26接入m17液体培养基，42℃培养24h，经2～3次活化培养后，无菌条件下，接入灭菌脱脂乳中，42℃培养6h，备用。
30.实施例3 发酵乳制备1.脱脂乳培养基的制备配制12％脱脂乳粉复原培养基，然后在60℃、20mpa的条件下进行均质，接着在95℃下灭菌300s，得到脱脂乳发酵培养基。
31.2.接种发酵将发酵剂按2%（v/v）比例分别接种于以上制备的脱脂乳培养基、混匀，43℃静置培养，以滴定酸度达到75-85
ꢀ°
t为发酵终点，置于4℃冷藏24h，备用。
32.实施例4菌株发酵性能粗筛试验将甘油管保藏的乳酸乳球菌乳亚种接入m17或mrs液体培养基，42℃培养24h，经2～3次活化培养后，无菌条件下，2%接入灭菌脱脂乳中，42℃进行发酵乳制备，记录发酵凝乳时间。凝乳后破乳于4℃储存21天，记录储存开始到结束的ph变化。根据初筛标准，发酵凝乳时间4-8h，初始ph在75-85
ꢀ°
t范围下，储存开始到结束的ph变化小于10的菌株即挑选出，进行复筛优选程序。
33.实施例5 gc ms检测发酵乳中的3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2,3-丁二酮采用固相微萃取顶空法与气相色谱－质谱联用( spme－gc－ms)方法测定样品中的挥发性风味物质，以此衡量菌株产香的风味差异。所用气相色谱-质谱联用仪型号为7890a－5975c，美国安捷伦有限公司。
34.具体步骤如下：取4 ml发酵液置于20 ml顶空瓶中，加入1 g nacl，将老化后的萃取头（75 um，car/pdms，supelco）插入样品瓶顶空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min。
35.程序升温条件：柱初温40℃，维持 3 min，然后以4 ℃/min的速率升温至80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的升温速率升至230 ℃，保持1 min。毛细管柱db wax(30m
×
0 .25mm
×
0 .25um)，以氦气做载气，流速为1 ml/min。电离方式为el，电子能量70ev，离子源温度230 ℃，接口温度为280 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描范围：30
ꢀ‑
550 m/z。
36.各风味组分的表示方法：各组分经谱库检索确定，仅选择匹配度大于80%的组分,相对含量以峰面积占检出气体总峰面积百分比表示。
37.风味物质的定量分析由内标法确定( 内标为 4－甲基－2－戊酮) ，即采用各成分峰面积与内标物峰面积对比进行半定量分析，计算公式如下：挥发性物质浓度( μg /l) = ( 各成分峰面积
ꢀ×ꢀ
内标物质量) /( 内标物峰面积
ꢀ×ꢀ
样品量)实施例6 不同前体物对特征风味的影响试验1.不同氨基酸脱脂乳培养基的制备配制12％脱脂乳粉复原液体培养基，将该培养基循环加热至50 ℃，加入0.2%的亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸，保温搅拌15 min，转速8000 rpm然后在温度60℃与20mpa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌300s，得到多种发酵培养基。
38.2.发酵将发酵剂按2%（v/v）比例分别接种于以上制备的脱脂乳培养基，43℃静置培养，以滴定酸度达到75-85
ꢀ°
t为发酵终点，置于4℃冷藏24h，gcms测定发酵乳顶空中的挥发性组分，分析不同氨基酸添加对发酵乳特定风味代谢的影响。使用初筛获得的乳酸乳球菌乳亚种参加本实验，数据表明亮氨酸具有更好的促进作用，其中使用乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26发酵的试验结果如附图1所示，乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26代谢亮氨酸产生的3-甲基丁
醛含量为0.69mg/l, 远高于3-甲基丁醛在相似溶液中的阈值范围（0.016-0.15 mg/l），使产品具有清淡的坚果香味。而代谢缬氨酸、异亮氨酸时依次降低，分别为0.32和0.14 mg/l，处于可嗅和不可嗅之间。
39.实施例7 不同菌株代谢亮氨酸发酵乳产生特定风味物质的差异研究1.脱脂乳培养基的制备配制12％脱脂乳粉复原液体培养基，将该培养基循环加热至50 ℃，加入0.2%的亮氨酸，保温搅拌15 min，转速8000 rpm然后在温度60℃与20mpa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌300s，得到脱脂乳发酵培养基。
40.2.发酵将不同发酵剂按2%（v/v）比例分别接种于以上制备的脱脂乳培养基，43℃静置培养，以滴定酸度达到75-85
ꢀ°
t为发酵终点，置于4℃冷藏24h，gcms测定发酵乳顶空中的挥发性组分，分析不同菌株代谢亮氨酸发酵乳产生特定风味物质的差异。
41.使用初筛获得的乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26以及市售发酵剂参加本实验，数据表明亮氨酸具有更好的促进作用，其中使用乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26发酵的试验结果最优，如附图2所示，乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26代谢亮氨酸产生的3-甲基丁醛含量为0.69mg/l, 远高于3-甲基丁醛在相似溶液中的阈值范围（0.016-0.15 mg/l），也高于两株参比乳酸乳球数据，同时更高于市售发酵剂的数据。
42.实施例8 不同风味前体协同影响研究1.脱脂乳培养基的制备配制12％脱脂乳粉复原液体培养基，将该培养基循环加热至50 ℃，加入0.2%的亮氨酸或者加入0.2%的柠檬酸钠或者同时加入0.2%的亮氨酸和0.2%的柠檬酸钠，保温搅拌15 min，转速8000 rpm然后在温度60℃与20mpa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌300s，得到多种发酵培养基。
43.2.发酵将乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26发酵剂或者市售发酵剂按2%（v/v）比例分别接种于以上制备的脱脂乳培养基，43℃静置培养，以滴定酸度达到75-85
°
t为发酵终点，置于4℃冷藏24h，gc-ms测定发酵乳顶空中的挥发性组分，分析两种菌株发酵剂代谢亮氨酸、柠檬酸钠的单独或协同效果，以及发酵乳产生特定风味物质的差异。
44.结果如附图3-4所示，使用初筛获得的乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26以及市售发酵剂参加本实验，数据表明亮氨酸对3-甲基丁醛、3-甲基丁醇有促进作用，柠檬酸钠对2,3-丁二酮有促进作用，同时添加亮氨酸和柠檬酸钠没有协同促进作用。
45.具体地，如附图3所示，与不添加（3-甲基丁醛，3-甲基丁醇和2,3-丁二酮：0,0,0 mg/l）相比，乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26使用亮氨酸对3-甲基丁醛、3-甲基丁醇有促进作用（0.69,7.88 mg/l）；柠檬酸钠对2,3-丁二酮有促进作用（3.613 mg/l）；同时添加亮氨酸和柠檬酸钠，具有协同促进作用（3-甲基丁醛，3-甲基丁醇和2,3-丁二酮：2.95,14.081,1.975 mg/l），但三个优化的处理方案（亮氨酸，柠檬酸钠，二者协同：7.88,0,14.081 mg/l）中3-甲基丁醇含量仍低于阈值范围50-100 mg/l。
46.具体地，如附图4所示，与不添加（3-甲基丁醛，3-甲基丁醇和2,3-丁二酮：0,0,1.147 mg/l）相比，使用市售发酵剂作用亮氨酸对3-甲基丁醛、3-甲基丁醇也有促进作用
（0.12,3.41mg/l），低于这些风味物质的阈值；柠檬酸钠对2,3-丁二酮有也促进作用（5.537 mg/l），符合相关理论；同时添加亮氨酸和柠檬酸钠，协同促进作用不明显（3-甲基丁醛，3-甲基丁醇和2,3-丁二酮：0.090,4.16,4.842 mg/l）。
47.具体地，横向对比乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26和市售发酵剂的差异，乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26有更加优秀的亮氨酸利用能力，产生的有效风味物质3-甲基丁醛分别为0.69和0.12 mg/l；同样地，乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26有更加优秀的亮氨酸和柠檬酸钠协同利用能力：产生的3-甲基丁醛分别为2.95和0.909 mg/l，同时，产生的2,3-丁二酮为1.975低于市售发酵剂的4.842 mg/l，更能达成风味差异，使产品突出了3-甲基丁醛赋予的果香。
48.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种乳酸乳球菌，命名为乳酸乳球菌乳亚种（lactococcus lactis subsp.lactis）wg-lla 26，其特征在于：具有更优前体利用能力、产生特定风味物质的能力。在牛乳发酵制品中有麦芽香特征风味。2.根据权利要求1所述的特定风味物质，其特征在于：以3-甲基丁醛、3-甲基丁醇为主，2,3-丁二酮为辅的挥发性物质。3. 根据权利要求1所述的一种乳酸乳球菌，其特征在于：菌株名为乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26，于2022年11月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no. 26090。4. 根据权利要求1所述的前体利用能力，其特征在于：与市场发酵剂相比，在柠檬酸钠和（或）亮氨酸存在条件下，菌株名为乳酸乳球菌乳亚种wg-lla 26具有更高的特定风味物质水平。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株乳酸乳球菌乳亚种及其应用。该菌株为乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）WG-lla 26，于2022年11月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.26090。本发明的菌种具有更优前体利用能力、产生特定风味物质的能力，在牛乳发酵制品中有麦芽香特征风味。乳发酵制品中有麦芽香特征风味。乳发酵制品中有麦芽香特征风味。


技术研发人员：杨欢东 王伟军 龄南 王红兵 杨菲菲
受保护的技术使用者：江苏卫岗乳品研究院有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/7/13