一种克服顺铂耐药的顺铂前药自组装纳米粒的制备和应用

1.本发明属于医药技术与药物制剂领域，主要包括克服顺铂耐药的顺铂前药(lnd-ss-pt-tpp)的合成和lnd-ss-pt-tpp/ha-cd纳米靶向系统的组装构建，以及该系统抗肿瘤作用的研究。


背景技术：

2.癌症严重威胁着全人类的健康，因此对于治疗恶性肿瘤的抗癌药物的开发一直是药物开发得重点。顺铂是治疗各种实体癌，如睾丸癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌等的最有潜力和最广泛使用的药物之一，但由于其靶向性差，副作用强和易产生耐药，因此限制其临床应用。
3.本发明合成构建一种具有三重靶向作用的lnd-ss-pt-tpp/ha-cd还原刺激响应型自组装前药纳米靶向递送系统。ha-cd高分子材料包裹的前药纳米粒子可通过主动靶向肿瘤表面cd44，然后通过三苯基磷基团靶向细胞内线粒体，从而将前药递送至肿瘤细胞中的线粒体；二硫键可选择性地被肿瘤细胞和线粒体中高浓度gsh降解断裂，释放出lnd和四价顺铂，同时在gsh和坏血酸作用下四价铂还原为二价铂；释放lnd可降低肿瘤细胞中己糖激酶2的表达，破坏线粒体和抑制糖酵解以阻断能量供应，起到肿瘤细胞杀伤作用的同时还可以克服顺铂耐药。同时释放的顺铂造成线粒体dna损伤，在协同作用下共同杀伤肿瘤细胞。


技术实现要素：

4.本发明的目的是合成一种具有靶向能力的抗顺铂耐药的小分子前药，并将其组装成纳米药物，从而实现载药量高稳定性好、毒副作用低的效果，进而提高抗肿瘤活性。
5.本发明通过以下技术方案实现上述目的：
6.本发明所述的小分子前药是通过二硫键将缀合了tpp基团的四价铂类药物与氯尼达明相连，其结构式如下：
[0007][0008]
其中m为1-6的整数；n为1-6的整数。
[0009]
本发明提供的小分子前药合成方法步骤如下：顺铂被过氧化氢氧化形成四价铂，然后与中间产物tpp-nhs反应形成tpp-pt。合成氯尼达明通过二硫键侧链与tpp-pt相连得到小分子前药lnd-ss-pt-tpp。
[0010]
具体地，本发明提供了小分子前药lnd-ss-pt-tpp的合成方法：
[0011]
氯尼达明的合成：将1h-吲哚-3-羧酸甲酯加入氢氧化钠水溶液中，加热并滴入2，4-二氯氯苄，搅拌并冷却至室温将反应体系调至酸性，冰乙酸重结晶，得氯尼达明。
[0012]
(1)tpp-pt合成：顺铂加入过氧化氢室温搅拌反应，过滤并冲洗，干燥得氯化二氨基二羟基铂(vi)，羧烷基三苯基溴化磷、加入edci和nhs溶解于乙腈中，室温搅拌得中间产物tpp-nhs。将tpp-nhs溶于无水dmso中，加入氯化二氨基二羟基铂(vi)，反应72h然后除去dmso，得tpp-pt；所述羧烷基三苯基溴化磷为(2-羧乙基)三苯基溴化磷、(3-羧丙基)三苯基溴化磷、(4-羧丁基)三苯基溴化磷或(5-羧基戊基)三苯基溴化磷中的一种或多种。
[0013]
(2)lnd-ss-pt-tpp合成：氯尼达明在缩合剂作用下与含有二硫键的烷基二醇发生酯化反应，然后与n,n
’‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯得活化酯，该活化酯与tpp-pt酯化得最终化合物(lnd-ss-pt-tpp)；所述含有二硫键的烷基二醇为2，2
’‑
二硫二乙醇、二硫二甲醇、3，3
’‑
二硫二丙醇或4，4
’‑
二硫二丁醇中的一种或多种。
[0014]
本发明还提供了ha与环糊精(cds)构建成共轭的聚多糖分子(ha-cd)的制备方法，以及lnd-ss-pt-tpp前药与ha-cd非共价键结合形成纳米药物的方法。
[0015]
ha-cd的制备方法：将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)和n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(nhss)添加到透明质酸钠的pbs磷酸盐缓冲液中，室温搅拌30min。然后加入氨基取代环糊精的pbs溶液，在室温下反应24h。透析、冻干，得到ha-cd。
[0016]
lnd-ss-pt-tpp/ha-cd载药纳米系统的制备方法：lnd-ss-pt-tpp溶解于有机中，在搅拌条件下缓慢将药物溶液加入ha-cd水溶液中，超声，透析除去有机溶剂，冻干得lnd-ss-pt-tpp/ha-cd载药纳米粒；所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。
[0017]
本发明构建了lnd-ss-pt-tpp/ha-cd纳米靶向给药系统。ha-cd包裹的药物小分子靶向前药lnd-ss-pt-tpp识别高表达的gsh，特异性作用于肿瘤细胞，二硫键与gsh作用发生断裂释放出pt-tpp与lnd，tpp基团的存在使该药物具有线粒体靶向能力；铂(iv)配合物在gsh作用下随即转化为顺铂，诱导肿瘤细胞dna交联的形成；氯尼达明(lnd)抑制糖酵解酶己糖激酶ii(hkii)，阻断细胞糖酵解过程，从而干扰肿瘤细胞中atp的产生，克服顺铂耐药的同时与顺铂发挥协同杀伤肿瘤细胞作用。本发明实现了药物对肿瘤细胞的特异性作用，其抗肿瘤效果明显优于抗癌药物的单独使用，具有光明的开发前景。
[0018]
本发明所述的以ha-cd包载小分子前药构成的lnd-ss-pt-tpp/ha-cd纳米靶向给药系统，其优势在于(1)具有靶向性，含有二硫键的药物对gsh敏感，富集于高gsh含量的肿瘤细胞，因此该药物可以特异性作用于肿瘤细胞(2)粒径较小，有利于纳米药物的富集(3)载药量高(4)显著提高了抗肿瘤效果，并减轻了毒副作用。
[0019]
本发明具有以下效果：(1)设计合成了lnd-ss-pt-tpp小分子前药,合成方法稳定方便可行。(2)制备了ha与环糊精(cds)构建成共轭的聚多糖分子ha-cd纳米材料，并包载小分子前药形成均匀稳定的纳米粒药物,制备方法简单易行。(3)实现了具有协同作用的两种药物的联合应用，并实现了其靶向作用，使抗癌作用得到了显著提升，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0020]
图1：实施例1中小分子前药lnd-ss-pt-tpp合成路线
[0021]
图2：实施例1中小分子前药lnd-ss-pt-tpp的1hnmr图谱
[0022]
图3：实施例1中小分子前药lnd-ss-pt-tpp的质谱图谱
[0023]
图4：实施例3中lnd-ss-pt-tpp/ha-cd自组装纳米粒达尔文粒径仪粒径测定粒径分布图谱，(a)ha-cd(b)lnd-ss-pt-tpp/ha-cd
[0024]
图5：实施例3中lnd-ss-pt-tpp/ha-cd自组装纳米粒tme电镜扫描图谱，(a)ha-cd；(b)lnd-ss-pt-tpp/ha-cd
[0025]
图6：实施例1中小分子前药lnd-ss-pt-tpp在gsh溶液中裂解质谱图
[0026]
图7：实施例1中小分子前药lnd-ss-pt-tpp在gsh溶液裂解荧光探针显色图，(a)lnd-ss-pt-tpp加探针；(b)为探针；(c)lnd-ss-pt-tpp经过gsh孵育后加探针
[0027]
图8：体外模拟gsh触发二硫键断裂释放示意图
[0028]
图9：实施例3中lnd-ss-pt-tpp/ha-cd自组装纳米粒a549细胞摄取图
具体实施方式
[0029]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
[0030]
实施例1：小分子前药lnd-ss-pt-tpp合成(4-((2，5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-4-氧代丁基)三苯基膦(2)的合成
[0031]
在50ml圆底烧瓶中将edci(211mg，1.1mmol)和nhs(127mg，1.1mmol)加入tpp(329mg，1.0mmol)，溶解于15ml乙腈中。室温搅拌12h，经薄层色谱监测反应进程。旋转蒸发除去乙腈，加入水，用dcm萃取三次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，将有机相减压蒸干，得化合物7(361mg，产率81％)。
[0032]1h-nmr(400mhz，cdcl3)：7.81-7.72(m，9h)，7.66-7.61(m，6h)，4.04-3.96(m，2h)，3.14(t，j＝6.3hz，2h)，2.81-2.74(m，4h)，2.06-2.00(m，2h)。
[0033]
(4-((2，5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-4-氧代丁基)三苯基膦(4)的合成
[0034]
在25ml的圆底烧瓶中将tpp-nhs(161mg，0.36mmol)溶于5ml无水dmso中，逐滴加入溶于无水dmso 10ml中的氯化二氨基二羟基铂(vi)(100mg，0.30mmol)，30℃剧烈搅拌72h，加入过量乙醚除去dmso，产物用甲醇析出并再次用甲醇和乙醚洗涤两次，然后真空干燥，为淡黄色固体化合物8(122mg，产率61％)。
[0035]
氯尼达明(6)的合成
[0036]
在25ml圆底烧瓶中将1h-吲哚-3-羧酸甲酯(708mg，4.0mmol)加入到5.0ml的30％的氢氧化钠水溶液中，升温至100℃，然后缓慢滴入2，4-二氯氯苄(860mg，4.4mmol)，之后快速搅拌4小时，然后冷却至室温，加入20％的盐酸溶液将反应体系调至酸性(ph＝1)，搅拌0.5h后过滤，将产物用冰乙酸重结晶，得目标药物分子氯尼达明化合物2(836mg，产率65％)。
[0037]1h-nmr(400mhz，cd3od)：8.28(d，j＝8.2hz，1h)，7.66(d，j＝8.6hz，1h)，7.60(d，j＝2.1hz，1h)，7.57-7.52(m，1h)，7.45-7.39(m，1h)，7.30(dd，j＝8.4；2.1hz，1h)，6.92(d，j＝8.4hz，1h)，5.89(s，2h)。
[0038]
1-(2，4-二氯苄基)-1h-吲唑-3-羧酸2-((2-羟乙基)二磺酰基)乙酯(7)的合成在25ml圆底烧瓶中加入lnd(32mg，0.10mmol)、edci(47mg，0.25mmol)、dmap(0.23mg，0.01mmol)、2，2'二硫代双乙醇(51mg，0.30mmol)和3ml无水dcm并在室温下在氮气保护下反应12小时。用水洗涤以除去过量的2-羟乙基二硫化物后，将有机层用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。硅胶柱层析分离(甲醇：二氯甲烷1：20)得化合物3(37mg，产率82％)。
[0039]1h-nmr(400mhz，cdcl3)：8.26(d，j＝8.0hz，1h)，7.44-7.35(m，4h)，7.09(dd，j＝8.4；2.1hz，1h)，6.70(d，j＝8.4hz，1h)，5.78(s，2h)，4.75(t，j＝6.8hz，2h)，3.90(t，j＝5.8hz，2h)，3.90(t，j＝6.8hz，2h)，2.93(t，j＝5.8hz，2h)。
[0040]
2-((2-(2-)-4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)氧基乙基)二硫基)乙基1-(2,4-二氯苄基)-1h-吲唑-3-羧酸盐(8)的合成
[0041]
在25ml的圆底烧瓶中将1-(2，4-二氯苄基)-1h-吲唑-3-羧酸2-((2-羟乙基)二磺酰基)乙酯(912mg，2.0mmol)和三乙胺(242μl，2.4mmol)溶解在ch3cn 5ml中，加入n，n
’‑
琥珀酰亚胺基碳酸酯(615mg，2.4mmol)，室温搅拌3h并减压除去溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)得化合物4(764mg，产率64％)。
[0042]1h-nmr(400mhz，cdcl3)：8.26(d，j＝8.1hz，1h)，7.45-7.33(m，4h)，7.10(dd，j＝8.4，2.1hz，1h)，6.71(d，j＝8.4hz，1h)，5.79(s，2h)，4.75(t，j＝6.6hz，2h)，4.59(t，j＝6.8hz，2h)，3.18(t，j＝6.6hz，2h)，3.06(t，j＝6.8hz，2h)，2.82(s，4h)。
[0043]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)：7.92-7.75(m，15h)，6.12-5.86(m，6h)，3.63-3.56(m，2h)，2.50-2.39(m，2h)，1.74-1.65(m，2h)。
[0044]
lnd-ss-pt-tpp(9)的合成
[0045]
在10ml圆底烧瓶中加入tpp-pt(100mg，0.17mmol)和100mg的2-((2-((((2，5-二氧吡咯烷-1-基)氧基)羰基)氧)乙基)二磺酰基)1-(2，4-二氯苄基)-1h-吲唑-3-羧酸乙酯(100mg，0.15mmol)溶于8ml dmso中，室温黑暗条件下反应72h，加水用二氯甲烷萃取三次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，将有机相减压蒸干。通过硅胶柱层析分离(甲醇：二氯甲烷＝1：20)得化合物9(96mg，产率56％)。
[0046]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)：8.16(d，j＝8.8hz，1h)，7.89-7.74(m，16h)，7.69(d，j＝2.0hz，1h)，7.52(t，j＝8.0hz，1h)，7.41-7.37(m，2h)，6.97(d，j＝8.4hz，1h)，6.59(s，2h)，5.87(s，2h)，4.60(t，j＝6.0hz，2h)，4.09-3.95(m，2h)，3.68-3.59(m，2h)，3.16(t，j＝6.0hz，2h)，2.90(t，j＝6.4hz，2h)，2.38-2.27(m，2h)，1.66(s，2h)；esi-ms[m+h]
+
:1147.08。
[0047]
实施例2：透明质酸单-(6-乙二胺基-6-去氧)-β-环糊精接枝物(ha-cd)的合成
[0048]
在100ml圆底烧瓶中将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)(335.4mg，1.75mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(nhss)(380mg，1.75mmol)添加到透明质酸钠(mw＝46000)(200mg，4.34μm)的pbs磷酸盐缓冲液(0.1m，ph 7.2)60ml中，超声溶解并在室温下搅拌30min。然后加入单-(6-乙二胺基-6-去氧)-β-环糊精(1.177g，1.0mmol)pbs20 ml，在室温下反应24h。将所得到的溶液用纯净水透析5天。冻干后，得到白色片状固体ha-cd。
[0049]
实施例3：lnd-ss-pt-tpp/ha-cd纳米粒的制备
[0050]
ha-cd 10.0mg，溶于900μl超纯水。lnd-ss-pt-tpp 0.5mg，充分溶于100μl dmso中，在搅拌条件下缓慢将药物溶液分次加入ha-cd溶液中，超声10min(超声功率250w，工作
2s，间歇3s)。透析袋(截留分子量3500)透析24h，存于4℃冰箱备用。
[0051]
表1：小分子前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布、表面电荷和载药量
[0052][0053][0054]
实施例4：cck-8法检测细胞增殖
[0055]
将处于对数生长期的a549细胞、a549顺铂耐药细胞分别接种于96孔板，调整细胞密度，每孔体积100μl，置于培养箱(37℃、50ml/l co2)培养；待细胞完全贴壁后，加入不同浓度供试品继续培养；培养不同时间后，加入10μl cck-8溶液。将培养板在培养箱中孵育2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度od值，计算出各组细胞增殖抑制率ic
50
。
[0056]
表2cck8法细胞增殖抑制检测
[0057][0058]
实施例5：细胞核、细胞质和线粒体铂摄取测定
[0059]
供试品与细胞共培养24h，洗去死去的细胞，将剩余的贴壁细胞用pbs清洗一遍，然后用膜酶消化液(trypsin-edta solution)消化细胞，离心收集细胞。加入1ml的线粒体分离试剂，轻轻悬浮细胞，冰浴放置15分钟后将细胞悬液转移到适当大小的玻璃制细胞匀浆器中，匀浆30下。将匀浆结束后的悬液在1000r/min的条件下4℃，离心10min，离心管壁上的白色沉淀即为细胞核。将离心管中的上清液吸出，转移到新的离心管中，10000r/min的条件下，4℃离心10min，离心管壁上白色沉淀即为线粒体。分离沉淀后的上清即为细胞质。将每个样品分离所得的三部分均加入20ml浓硝酸，20ml h2o2及50ml的浓盐酸，高温消解至溶液澄清为止，纯净水定容至1ml，icp-ms测定每份样品中的pt元素的含量。lnd-ss-pt-tpp/ha-cd(lp/ha-cd)在线粒体中铂浓度要远大于顺铂，证明该纳米系统具有良好的线粒体靶向能力。
[0060]
表3 icp-ms测定细胞器中pt元素含量
[0061][0062]
实施例6：断裂机制验证
[0063]
(1)精密量取前药5mg加入配制好的ph 7.2-7.4的gsh 10mm的pbs缓冲溶液，并在37℃的恒温振动器中，在0.5h、1h、2h分别取样，通过ms法对样品进行分析。
[0064]
(2)精密量取适量的lnd-ss-pt-tpp于样品瓶a中，加入pbs缓冲溶液配制成1mm的药品标准溶液，精密量取二价铂荧光探针在样品瓶b中配制成1mm浓度标准溶液，样品瓶c中为与样品瓶a同等浓度的药品溶液加入gsh使gsh浓度为10mm，加入二价铂荧光探针。将样品瓶a、b、c置于37℃的恒温振动器中，4h避光反应后观察现象。
[0065]
实验结果显示lnd-ss-pt-tpp在gsh条件下可最终裂解为氯尼达明和二价铂，从而发挥细胞杀伤作用。
[0066]
实施例7：自组装纳米粒细胞摄取研究
[0067]
(1)合成香豆素-6标记的纳米粒：
[0068]
ha-cd10mg，溶于900μl超纯水。lnd-ss-pt-tpp0.5mg，充分溶于100μldmso中，加入香豆素-6(c-6)，在搅拌并超声条件下缓慢将药物溶液分次加入ha-cd溶液中，超声10min(超声功率250w，工作2s，间歇3s)。空白组为香豆素-6，其余方法相同。
[0069]
(2)细胞摄取实验：
[0070]
将a549细胞培养24h后，弃去培养液，分别加入新鲜培养液稀释的c-6和c-6标记纳米粒(c-6浓度相同)，置于co2培养箱中分别培养3h。培养结束后，吸去培养液，加入冰冷pbs(ph 7.4)终止细胞摄取，用pbs清洗三次，4％多聚甲醛固定细胞，用dapi对细胞核染色作为定位，在激光共聚焦显微镜下观察各细胞绿色荧光强度。
[0071]
结果显示香豆素-6标记lnd-ss-pt-tpp/ha-cd在细胞中荧光强度要强于香豆素-6，证明细胞对其摄取增加，证明该纳米系统良好的细胞靶向能力。

技术特征：
1.一种基于顺铂的小分子前体药物化合物，其特征在于，具有如下所示的结构式：其中m为1-6的整数；n为1-6的整数。2.权利要求1所述的基于顺铂的小分子前体药物化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：其中m为1-6的整数；n为1-6的整数(1)顺铂加入过氧化氢室温搅拌反应，过滤并冲洗，干燥得氯化二氨基二羟基铂(1)，(2)羧烷基三苯基溴化磷、加入edci和nhs溶解于乙腈中，室温搅拌得中间产物tpp-nhs，所述羧烷基三苯基溴化磷为(2-羧乙基)三苯基溴化磷、(3-羧丙基)三苯基溴化磷、(4-羧丁基)三苯基溴化磷或(5-羧基戊基)三苯基溴化磷中的一种或多种；(3)将tpp-nhs溶于无水dmso中，加入氯化二氨基二羟基铂(1)，反应72h然后除去dmso，得tpp-pt；(4)氯尼达明(2)在缩合剂作用下与含有二硫键的烷基二醇(3)发生酯化反应得到化合物(4)，然后与n,n
’‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯得活化酯(5)，该活化酯与tpp-pt酯化得最终化合物(lnd-ss-pt-tpp)；所述含有二硫键的烷基二醇为2，2
’‑
二硫二乙醇、二硫二甲醇、3，3
’‑
二硫二丙醇或4，4
’‑
二硫二丁醇中的一种或多种。3.一种小分子前药自组装纳米粒，其特征在于载药材料透明质酸与环糊精缩合形成的
透明质酸-环糊精(ha-cd)载药材料同权利要求1所述的基于顺铂的小分子前体药物化合物自主装形成的纳米粒。4.如权利要求3所述的小分子前药自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)ha-cd制备：将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)和n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(nhss)添加到透明质酸钠的pbs磷酸盐缓冲液中，室温搅拌30min；然后加入氨基取代的环糊精，在室温下反应24h，透析、冻干，得到ha-cd载药材料；(2)lnd-ss-pt-tpp/ha-cd载药纳米系统的制备方法：lnd-ss-pt-tpp溶解于有机溶剂中，在搅拌条件下缓慢将药物溶液加入ha-cd水溶液中，超声，透析除去有机溶剂，冻干得lnd-ss-pt-tpp/ha-cd载药纳米粒；所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)或二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。5.如权利要求1所述基于顺铂的小分子前体药物化合物或权利要求3所述小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。6.如权利要求1所述基于顺铂的小分子前体药物化合物或权利要求3所述小分子前药自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。

技术总结
本发明属于医药物技术领域，设计合成一种可克服顺铂耐药的顺铂前药，在此基础上将前药用透明质酸与环糊精构建成共轭的聚多糖分子进行包载制备了小分子前药自组装纳米药物传递系统，制备方法简便，稳定性好，实现了药物的高效包载和递送。该前药纳米系统可靶向肿瘤细胞CD44受体，结构中含有的三苯基磷基团靶向细胞线粒体，同时在肿瘤高GSH环境下二硫键发生断裂释放出Pt-TPP与LND，Pt-TPP被生物还原剂激活释放出顺铂，发挥其细胞毒作用。释放的LND通过抑制糖酵解协同顺铂杀伤肿瘤细胞的同时可克服细胞对顺铂耐药。本发明实现了药物对肿瘤细胞的特异性作用，提高药物抗肿瘤作用的同时克服肿瘤细胞对顺铂的耐药，使抗肿瘤效果得到明显提升，具有广阔的发展前景。具有广阔的发展前景。具有广阔的发展前景。


技术研发人员：路海滨 姜美旭 王凯 刘一霖
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/13