一种产蔗糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及一种产蔗糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和生物工程领域。


背景技术：

2.异麦芽酮糖(isomaltulose)，又称帕拉金糖，是由葡萄糖和果糖以α-1,6糖苷键连接而成的还原性二糖(6-o-α-d-吡喃葡糖基-d-果糖)，是蔗糖的同分异构体。异麦芽酮糖可以通过蔗糖异构酶催化蔗糖底物生成。异麦芽酮糖因其具有安全性好，口感纯正，防治龋齿，食用后不引起血糖显著升高，提神抗疲劳等多种功效，因而成为了研究热点。
3.蔗糖异构酶(ec 5.4.99.11)，英文名称为sucrose isomerase，又被称为异麦芽酮糖合成酶或海藻酮糖合成酶，可以催化蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，同时生成一定量的葡萄糖和果糖单糖。蔗糖异构酶主要来源是微生物，如红色精朊杆菌(p.rubrum)、普城沙雷氏杆菌(serratia plymuthica)、大黄欧文菌(erwinia rhapontici)、分散泛菌(pantoea dispersa)、肠杆菌属(enterobacter sp.)、克雷伯氏杆菌属(klebsiella sp.)、嗜中酸假单胞菌(pseudomonas mesoacidophila)以及放射性土壤杆菌(agrocbacterium radiobacter)等都可以产生蔗糖异构酶。此外还有一种昆虫(silverleaf whitefly)来源的蔗糖异构酶，该酶可以产生催化蔗糖只生成海藻酮糖。不同物种来源的蔗糖异构酶的酶分子结构、酶学性质、催化能力都有很大区别。其中，分散泛菌来源的蔗糖异构酶催化效率高，副产物少，因此本专利蔗糖异构酶取自分散泛菌。
4.目前所发现的蔗糖异构酶主要来源是野生微生物，这些微生物大都是一些植物致病菌，且蔗糖异构酶在这些微生物中表达量低，例如klebsiella sp.lx3生产蔗糖异构酶时，酶活只有15.12u
·
ml-1
，p.dispersa uq68j进行发酵培养基条件优化后生产蔗糖异构酶，其酶活最高为72u
·
ml-1
，较低的酶活限制了其进一步的工业化生产，因此异源表达蔗糖异构酶成为了研究热点。
5.目前不同来源的蔗糖异构酶已经成功的在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母、酿酒酵母等表达宿主中进行了重组表达。在大肠杆菌中表达蔗糖异构酶时，其酶活虽然可以达到较高水平，但是大肠杆菌是一种致病菌，会产生内毒素，这在很大程度上限制了大肠杆菌宿主重组表达的蔗糖异构酶在食品领域的应用。
6.枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母、酿酒酵母等宿主都是公认安全菌株(gras)，不含内毒素，无致病性，因此有许多学者尝试将蔗糖异构酶在这些宿主中进行了重组表达，但是蔗糖异构酶在这些宿主中表达时酶活普遍较低，例如将p.dispersa uq68j的蔗糖异构酶在解脂耶氏酵母中进行了重组表达时，其蔗糖异构酶酶活为7.43u
·
ml-1
；将来源于e.rhapontici nx-5的蔗糖异构酶在b.subtilis wb800中进行了重组表达，发酵优化后使用7.5l发酵罐产酶，酶活最高5.2u
·
ml-1
；将erwinia rhapontici nx-5的蔗糖异构酶在枯草芽孢杆菌168的孢子表面进行展示后，其酶活最高为7.2
±
0.23
×
10-2u·
ml-1
。
no.1所示的蔗糖异构酶进行酶法转化。
26.在一种实施方式中，所述方法是在加酶量为5～30u/g，温度为25～40℃，初始ph为4-8，底物蔗糖的浓度为100-700g/l的条件之下反应10小时。
27.在一种实施方式中，是在加酶量为20u/g，温度为30℃，初始ph为6.0，底物浓度为400g/l的条件下转化10小时。
28.本发明还提供所述方法在生产制备含异麦芽酮糖的产品中的应用。
29.有益效果：本发明将来源于pantoea dispersa的蔗糖异构酶成功表达到食品安全级微生物枯草芽孢杆菌中，构建了一种重组基因工程菌。以phy300plk为表达载体，以bacillus subtilis ws9为表达宿主，提供了一株高产蔗糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌。本发明菌株生产的蔗糖异构酶酶活最高可达862.86u/ml，是目前已知的在食品安全微生物中表达蔗糖异构酶的最高酶活。该重组蔗糖异构酶的最适ph为6，最适温度为30℃，在45℃下半衰期为68min。利用本发明的蔗糖异构酶按照20u/g的加酶量，以ph为6.0，浓度为400g/l的蔗糖为底物，在30℃下酶转化10-12小时，异麦芽酮糖含量可达90.62％，为异麦芽酮糖的工业化生产提供了参考。
附图说明
30.图1：重组表达质粒phy300plk-si的质粒图谱。
31.图2：纯化后的重组蔗糖异构酶和原始蔗糖异构酶发酵上清(摇瓶)的sds-page电泳图。
32.图3：蔗糖异构酶在不同温度下的酶活。
33.图4：蔗糖异构酶在不同ph下的酶活。
34.图5：蔗糖异构酶在45℃下的热稳定性；
35.图6：蔗糖异构酶在25℃下的ph稳定性
36.图7：加酶量对异麦芽酮糖转化率的影响。
37.图8：温度对异麦芽酮糖转化率的影响。
38.图9：初始ph对异麦芽酮糖转化率的影响。
39.图10：底物浓度对异麦芽酮糖转化率的影响。
具体实施方式
40.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
41.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
42.蔗糖异构酶酶活测定：取200μl经过一定倍数稀释后的酶液，加入到1.8ml的终浓度为200g/l的蔗糖溶液中。其中蔗糖用50mm ph为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液所溶解。在30℃下准确反应15分钟后，加入3ml的dns终止反应，并用沸水浴煮沸10min。在冰水中冷却至常温后，加入10ml的去离子水，在540nm波长下测定吸光度。并利用标准曲线换算成异麦芽酮糖含量。
43.蔗糖异构酶酶活单位定义：在上述条件下，1分钟生成1μmol异麦芽酮糖所需要的
酶量定义为一个酶活单位u。
44.异麦芽酮糖含量测定方法：
45.(1)样品制备：将酶转化结束后的反应液煮沸15-20min灭酶，然后12000rpm
·
min-1
离心3min沉淀变性蛋白，取反应上清液用去离子水稀释一定倍数后，用水相滤头过滤，制备液相样品。
46.(2)hplc法检测分析：
47.检测器：示差遮光检测器(rid)；
48.流动相：80％乙腈(体积比，溶剂为水)；
49.柱温：40℃；
50.进样量：10μl；
51.流速：0.8ml/min；
52.色谱柱：agilent公司，polaris 3 nh2(150
×
4.6mm)；
53.异麦芽酮糖转化率(％)＝反应液中异麦芽酮糖含量/反应液中蔗糖含量
×
100％。
54.实施例1：重组表达质粒phy300plk-si的构建
55.(1)在蔗糖异构酶基因的两端设计引物si-f和si-r(表1)，引物上同时带有20bp的同源臂序列；引物序列由苏州金唯智有限公司合成。
56.(2)设计一对引物z-f、z-r(表1)，用以将穿梭质粒phy300plk质粒线性化，引物序列由苏州金唯智有限公司合成。
57.(3)以重组质粒pet-24a(+)-si为模板，用引物si-f、si-r把蔗糖异构酶基因从载体上扩增下来；以phy300plk质粒为模板，用引物z-f、z-r将其线性化；将蔗糖异构酶基因的pcr产物和线性化载体的pcr产物进行胶回收。pcr反应体系见表2。
58.(4)用一步克隆连接试剂盒连接si基因和线性化载体的胶回收产物，使si基因位于双启动子hpaii-amyq’(seq id no.3所示)的下游，一步克隆连接体系见表3，将连接体系放置于37℃水浴锅中30min，立刻置于冰上冷却。然后转化e.coli jm109，转化步骤为：将加入质粒的感受态置于冰上冰浴30min，然后准确热激90s，冰浴5min后，加入1ml无抗小lb，在37℃，200rpm摇床中复苏1h，涂到含有氨苄抗性的平板上，在37℃培养箱中过夜培养，第二天挑取平板上的转化子进行酶切并测序验证，得到正确的重组表达质粒phy300plk-si(如图1所示)。
59.表1引物序列
60.引物名称引物序列si-fctgcgagtgctgaagccatggcaagcccgctgaccaaaccgagsi-rgtttttttattaccaagcttttagtggtgatgatggtgatgattcz-faagcttggtaataaaaaaacacctccz-rtcttgacactccttatttgattttttg
61.表2 pcr反应体系
62.成分用量2
×
phanta max master mix25μl模板dna1μl上游引物(10μm)1μl
下游引物(10μm)1μlddh2o将pcr体系补足至50μl
63.pcr反应程序如下：94℃预变性4min；98℃10s，55℃30s，72℃延伸相应时间，进行30个循环；72℃延伸10min，降温至10℃。
64.表3一步克隆试剂盒连接体系
65.连接成分用量线性化载体50～200ng插入片段20～200ng5
×
ce ii buffer4μlexnase ii2μlddh2o将体系补足20μl
66.最适克隆载体使用量＝[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；
[0067]
最适插入片段使用量＝[0.04
×
插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)。
[0068]
实施例2：重组质粒phy300plk-si转化至宿主bacillus subtilis ws9
[0069]
(1)从-80℃冰箱取出表达宿主b.subtilis ws9菌株的甘油管，划线于lb无抗平板上，于37℃倒置培养9-11小时(lb固体培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，20g/l琼脂粉)，然后从无抗板上挑取单菌落到无抗lb液体培养基中，37℃，200rpm下培养10.5小时。其中，该实施例所用表达宿主bacillus subtilis ws9来源于张康博士2018年的学位论文《枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究》。
[0070]
(2)从步骤(1)获得的培养液中吸取2.5ml的菌液转接到40ml的生长培养基中于37℃下培养4-5小时；生长培养基是含有90g/l山梨醇的lb液体培养基。
[0071]
(3)将生长培养基中的菌液置于冰上预冷10min到20min，然后在5000rpm，4℃的条件下离心5min，收集菌体。
[0072]
(4)将步骤(3)中离心收集的感受态菌体置于冰上，在超净工作台中用15-20ml的预冷的电转培养基缓慢吹吸混匀，在5000rpm，4℃的条件下离心5分钟，去掉上清，保留菌体。电转培养基配方为：山梨醇0.5m，甘露醇0.5m，甘油10％。
[0073]
(5)重复步骤(4)三次。
[0074]
(6)将步骤(5)中的感受态菌体用1ml的电转培养基缓慢冲悬，然后分装到无菌并且预冷的1.5ml的ep管中，每管分装200μl，将制好的感受态细胞置于-80℃中保存。
[0075]
(7)将步骤(6)验证正确的重组质粒phy300plk-si取出10μl加入到制备好的bacillus subtilis ws9感受态细胞中，然后置于冰上放置20min，然后将感受态细胞加入预冷的电转杯中(2mm)，在2.4kv下电击一次。电击后立马加入1ml已预冷的rm培养基，用移液枪缓慢吹吸混匀，然后将菌液转移到1.5ml ep管中，并于37℃，200rpm下复苏3-5h。rm培养基配方：70g/l甘露醇，90g/l山梨醇，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉。
[0076]
(8)将步骤(7)复苏后的感受态涂到含有四环素抗性的平板上，于37℃培养箱中倒置培养10-12小时，挑取转化子到lb液体培养基中进行酶切验证，验证正确的转化子即为产蔗糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌。
[0077]
实施例3摇瓶发酵优化确定最适发酵条件
[0078]
(1)氮源优化：
[0079]
将前面构建得到的重组工程菌phy300plk-si为发酵优化的出发菌株，以tb培养基作为对照培养基，选择安琪酵母粉、牛肉粉、安琪蛋白胨、棉籽粉、玉米浆、骨蛋白胨(山东斯凯尔公司)、安琪玉米浆(安琪公司)、工业蛋白胨(上海缘肽)、beef extract(neogen)、西王豆粨粉(西王公司)、脑心浸肉汤(海博生物技术有限公司)、水解酪蛋白(sangon biotech)、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏等氮源。以36g/l的浓度将上述氮源分别替换tb培养基中的酵母粉和蛋白胨，进行氮源种类优化。
[0080]
发酵条件为：将实施例2构建的重组枯草芽孢杆菌分别以5％的接种量接种至含上述不同种类氮源的发酵培养基中，同时加入1/1000体积的四环素，在37℃培养2小时后，转到33℃、200rpm/min的条件下培养48h，检测各发酵液中的产酶量。选择其中效果较好的棉籽粉(55.15u/ml)、安琪酵母粉(37.31u/ml)、玉米浆(35.55u/ml)进一步进行氮源浓度优化。
[0081]
分别控制氮源浓度为20、28、36、44g/l，按照上述相同条件进行发酵，结果显示，当棉籽粉浓度为36g/l时，摇瓶酶活可达56.76u/ml；玉米浆浓度为20g/l时，酶活可达49.8u/ml；安琪酵母粉浓度为36g/l时，酶活37.86u/ml。
[0082]
(2)碳源优化
[0083]
在tb培养基的基础上，用36g/l的棉籽粉替换tb培养基中的酵母粉和蛋白胨，并选择葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、玉米糊精、麦芽糊精、糊精等碳源进行优化，分别将上述碳源以5g/l的浓度代替培养基中的甘油进行碳源种类优化。
[0084]
发酵条件为：将实施例2构建的重组枯草芽孢杆菌分别以5％的接种量接种至含上述不同碳源的发酵培养基中，同时加入1/1000体积的四环素，在37℃培养2小时后，转到33℃、200rpm/min的条件下培养48h，检测各发酵液中的产酶量。选择效果最好的甘油(55.36u/ml)和效果次之的蔗糖(42.59u/ml)，进一步进行碳源浓度优化。
[0085]
分别控制碳源浓度为5、10、15、20、25、30g/l，结果显示，当蔗糖浓度为10g/l时，摇瓶酶活可达为71.54u/ml；当甘油浓度为10g/l时，蔗糖异构酶的酶活为67.12u/ml。
[0086]
优化后的重组菌最适摇瓶发酵条件为36g/l棉籽粉，k2hpo4·
3h2o 16.4g/l，kh2po
4 2.3g/l，蔗糖10g/l，在初始ph为7.0，其中发酵培养基转接量为5％，同时加入1/1000体积的四环素，转速为200rpm/min，发酵温度37℃培养2小时后，转到33℃、200rpm/min的条件下培养48h。将下摇瓶的发酵菌体8000rpm，4℃离心20min，得到的上清液即为蔗糖异构酶的粗酶液，酶活最高为71.54u/ml，重组菌在此条件下的产酶是初始tb培养基的8倍。
[0087]
实施例4：重组枯草芽孢杆菌在发酵罐水平产蔗糖异构酶
[0088]
将实施例2构建的重组菌株在3l发酵罐中进行高密度培养，将菌株接种在lb液体培养基中，于37℃，200rpm/min下培养10-12小时，获得上罐种子液；将100ml种子液加入到900ml的基础培养基中，控制发酵温度为33℃，发酵ph为7.0左右,发酵过程溶氧控制在30％，溶氧反弹时加入补料培养基。
[0089]
基础培养基成分为：玉米浆(维塔)20g
·
l-1
，安琪酵母粉36g
·
l-1
，(nh4)2h-citrate 1g
·
l-1
，(nh4)2so
4 2.68g
·
l-1
，kh2po
4 14.6g
·
l-1
，nah2po4·
h2o 4g
·
l-1
，mgso4·
7h2o 1g
·
l-1
，微量元素液3ml
·
l-1
，甘油10g
·
l-1
。
[0090]
微量元素液：0.5g
·
l-1
cacl2，0.18g
·
l-1
znso4·
7h2o，0.1g
·
l-1
mnso4
·
h2o，
10.05g
·
l-1
na
2-edta，8.35g
·
l-1
fecl3，0.16g
·
l-1
cuso4
·
5h2o，0.18g
·
l-1
cocl2·
6h2o。
[0091]
补料培养基：甘油250g
·
l-1
，麦芽糖250g
·
l-1
，mgso4·
7h2o 7.89g
·
l-1
，玉米浆23g
·
l-1
，安琪酵母粉41g
·
l-1
，微量元素液40ml
·
l-1
。
[0092]
结果显示，重组菌在培养80h时，重组蔗糖异构酶的酶活为862.86u/ml，是目前已知的在食品安全微生物中生产蔗糖异构酶的最高酶活。
[0093]
实施例5：重组蔗糖异构酶酶学性质的测定
[0094]
设定最高酶活为100％，其余酶活与最高酶活的比值即为相对酶活。
[0095]
(1)最适ph的测定
[0096]
重组si的最适ph：配制50mm，ph值分别为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，用不同ph的缓冲液配制200g/l的蔗糖溶液，并用上述不同ph的缓冲液将si稀释一定倍数后在30℃测定酶活，并计算各个ph下的相对酶活。在ph为4.0-8.0的条件下，其相对酶活分别为10.51％、46.46％、85.20％、100％、93.81％、86.95％、60.72％，表明，重组蔗糖异构酶的最适ph为6.0。
[0097]
(2)最适温度的测定
[0098]
用ph为6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制200g/l的蔗糖底物，将底物分别放在20℃，25℃,30℃,35℃,40℃,45℃的水浴锅中温浴10min，然后将酶液加入不同温度的底物溶液中测定酶活，并计算各个温度下的相对酶活。在20-45℃的条件下，其相对酶活分别为73.12％、87.36％、100％、92.15％、89.47％、68.51％，以上结果表明，重组蔗糖异构酶的最适温度为30℃。
[0099]
(3)温度稳定性的测定
[0100]
将重组si置于45℃的水浴锅中，20min取一次样，并测定其酶活，研究si的温度稳定性并确定其半衰期。半衰期为酶活力降为最高酶活一半时所用时间，并计算每个取样点下的相对酶活。在0min-140min的时间点内，其相对酶活分别为100％、86.56％、76.93％、60.53％、37.56％、31.72％、24.95％、14.39％。经计算，重组蔗糖异构酶在45℃的的半衰期为68min。
[0101]
(4)ph稳定性的测定
[0102]
用50mm，ph值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液将si酶液稀释合适的倍数后置于25℃水浴锅中，放置24h后测定其剩余酶活，并计算各个ph下的相对酶活。在ph为4.0-8.0的条件下，其相对酶活分别为16.36％、88.16％、100％、97.73％、81.37％。表明，该重组蔗糖异构酶在ph为6.0的条件下稳定性最好。
[0103]
实施例6：重组蔗糖异构酶在制备异麦芽酮糖中的应用
[0104]
以ph 6、200g/l的蔗糖溶液为底物，以实施例获得的重组蔗糖异构酶按加酶量(以酶和底物的比例计算)分别是5u
·
g-1
、10u
·
g-1
、15u
·
g-1
、20u
·
g-1
、25u
·
g-1
、30u
·
g-1
，在30℃、150rpm
·
min-1
的水浴摇床中转化10小时，用hplc法检测异麦芽酮糖含量，计算异麦芽酮糖转化率。结果显示，在5-30下u
·
g-1
的加酶量下，其转化率分别为59.19％、72.05％、72.10％、82.84％、80.05％、78.66％。
[0105]
以ph 6、200g/l的蔗糖溶液为底物，加酶量为20u
·
g-1
，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、150rpm
·
min-1
的水浴摇床中转化10小时，用hplc法检测异麦芽酮糖含量，计算异麦芽酮糖转化率。结果显示，在20-45℃下，其转化率分别为81.17％、81.88％、
83.17％、80.33％、74.55％、64.45％。
[0106]
用ph为4、5、5.5、6、6.5、7、8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制终浓度为200g/l的蔗糖溶液，加酶量为20u
·
g-1
，在30℃、150rpm
·
min-1
的水浴摇床中转化10小时，用hplc法检测异麦芽酮糖含量，计算异麦芽酮糖转化率。结果显示，在ph为4.0-8.0的条件下，转化率分别为3.26％、77.56％、80.76％、82.96％、81.96％、80.35％、68.13％。
[0107]
以ph为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制浓度为100g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、600g/l、700g/l的蔗糖溶液，加酶量为20u
·
g-1
，在30℃、150rpm
·
min-1
的水浴摇床中转化10小时，用hplc法检测异麦芽酮糖含量，计算异麦芽酮糖转化率。结果显示，在100-700g/l的底物浓度下，其转化率分别为69.99％、82.78％、86.02％、90.61％、88.70％、88.69％、89.20％。
[0108]
综合以上结果，在温度为30℃、初始ph为6.0、加酶量为20u
·
g-1
，蔗糖浓度为400g/l时，异麦芽酮糖得率可达90.62％。
[0109]
对比例：
[0110]
将p.dispersa uq68j的蔗糖异构酶在解脂耶氏酵母中进行重组表达
(1)
，其蔗糖异构酶酶活只有7.43u
·
ml-1
；将来源于e.rhapontici nx-5的蔗糖异构酶在b.subtilis wb800中进行了重组表达
(2)
，其酶活最高为5.2u
·
ml-1
；将erwinia rhapontici nx-5的蔗糖异构酶在枯草芽孢杆菌168的孢子表面进行展示后
(3)
，其酶活最高为7.2
±
0.23
×
10-2u·
ml-1
。
[0111]
参考文献：
[0112]
(1)high and efficient isomaltulose production using an engineered yarrowia lipolytica strain.
[0113]
(2)green synthe-sis of isomaltulose from cane molasses by bacillus subtilis wb800-pha01-pali in a biologic membrane reactor.
[0114]
(3)economical production of isomaltulose from agricultural residues in a system with sucrose isomerase displayed on bacillus subtilis spores.
[0115]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一株产蔗糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以phy300plk为表达载体，表达seq id no.1所示的蔗糖异构酶。2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以bacillus subtilis ws9为宿主。3.一种生产蔗糖异构酶的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵培养基中，于35～37℃培养1～2h，再于32～34℃培养至少24h。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以棉籽粉、玉米浆或安琪酵母粉为氮源。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以甘油或蔗糖为碳源。6.根据权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，所述发酵过程还进行补料。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法控制发酵过程中ph稳定在7.0
±
0.2，控制溶氧维持30
±
0.5％，当出现溶氧反弹时，加入补料培养基。8.一种异麦芽酮糖制备方法，其特征在于，以蔗糖为底物，应用seq id no.1所示的蔗糖异构酶进行酶法转化。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是在加酶量为5～30u/g，温度为25～40℃，初始ph为4-8，底物蔗糖的浓度为100-700g/l的条件之下反应至少10小时。10.权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，或权利要求3～9任一所述方法在制备含异麦芽酮糖的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种产蔗糖异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和生物工程领域。本发明将Pantoea dispersa来源的蔗糖异构酶基因克隆后转入枯草芽孢杆菌进行表达生产蔗糖异构酶，并对重组菌株进行了发酵培养基和发酵条件的优化，使重组菌株在3L发酵罐中蔗糖异构酶产量可达862.86U/mL，是目前已知的食品安全微生物生产蔗糖异构酶的最高产酶水平。利用本发明制备的蔗糖异构酶生产异麦芽酮糖，当pH为6.0，底物为400g


技术研发人员：吴敬 张康 赵文冲
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/7/13