一种毛竹基因功能验证方法

et al.,2004,becker and lange,2010)，见图1。
5.现如今应用于vigs技术的病毒载体主要可以分为三大类，rna病毒载体、dna病毒载体和卫星病毒载体。rna病毒是最早投入使用的病毒载体，具有分子量小，侵染效率高的特点。如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)，马铃薯病毒x(potato virus x,pvx)等(kumagai et al.,1995,senthil-kumar and mysore,2011,bruun-rasmussen et al.,2007)。dna病毒用于vigs，具有载体构建简便、无需体外转录及操作难度低等优点，但其结构体积大，在植物体内移动受限制。如番茄金色花叶病毒(tomato goldenmosaic virus,tgmv)，非洲木薯花叶病毒(african cassavamosaic virus,acmv)，甘蓝曲叶病毒(cabbage leaf curl virus,cal-cuv)等(kjemtrup et al.,1998,fofana et al.,2004,mandal et al.,2001)。卫星病毒由伴随着病毒出现的卫星病毒改造而来，自己本身不会引起植物任何的病症，很大程度上避免了载体本身对于沉默表型的干扰。同时，由于具有基因组小，在植物中复制水平高等特点，成为一种优良的候选vigs载体。如由烟草曲茎病毒沉默载体(tobacco curly shoot virus,tbcsv)，中国番茄黄化曲叶病毒沉默载体(tomato yellow leaf curl china virus,tylccnv)等(gossel
éꢀ
et al.,2002,tao and zhou,2004,cai et al.,2007)。
6.理论来说导致靶基因沉默的最小插入片段是23个核苷酸(burch-smith et al.,2004)，然而，实际上23个核苷酸长度的片段通常不能有效实现靶基因的沉默。插入片段太短沉默效率较低，片段太长又容易丢失，究竟插入多长目的基因片段沉默的效率最高(bartel,2004)。经过实验和探索，插入片段的长度在200～500bp时沉默效率最高(kirigia et al.,2014,liu and page,2008,burch-smith et al.,2006)。其次，插入的基因片段的方向也是影响基因沉默的效果，与反向插入相比，正向插入诱导的沉默效率更高(liu and page,2008)。但是，这不适用于所有的病毒载体，例如，tylccnv dnaβ载体的基因沉默效率与插入片段的方向无关(ju et al.,2017)。
7.此外依据沉默效率和侵染植物的类别、年龄与组织，需要采取不同的侵染接种方法来提高沉默效率。主要有以下接种方法，(1)叶背注射法；(2)叶渗透法；(3)叶面直接喷洒法；(4)根吸收法；(5)牙签刺伤法；(6)真空浸透法(ekengren et al.,2003,ding et al.,2018,liu et al.,2002,pacak et al.,2010,lu et al.,2003,faivre-rampant et al.,2004)。
8.1995年，kumagai等(kumagai et al.,1995)首次完成了基于烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,tmv)的vigs载体构建，当携带八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,pds)cdna片段的重组病毒侵染烟草后，接种叶片出现褪绿白化现象，并伴随着pds mrna水平的显著降低。该基因控制光合作用过程中类胡萝卜素的合成，由于pds基因的沉默叶片白化，其新生叶片也会出现光漂白现象，因此在vigs实验中常作指示基因(ding et al.,2018)。
9.vigs体系已经在很多的植物中被成功建立，最近研究的植物主要有禾本科(gramineae)(kang et al.,2013)、十字花科(cruciferae)(fridborg et al.,2013)、茄科(solanaceae)(tam et al.,2007)、豆科(leguminosae)(atwood et al.,2014)、菊科(compositae)(deng et al.,2012)、毛茛科(ranunculaceae)(di stilio et al.,2010)和罂粟科(papaveraceae)(wijekoon andfacchini,2012)等。
10.毛竹转基因技术研究尚在起步阶段，有效的转基因体系还未建立，一方面是因为毛竹组织培养和植株再生体系建立非常困难，ogita等通过毛竹笋诱导出愈伤组织，但在继代培养过程中易褐变(ogita,2005)，而李斯萱和岳晋军等通过毛竹种胚来构建毛竹再生体系存在种胚消毒困难、愈伤组织诱导率低、愈伤组织分化能力低等问题，同时在继代培养中也很容易褐变(李斯萱等,2021,岳晋军,2008)；另一方面由于毛竹开花和种子获取十分困难，模式植物中广泛应用的农杆菌介导法难以在毛竹中应用。现如今验证毛竹功能基因，大多通过构建表达载体利用农杆菌介导法转入拟南芥等模式植物中，在模式植物中异位表达来研究其基本功能，但是功能性外源基因的异位表达势必对细胞造成一定的影响，是否能准确验证基因的功能是未可知的。
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[0061]
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[0062]
岳晋军2008.毛竹再生体系构建的初步研究[d].中国林业科学研究院.


技术实现要素：

[0063]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种毛竹基因功能验证方法，能够准确验证获得毛竹基因的生物学功能，为深入研究毛竹生理代谢、生长发育、分子育种等提供有效手段。
[0064]
本发明提供了一种毛竹基因功能验证方法，包括以下步骤：
[0065]
将毛竹总rna进行逆转录后克隆目标基因，得到毛竹目标基因片段；
[0066]
将所述毛竹目标基因片段克隆至ptrv2病毒载体中，形成重组病毒载体；
[0067]
将所述重组病毒载体和ptrv1载体分别转染农杆菌，得到两种重组农杆菌；
[0068]
采用真空渗透法将含所述两种重组农杆菌的侵染液侵染毛竹，得到目标基因沉默的毛竹；
[0069]
观察所述目标基因沉默的毛竹的生长发育或生理代谢的变化，得到目标基因的功能。
[0070]
优选的，所述侵染的时间为4～6min。
[0071]
优选的，所述侵染时，所述两种重组农杆菌的od
600
值均为0.8～1。
[0072]
优选的，所述侵染液中两种重组农杆菌的体积比为(0.8～1)：(0.8～1)。
[0073]
优选的，所述侵染时，含所述两种重组农杆菌的侵染液的溶剂为侵染缓冲液；
[0074]
所述侵染缓冲液为含以下成分的水溶液：10mmol/l 2-吗啉乙磺酸、10mmol/lmgcl2和200μmol/l乙酰丁香酮，ph值5.6。
[0075]
优选的，所述侵染时，所述毛竹的苗龄包括毛竹子叶或长有1～2片真叶的毛竹。
[0076]
优选的，所述目标基因包括pepds基因。
[0077]
优选的，所述克隆目标基因用的引物包括核苷酸序列如seq id no：1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：2所示的反向引物。
[0078]
优选的，所述克隆目标基因的反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，37个循环；循环结束后72℃延伸10min。
[0079]
优选的，所述毛竹目标基因克隆至ptrv2病毒载体的多克隆位点为smai和bamhi。
[0080]
本发明提供了一种毛竹基因功能验证方法，将毛竹总rna经逆转录，克隆目标基因，将毛竹目标基因克隆至ptrv2病毒载体中，将重组病毒载体和ptrv1载体分别转染农杆菌，采用真空渗透法将含所述两种重组农杆菌的侵染液侵染毛竹，观察目标基因沉默的毛竹的生长发育或生理代谢的变化，得到目标基因的功能。本发明通过构建毛竹vigs体系，再利用真空渗透法将vigs体系侵染毛竹，得到侵染成功的阳性毛竹苗。本发明采用vigs技术进行反向遗传学基因功能鉴定，与基因敲除、反义抑制等传统的基因功能的研究方法相比，具有无需转化体系、无需筛选突变体、无需建立无菌体系以及无需克隆目的基因全长等，有利于了解毛竹的地下茎形成、初生增粗生长、快速高生长、长开花周期等复杂生长发育调控过程，为相关功能基因的验证提供技术支持，同时为深入研究毛竹生理代谢、生长发育、分子育种等提供理论基础。
[0081]
进一步的，本发明具体限定了侵染方法为真空侵染法，并具体限定了侵染时侵染参数，包括重组农杆菌的od值，毛竹苗龄以及侵染时间等，进一步提高侵染效率，进一步提高了目标基因的功能验证的准确性。
附图说明
[0082]
图1为病毒诱导基因沉默机制示意图；
[0083]
图2为本发明毛竹基因功能验证方法技术路线图；
[0084]
图3为本发明毛竹基因功能验证结果，其中a为正常生长的毛竹植株；b为空载体侵染后的毛竹植株；c为ptrv2-pepds重组病毒载体和ptrv1载体侵染后的毛竹；
[0085]
图4为本发明中不同处理组毛竹植株中qpcr检测结果。
具体实施方式
[0086]
本发明提供了一种毛竹基因功能验证方法，包括以下步骤：
[0087]
将毛竹总rna经逆转录，克隆目标基因，得到毛竹目标基因片段；
[0088]
将所述毛竹目标基因克隆至ptrv2病毒载体中，形成重组病毒载体；
[0089]
将所述重组病毒载体和ptrv1载体分别转染农杆菌，得到两种重组农杆菌；
[0090]
采用真空渗透法将含所述两种重组农杆菌的侵染液侵染毛竹，得到目标基因沉默的毛竹；
[0091]
观察所述目标基因沉默的毛竹的生长发育或生理代谢的变化，得到目标基因的功能。
[0092]
本发明将毛竹总rna经逆转录，克隆目标基因，得到毛竹目标基因片段。
[0093]
本发明对毛竹总rna的提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的毛竹总rna的方法即可。在本发明实施例中，采用植物总rna试剂盒提取毛竹总rna。
[0094]
本发明对所述逆转录的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的逆转录的方法即可。在本发明实施例中，所述逆转录采用逆转录试剂盒完成。
[0095]
在本发明中，所述目标基因依据研究者感兴趣的基因而定。在本发明实施例中，以pepds基因为例加以说明基因功能验证的方法。所述克隆目标基因用的引物包括核苷酸序列如seq id no：1(aggaaaagcatggttccaaaat)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：2(tgaaaagaaggtggtcatatgt)所示的反向引物。所述克隆目标基因的反应程序优选为94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，37个循环；72℃延伸10min。
[0096]
在本发明中，得到目标基因克隆片段后，优选进行纯化。所述纯化的方法优选采用纯化试剂盒完成。
[0097]
纯化结束后，本发明将纯化后的毛竹目标基因克隆至ptrv2病毒载体中，形成重组病毒载体。
[0098]
在本发明中，所述毛竹目标基因克隆至ptrv2病毒载体的多克隆位点优选为smai和bamhi。所述ptrv1和ptrv2病毒载体的来源为本领域所熟知的ptrv1和ptrv2病毒载体即可。本发明实施例中，所述ptrv1和ptrv2病毒载体的原始来源为西北农林科技大学张睿教授惠赠。所述克隆的方法优选为预先用限制性内切酶酶切ptrv2病毒载体和目标基因片段，形成线性载体和酶切后的目标基因片段，然后再进行连接和筛选，得到重组病毒载体。本发明对所述酶切、连接和筛选的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切、连接和筛选的方法即可。
[0099]
得到重组病毒载体后，本发明将所述重组病毒载体和ptrv1载体分别转染农杆菌，得到两种重组农杆菌。
[0100]
在本发明中，所述侵染的时间优选为4～6min，更优选为5min。实验结果表明，侵染的时间是影响侵染效率的因素，过高(10min)或过低(1min)的侵染时间都不利于提高侵染效率。
[0101]
在本发明中，所述侵染时，所述两种重组农杆菌的od
600
值均优选为0.8～1，更优选为1。所述侵染液中两种重组农杆菌的体积比优选为(0.8～1)：(0.8～1)，更优选为1:1。本
发明实验证实，过高(od
600
值为2)或过低(od
600
值为0.5)的重组农杆菌的od
600
值都不利于提高侵染效率。
[0102]
在本发明中，所述侵染时，含所述两种重组农杆菌的侵染液的溶剂优选为侵染缓冲液。所述侵染缓冲液优选为含以下成分的水溶液：10mmol/l 2-吗啉乙磺酸、10mmol/lmgcl2和200μmol/l乙酰丁香酮，ph值5.6。
[0103]
在本发明中，所述侵染时，所述毛竹的苗龄优选包括毛竹子叶或长有1～2片真叶的毛竹。实验结果表明，胚根作为毛竹侵染部位，侵染效率不及子叶和2片真叶的毛竹。
[0104]
在本发明中，利用真空渗透法将ptrv2-pepds病毒载体渗入毛竹体内后，这些含有pepds片段的病毒载体在毛竹体内大量复制，在rna聚合酶的作用下pepds基因片段合成大量的双链rna，双链rna在dicer酶的催化下形成短干扰rna，rna诱导基因沉默复合物(rna-induced silencing complex，risc)和短干扰rna反义链共同识别毛竹中pepds基因的mrna，使pepds基因的mrna发生特异性降解，从而使得pepds基因沉默。
[0105]
在本发明中，所述真空侵染法侵染时，真空度优选为-80kpa～-100kpa，更优选为-80kpa。侵染后，将毛竹转移至基质中进行定植生长。所述基质优选为营养土。生长的环境温优选为24～28℃，更优选为26℃，相对湿度80％，光照周期优选为16h/8h(光/暗)，定期浇水保持土壤潮湿。
[0106]
在本发明中，pepds基因沉默后的毛竹表型出现叶片白色条纹。
[0107]
下面结合实施例对本发明提供的一种毛竹基因功能验证方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0108]
实施例1
[0109]
一种毛竹基因功能验证方法
[0110]
1.1以cdna为模板进行pcr扩增
[0111]
1.1.1反转录获得cdna
[0112]
采用植物总rna提取试剂盒提取毛竹，得到毛竹总rna。在无rna酶污染的pcr管中加入1μl的random引物(10μg/ml)，加入rna 70ng，反转录酶10μl，酶混合物1μl，gdna去除酶1μl，并加入适量体积的ddh2o补齐至20μl。在42℃孵育30min；85℃加热5s，失活反转录酶和gdna去除酶。获得的cdna在-20℃条件下储存。
[0113]
1.1.2pcr扩增体系的建立
[0114]
pcr反应体系：10μl的2
×
easytaq pcr supermix酶，正反向引物各1μl，1μl的模板cdna，7μl ddh2o。
[0115]
pepds_f：aggaaaagcatggttccaaaat(seq id no：1)；
[0116]
pepds_r：tgaaaagaaggtggtcatatgt(seq id no：2)。
[0117]
反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，37个循环；循环结束后72℃延伸10min。
[0118]
1.2纯化
[0119]
取100μlpcr产物，加入500μl的溶液bb(5倍pcr产物体系)，混匀后加入离心柱中，10000
×
g离心1min，弃去废液。加入650μl溶液wb，10000
×
g离心1min，弃去废液。10000
×
g离心2min，彻底去除残留的wb。
[0120]
将离心柱置于一干净的离心管中。为提高纯度产量，选择60～70℃预热去离子水，
室温下静置1min后，10000
×
g离心1min，在柱的中央加入30μl eb，洗脱dna。洗脱出的dna于-20℃保存。
[0121]
1.3酶切酶连
[0122]
1.3.1建立酶切反应体系
[0123]
在0.5ml离心管中加入10倍缓冲液5μl和1μg的质粒dna(p-trv2)或pcr产物。再加入正反引物携带的限制性内切酶(单酶切bamhi，酶切位点为ggatcc)各1μl，加入双蒸水将体系补至50μl。
[0124]
37℃反应2～3h，切割时间不宜过长。取5μl的酶切产物，加1μl的6倍上样缓冲液，并以未酶切的环状trv2载体和pcr产物为对照，选用15kb的dna相对分子质量标记，1％的琼脂糖凝胶电泳分析，检测质粒是否酶切完全。
[0125]
1.4连接转化
[0126]
利用t4连接酶进行连接反应
[0127]
按照下列比例建立10μl的连接体系：10倍t4dna连接酶缓冲液1μl，目的基因片段7μl，酶切的线性质粒1μl，t4 dna连接酶1μl。16℃连接4h或4℃过夜，连接产物用于后续的转化实验。
[0128]
1.4.2转化
[0129]
加连接产物于50μltrans1-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min。加入250μl lb培养基，200r/min，37℃培养1h。
[0130]
在1500
×
g离心1min，弃掉部分上清，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜。
[0131]
1.5菌落pcr鉴定重组子
[0132]
挑取单菌落至加入10μl lb培养液的离心管中，挑取菌落后涡旋混合。取1μl混合液做pcr反应模板，加入10μl混合酶和各1μl的正反引物，并加入适量体积的ddh2o补齐至20μl。
[0133]
pcr反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。
[0134]
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以ptrv2空载为模板进行pcr作为对照。
[0135]
1.6提取质粒
[0136]
1.6.1提取质粒
[0137]
取20ml菌液加入离心管中，12000r/min离心1min，吸除上清，得到菌体沉淀。向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl含有rnasea的p1溶液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
[0138]
向离心管中加入500μl溶液p2，温和的上下翻转6～8次使菌体充分裂解。向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。12000r/min离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。如上清中还有微小沉淀或絮状沉淀未聚集底部，可再次离心后取上清。
[0139]
1.6.2柱平衡
[0140]
向吸附柱cp4中加入500μl的平衡液bl，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将离心管中的上清液分次加入吸附柱cp4中。12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。
[0141]
1.6.3漂洗
[0142]
向吸附柱cp4中加入600μl含有无水乙醇的漂洗液pw，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。
[0143]
重复上一步操作步骤。
[0144]
倒掉收集管中的废液后，将吸附柱cp4放入收集管中，12000r/min离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp4置于一个干净的离心管中，选用ddh2o做洗脱液，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl ddh2o，室温放置5min，12000r/min离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，去除吸附柱cp4。
[0145]
1.7农杆菌转化态的制备
[0146]
1.7.1冻融法转化
[0147]
从-80℃冰箱将农杆菌gv3101感受态细胞置于冰上融化，取100μl感受态细胞，加入10μl质粒dna(ptrv1、ptrv2、重组质粒ptrv2-pepds)，拨打混匀。于冰上静置5min，液氮速冻5min，28℃水浴5min，冰浴5min。
[0148]
1.7.2农杆菌转化子的培养
[0149]
加入700μl无抗生素的lb培养基，28℃振荡2～3h，12000r/min离心30s，弃上清液
[0150]
加入200μl无抗生素lb液体培养基悬浮细胞，涂布于含有相应浓度kan，rif和gen的lb固体培养基平板上，28℃培养2d，观察菌落生长情况。
[0151]
1.8毛竹侵染液配置
[0152]
1.8.1第一次摇菌
[0153]
从平板上用接种环挑取农杆菌单菌落，接种于1ml含有相应抗生素的lb培养液(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml庆大霉素，50μg/ml利福平)的2ml离心管中。28℃，220r/min摇床中培养36h。
[0154]
1.8.2第二次摇菌
[0155]
用移液器吸取的1ml菌液，移接至加入了19ml诱导lb液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml庆大霉素，50μg/ml利福平，10mmol/l吗啉乙磺酸，20μmol/l乙酰丁香酮)的50ml锥形瓶中。28℃，220r/min摇床中培养12h。
[0156]
1.8.3配置侵染液
[0157]
12000r/min，1min离心收集菌液，弃上清液。加入2ml侵染缓冲液(10mmol/l吗啉乙磺酸，10mmol/l mgcl2，200μmol/l乙酰丁香酮，ph 5.6)重悬菌体，得到重悬液。用缓冲液将重悬液稀释2倍后测量od
600
吸光值。计算需再加入侵染缓冲液的体积，以调节侵染菌液至终浓度od
600
为1.0。
[0158]
将含有trv1载体和含有相应ptrv2，ptrv2-pds载体的农杆菌，分别以1/1的比例混匀后，避光静置2～4h，得到侵染液，即可进行侵染。
[0159]
1.9毛竹真叶真空渗透侵染及表型观察
[0160]
1.9.1幼苗的真空渗透侵染
[0161]
将配置好的侵染液分装在250ml烧杯中。
[0162]
松动土壤，将含有1～2片真叶的幼苗轻轻拔出，不要伤到根系，洗掉根部残土，将幼苗整株侵染液中。根据容器及侵染液量放入适量植株，植株需完全浸入侵染液中。
[0163]
将带有幼苗和侵染液的烧杯放置在真空干燥器中，连接干燥器和真空泵，真空泵
上设置最大相对真空度在-80kpa左右。抽真空并保持2min，然后迅速拧开放气阀放入空气，释放真空度完成侵染过程。将侵染过的幼苗定植在营养土中，定植时不要伤到根系，将根部压实。
[0164]
1.9.2pds沉默表型观察
[0165]
侵染后的毛竹幼苗定植在装满营养土的容器中，放在人工气候室生长，温度32℃，相对湿度80％，提供16h/8h光暗交替照明条件，定期浇水保持土壤潮湿。2～3周后，新长出的真叶即会出现pds基因沉默表型，叶片出现白化或白色条纹(见图3)。
[0166]
1.9.3pds基因沉默
[0167]
提取野生型、ptrv2和ptrv2-pds处理后的毛竹叶片rna，方法同1.1.1。根据毛竹pepds基因(ph02gene05482)，通过primer5.0设计qrt-pcr引物(pepds2_f：gcaggttgtgtgccagga，seq id no：3，pepds_2r：gtaacggtccactggggc，seq id no：4)。
[0168]
使用chamq universal sybr qpcr master mix(vazyme#q711)，设置qrt-pcr体系：2
×
chamq universal sybr qpcr master mix 10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，模板cdna 2μl，加入ddh2o至20μl，反应程序：stage i预变性95℃5min；stage ii循环反应95℃10s，60℃30s 40个循环；循环结束后stage iii熔解曲线95℃15s，60℃60s 95℃15s。
[0169]
用bio-rad cfx96进行pcr扩增，以毛竹tip41为内参基因(扩增引物为tip41_f：aaaatcattgtaggccattgtcg，seq id no:5；tip41_r：actaaattaagccagcgggagtg，seq id no:6)，三次生物学重复，使用2
‑△△
ct
法计算目的基因的相对表达量。
[0170]
qpcr结果见图4。结果表明，与野生型和ptrv2处理相比，ptrv2-pds处理中毛竹pepds基因(ph02gene05482)在叶片中的表达量显著下降，而野生型与ptrv2之间无明显差异，因此说明毛竹pepds基因被沉默。
[0171]
实施例2
[0172]
为了进一步验证目标基因的侵染效率，分别以重组病毒载体的od
600
值、真空条件下的侵染时间和毛竹苗龄作为变量因素(见表2)进行毛竹侵染实验，其他条件实施例1相同。侵染结束后将毛竹苗转移营养土中培养2～3周。采用真空渗透侵染方法检测转染效率。
[0173]
表2侵染效率正交实验表
[0174]
处理od
600
值时间(min)苗龄10.51胚根20.552真叶30.510子叶4112真叶515子叶6110胚根721子叶825胚根92102真叶
[0175]
表3侵染结果统计
[0176][0177][0178][0179]
结果显示，处理5条件(od
600
为1，侵染时间为5min)下侵染效率最高。
[0180]
对比例1
[0181]
本发明还开展了采用叶片注射法侵染毛竹。具体方法如下：
[0182]
1幼苗的叶片注射侵染
[0183]
将配置好的侵染液分装在250ml烧杯中。
[0184]
松动土壤，将含有1～2片真叶的幼苗轻轻拔出，不要伤到根系，洗掉根部残土。
[0185]
用1ml无菌注射器吸取适量侵染液，拔掉针头。将注射器贴近叶背面，同时用食指拖住叶子的正面，推动注射器将侵染液注射进叶片内，尽量做到一次注射侵染液浸满整个叶片，避免因多次注射对植物造成严重的伤害。将浸染的植株放置于暗处培养12～24h后转换为16h/8h光暗交替培养。
[0186]
采用上述实施例记载的rt-qpcr法检测侵染效果。
[0187]
结果显示，叶片注射，未得到阳性苗。
[0188]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种毛竹基因功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：将毛竹总rna进行逆转录后克隆目标基因，得到毛竹目标基因片段；将所述毛竹目标基因片段克隆至ptrv2病毒载体中，形成重组病毒载体；将所述重组病毒载体和ptrv1载体分别转染农杆菌，得到两种重组农杆菌；采用真空渗透法将含所述两种重组农杆菌的侵染液侵染毛竹，得到目标基因沉默的毛竹；观察所述目标基因沉默的毛竹的生长发育或生理代谢的变化，得到目标基因的功能。2.根据权利要求1所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述侵染的时间为4～6min。3.根据权利要求1所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述侵染时，所述两种重组农杆菌的od
600
值均为0.8～1。4.根据权利要求1所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述侵染液中两种重组农杆菌的体积比为(0.8～1)：(0.8～1)。5.根据权利要求1所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述侵染时，含所述两种重组农杆菌的侵染液的溶剂为侵染缓冲液；所述侵染缓冲液为含以下成分的水溶液：10mmol/l2-吗啉乙磺酸、10mmol/lmgcl2和200μmol/l乙酰丁香酮，ph值5.6。6.根据权利要求1所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述侵染时，所述毛竹的苗龄包括毛竹子叶或长有1～2片真叶的毛竹。7.根据权利要求1所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述目标基因包括pepds基因。8.根据权利要求7所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述克隆目标基因用的引物包括核苷酸序列如seq id no：1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：2所示的反向引物。9.根据权利要求7或8所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述克隆目标基因的反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，37个循环；72℃延伸10min。10.根据权利要求1～8中任意一项所述毛竹基因功能验证方法，其特征在于，所述毛竹目标基因克隆至ptrv2病毒载体的多克隆位点为smai和bamhi。

技术总结
本发明提供了一种毛竹基因功能验证方法，属于基因功能验证技术领域。本发明首先构建毛竹VIGS体系，再利用真空渗透侵染转入毛竹中，不仅实现目标基因的沉默而且避免了因异源表达对目标基因功能验证的不准确性。本发明的方法有利于了解毛竹的地下茎形成、初生增粗生长、快速高生长、长开花周期等复杂生长发育调控过程，为相关功能基因的验证提供技术支持，同时为深入研究毛竹生理代谢、生长发育、分子育种等提供理论基础。育种等提供理论基础。育种等提供理论基础。


技术研发人员：国春策 侯利涵 范亚坤 张文根 黄旭捷 周元杰
受保护的技术使用者：江西农业大学
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/7/13