一种靶向调控青蟹Ca的制作方法

一种靶向调控青蟹ca
2+-atp酶基因的dsrna引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物技术领域，特别涉及一种靶向调控青蟹ca
2+-atp酶基因的dsrna引物及其应用。


背景技术：

2.拟穴青蟹(scylla paramamosain)隶属于节肢动物门，甲壳动物亚门，软甲纲，十足目，青蟹属，是一种广泛分布于中国东南沿海，印度洋和西太平洋的具有重要经济价值的甲壳类物种，常出现在河口和内湾潮间带等水域。由于具有生长快、肉质鲜美、营养价值高等特点，拟穴青蟹已成为我国重要的海水蟹类养殖物种。2021年，青蟹产量达到15.2万吨，占我国海水养殖蟹类总产量的53.7％(中国渔业统计年鉴，2022年)。然而，产量无法满足日益增长的市场需求是目前青蟹产业发展的瓶颈之一。在沿海水产养殖空间日趋饱和的现状下，内陆盐碱地、低盐水域青蟹养殖具有很大的潜力来解决这一矛盾，有效拓展养殖空间。目前尚不清楚青蟹在低盐度水环境中的代谢反应，迫切需要系统研究以完善青蟹耐低盐养殖理论。
3.环境盐度的变化与水生甲壳类动物渗透调节能力息息相关。蟹类能够适应各种盐度的水生环境，主要是通过调节血淋巴渗透压来完成的。研究表明，na
+
/k
+-atp酶、瞬时电位蛋白受体等在低盐水中可以起到维持血淋巴离子平衡的重要作用，这些作用的发挥很多是与细胞中ca
2+
浓度的改变有关。目前，对青蟹盐度适应机制的研究主要集中在急性盐度胁迫。而关于青蟹中ca
2+-atp酶基因的mrna序列及通过其调控ca
2+
浓度参与渗透调节通路中的作用机制还未见报道。rna干扰(rnainterference，rnai)技术是一种特异性敲降同源mrna的有效工具和研究基因功能的有效方法。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向调控青蟹ca
2+-atp酶基因的dsrna引物及其应用，dsrna可以高效沉默青蟹ca
2+-atp酶基因，导致青蟹在低盐度水体中的存活率显著上升。
5.本发明提供一种dsrna引物，所述dsrna的正向引物的核苷酸序列为5'-ataagaatgcggccgccttttctttctgcttcatagggg-3'，如seq id.1所示，反向引物的核苷酸序列为5'-cccaagctttcagttcggacagacttggg-3'，如seq id.2所示。
6.本发明还提供一种上述的dsrna引物在青蟹低盐水体养殖中的应用，例如青蟹低盐度水体养殖推广和耐低盐新品种选育。
7.优选地，所述应用过程中含有所述引物的dsrna调控青蟹ca
2+-atp酶基因的表达。
8.优选地，所述应用过程中pcr反应体系为：10
×
反应缓冲液5μl，正向引物0.25μl，反向引物0.25μl，cdna模板0.5μl，taq聚合酶1.0μl，dd h2o补足50μl。
9.优选地，所述应用过程中青蟹仔蟹i期到ii期注射靶向ca
2+-atp酶基因的含有所述引物的dsrna，进一步优选青蟹仔蟹i期注射靶向ca
2+-atp酶基因的含有所述引物的dsrna。
本发明特定的注射时期，既具有良好的基因沉默效率，该时期的仔蟹能最大限度地减少dsrna注射量，节约注射成本。
10.优选地，所述dsrna的注射量为8～10μg/仔蟹。
11.优选地，所述低盐水体的盐度为4
‰‑6‰
。
12.本发明还提供一种dsrna，包括上述引物。
13.优选地，所述dsrna的核苷酸序列为cttttctttctgcttcataggggtggtgtttgctctcggcctctaccagagcatccccatacagaagatcttcaacatcgcggtgagtctggcggtggctgccatccccgaggggctgcccattgtggtgaccatgacgctgtgcctgggcatccgtcgcatggcgcagcgttcagctctggtcaagggactgcaaactgtggagacgctgggatgtgtcaccacggtctgctctgacaagactgggactctcaccaagaatgagatgacggtgaccaacattgtaacctctgagggggacgagtgttgcctcacgggagttgggtactcggccgacggacaggtggtgtttgagggcgggtactccgagctggctaacgaggcggtcaccaaactgctggagacaggtgctgtgtgtaacaatgctcagattgtgggtggccagctgctgggacaacctaccgacggggccattcttgctgctgccatcaagcacgggatctacaacgcagctgacaagtaccagaggatggaggaggttcccttcaagtcagagaccaagacgatgtcagtgaaggtgaagaacaagaagacaggtgaggtggagtggctggtgaagggtgcggtggaggtggtgctgcgttcctgcactcactaccagcagaacatgagtgtgctgcctctctcccaggagcgacacagacacattctctccattgcgctggaacactcccgccgcggcctccgagtgctctccatcgcccgcggcccaagtctgtccgaactga，如seq id.7所示。
14.本发明运用rnai技术，向青蟹仔蟹i期注射靶向ca
2+-atp酶基因的dsrna，实现了对ca
2+-atp酶基因的敲降，并提高了低盐度水体中青蟹的存活率。该dsrna敲降效率高，作用效果持久，为青蟹低盐水体的养殖及遗传改良提供了研究基础。
15.有益效果
16.本发明提供的dsrna可以高效沉默青蟹ca
2+-atp酶基因，导致青蟹在低盐度(例如5
‰
)水体中的存活率显著上升(与同盐度对照组相比)。因此本发明利用ca
2+-atp酶基因的rnai技术来影响青蟹对低盐度水体的适应性，为青蟹的低盐度水体养殖推广和耐低盐新品种选育提供了一个新的思路。
附图说明
17.图1为本发明rna干扰1h、12h、24h和48h后ca
2+-atp酶基因mrna的荧光定量pcr检测。
18.图2为本发明ca
2+-atp酶基因敲降48小时后青蟹仔蟹在不同盐度中的存活率。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
20.实施例1
21.利用rna干扰技术沉默青蟹ca
2+-atp酶基因
22.一、试验材料及来源
gtggtgtttgctctcggcctctaccagagcatccccatacagaagatcttcaacatcgcggtgagtctggcggtggctgccatccccgaggggctgcccattgtggtgaccatgacgctgtgcctgggcatccgtcgcatggcgcagcgttcagctctggtcaagggactgcaaactgtggagacgctgggatgtgtcaccacggtctgctctgacaagactgggactctcaccaagaatgagatgacggtgaccaacattgtaacctctgagggggacgagtgttgcctcacgggagttgggtactcggccgacggacaggtggtgtttgagggcgggtactccgagctggctaacgaggcggtcaccaaactgctggagacaggtgctgtgtgtaacaatgctcagattgtgggtggccagctgctgggacaacctaccgacggggccattcttgctgctgccatcaagcacgggatctacaacgcagctgacaagtaccagaggatggaggaggttcccttcaagtcagagaccaagacgatgtcagtgaaggtgaagaacaagaagacaggtgaggtggagtggctggtgaagggtgcggtggaggtggtgctgcgttcctgcactcactaccagcagaacatgagtgtgctgcctctctcccaggagcgacacagacacattctctccattgcgctggaacactcccgccgcggcctccgagtgctctccatcgcccgcggcccaagtctgtccgaactga)、扩大培养，并进行菌液保存。
41.5.dsrna的体外制备。
42.a.取上述保存的菌液(含重组质粒)100μl，接种到5ml含氨苄的lb液体培养基上过夜扩培。
43.b.取上述250μl扩培的菌液接种到25ml的2
×
yt液体培养基，37℃条件下震荡培养。当od
595
＝0.6时，加入优化的25μl(50mg/ml)的iptg诱导4h。
44.c.4℃，3000rpm条件下离心6min，收集菌体细胞沉淀。
45.d.提取上述细胞总rna后，用上述dnase i去除潜在的dna污染。
46.e.75℃条件下，对上述纯化的rna变性10min。
47.f.自然缓慢冷却至25℃，退火获得ca
2+-atp酶基因的dsrna。
48.g.按说明书向上述产物dsrna中加入rnase a去除总rna。
49.6.dsrna的纯化。
50.使用优化的酚/氯仿抽提法纯化dsrna。
51.a.在25μl上述dsrna产物的体系中迅速加入225μl无酶水和250μl饱和酚溶液，混匀后静置5min。
52.b.12,500rpm离心10min后，取出上清，并加入等体积的氯仿混匀。
53.c.12,500rpm离心10min，取出上清，向其中加入3倍体积的-20℃无水乙醇，于-80℃放置60min。
54.d.12,500rpm离心上述液体，回收沉淀。
55.e.将得到的沉淀干燥后，用无酶水溶解，获得纯化的dsrna。
56.f.测定上述dsrna溶液的浓度。
57.7.rna干扰试验的实施。
58.将青蟹i期仔蟹放入暂养箱中，向实验组注射4μl(2.5μg/μl)/仔蟹的dsrna，共注射1000只。同时设置对照组，对照组注射4μl/仔蟹的1
×
pbs。
59.注射1h、12h、24h和48h后，分别取实验组和对照组的青蟹各10只，按照总rna提取试剂盒说明书提取总rna，并按照反转录试剂盒说明书合成cdna，备用。
60.8.定量检测青蟹ca
2+-atp酶基因的沉默效率。
61.qpcr检测基因沉默效率时，ca
2+-atp酶基因检测用的正向引物的核苷酸序列为seq id.3，具体为：5'-ggtgagcagcatcctaagca-3'；ca
2+-atp酶基因检测用的反向引物的核苷酸
序列如seq id.4所示，具体为：5'-ccctatgaagcagaaagaaaag-3'。使用qpcr方法检测沉默效率时的内参基因为18s rrna，其正向引物的核苷酸序列如seq id.5所示，具体为：5'-cagacaaatcgctccaccaac-3'；qpcr检测的反向引物的核苷酸序列如seqid.6所示，具体为：5'-gactcaacacggggaacctca-3'。反应体系为：2
×
sybr green10μl，两种引物各0.25μl，cdna模板1μl，dd h2o补足至20μl。pcr循环程序为：初始98℃10s，之后进行98℃5s，60℃30s的40个循环。qpcr检测结果使用2-δδct
法计算，目标ca
2+-atp酶基因表达量的降低程度视为该基因的沉默效率。经计算，各采样时间点的ca
2+-atp酶基因的沉默效率分别为82％、89％、87％和81％，均高于80％(图1)。
62.9.沉默ca
2+-atp酶基因后青蟹盐度耐受实验。
63.设置注射dsrna的35
‰
，25
‰
,15
‰
,5
‰
几个盐度实验组(每组50只仔蟹)、及注射1
×
pbs的对应35
‰
，25
‰
,15
‰
,5
‰
的盐度对照组(每组50只仔蟹)，统计置于各盐度组96h后青蟹存活率，用以检测其盐度耐受能力(图2)。实验组和对照组分别设置3个生物学重复组。实验结果显示：盐度为25
‰
和15
‰
的对照组存活率分别为95％和93％相应的，盐度为25
‰
和15％的实验组仔蟹的存活率为91％和93％，实验结果说明水体盐度为25
‰
和15％时，实验组和对照组的仔蟹存活率无显著差异；当盐度达到35
‰
时，实验组仔蟹存活率存降低至53％，明显低于对照组存活率(84％)，说明敲降ca
2+-atp酶基因后，不利于仔蟹在高盐度的水体中生存；当盐度为5
‰
时，对照组仔蟹存活率仅为65％，而注射dsrna的实验组仔蟹存活率显著高于相应盐度的对照组，达到88％，证明ca
2+-atp酶基因的敲降有利于青蟹仔蟹在低盐水体中的生存。
64.上述实施例的结果表明，ca
2+-atp酶基因参与青蟹的渗透压调节，其表达水平将影响青蟹在低盐度水环境中的代谢反应。与注射pbs的对照组相比，当青蟹注射上述dsrna后，ca
2+-atp酶基因表达量降低了80％以上，且ca
2+
浓度相对稳定时，ca
2+-atp酶基因的沉默效果持续存在。因此本发明提出可利用ca
2+-atp酶基因的rnai技术来影响青蟹对低盐度水体的适应性，为青蟹低盐度水体养殖推广和耐低盐新品种选育提供了新的方法与策略。
65.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种dsrna引物，其特征在于，所述dsrna的正向引物的核苷酸序列如seq id.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id.2所示。2.一种如权利要求1所述的dsrna引物在青蟹低盐水体养殖中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用过程中含有所述引物的dsrna调控青蟹ca
2+-atp酶基因的表达。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用过程中pcr反应体系为：10
×
反应缓冲液5μl，正向引物0.25μl，反向引物0.25μl，cdna模板0.5μl，taq聚合酶1.0μl，dd h2o补足50μl。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用过程中青蟹仔蟹i期到ii期注射靶向ca
2+-atp酶基因的含有所述引物的dsrna。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述dsrna的注射量为8～10μg/仔蟹。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述低盐水体的盐度为4
‰‑6‰
。8.一种dsrna，其特征在于，包括权利要求1所述引物。9.根据权利要求8所述的dsrna，其特征在于，所述dsrna的核苷酸序列如seq id.7所示。

技术总结
本发明涉及一种靶向调控青蟹Ca


技术研发人员：刘志强 马克异 马凌波 徐利坤 任远豪 王伟 马春艳 张凤英 赵明 谌微 傅愔
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院东海水产研究所
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/13