一种人乳头瘤病毒检测试剂及其应用的制作方法

1.本发明属于检测技术领域，涉及一种人乳头瘤病毒检测试剂及其应用。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(hpv)是一组具有组织特异性的双链dna肿瘤病毒，能引起上皮和粘膜组织增生，主要通过直接或间接接触污染人的皮肤、粘膜组织，其中尖锐湿疣是hpv感染引起的常见性传播性疾病，其感染率高、传染性强。目前研究认为，高危型hpv感染是宫颈癌发生发展的必要因素，特别是hpv16在宫颈癌组织中检出率最高，可达50％，hvp16也是我国妇女宫颈癌的主要型别，由国际癌症研究机构(iarc)组织在22个国际进行了针对引起侵袭性宫颈癌(icc)的hpv类型的调查，组织学确诊为icc的1000个病例中有99.7％发现hpv dna阳性，其中hpv的类型主要为hpv16(53％)和hpv18(15％)。
3.子宫颈癌是第二位常见女性恶性肿瘤，人乳头瘤病毒(hpv)是其发生的必要条件。尽管人群hpv感染很普遍，如：宫颈癌高发区妇女35岁以后感染率仍高达20.8％。但超过80％的hpv dna阳性妇女不会进展为癌症或癌前病变。因此hpv dna检测缺陷是无法分辨一过性感染和可引起宫颈病变的感染，导致较高假阳性率。大量研究显示，hpv致癌基因表达产物(癌蛋白oncoprotein)有很高的致癌活性，因此这些生物标志物可以作为比hpv dna更为准确有特异性的宫颈癌预测指标。
4.除了hpv dna检测和hpv致癌蛋白检测，血液(体液)中hpv抗体也证明对hpv感染及宫颈癌发病史有很大的相关性。hpv l1血液抗体可用检测，提供hpv感染信息。随着hpv感染时间的延长，hpv诱导产生了抗hpv抗体，故可检测到血清中抗hpv抗体。
5.但是目前hpv检测方法还是核酸检测方法居多，国家药品监督管理局还未有化学发光测试hpv抗体的相关产品注册信息，因此开发一种hpv化学发光抗体检测的试剂盒具有很大的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种人乳头瘤病毒检测试剂及其应用。
7.本发明的一个目的通过以下技术方案实现：
8.一种人乳头瘤病毒检测试剂，包括：人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂。
9.作为优选，所述人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂的制备方法包括以下步骤：
10.磁性微粒分散液中加入人乳头瘤病毒抗原，再加入反应催化剂混悬反应，然后调节ph为7.0～8.0，加入封闭剂进行封闭反应，清洗后，加入稀释液重悬获得人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂。
11.磁性微粒指的是磁性纳米粒子与有机分子或无机分子结合形成的可均匀分散于
一定基液中具有高稳定性的胶态复合材料，磁性微粒表面含有甲苯磺酰基、氨基、羧基、羟基、环氧乙烷等一种或多种活性功能基团。磁性微粒分散液为磁性微粒分散于缓冲液中形成，磁性微粒粒径优选为0.5～3.0μm，缓冲液可列举为ph 5.0～9.5、0.05～0.3mol/l的hepes、mes、硼酸、磷酸盐缓冲液；磁性微粒分散液中，磁性微粒的浓度优选为5～20mg/ml。
12.作为优选，磁性微粒与人乳头瘤病毒抗原的质量比为1:5～1:100。
13.作为优选，反应催化剂为ph9.0～10.0、0.5～4mol/l的硫酸铵溶液。
14.作为优选，反应催化剂的添加量为磁性微粒分散液和人乳头瘤病毒抗原总体积的0.5～2倍。
15.作为优选，混悬反应在20～35℃下反应20～80h。
16.作为优选，封闭剂由2～10wt％peg6000溶液、db1130和0.1～1wt％明胶溶液混合而成。db1130为blockmaster
tm db1130，购自日本mbl公司。
17.作为优选，2～10wt％peg6000溶液、db1130和0.1～1wt％明胶溶液以质量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1～5)进行混合。
18.作为优选，每10mg磁性微粒添加100～150μl封闭剂。
19.作为优选，封闭反应在20～35℃下反应15～30h。
20.作为优选，加入稀释液后重悬获得人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂的浓度为5～20mg/ml(以磁性微粒质量计算)。
21.作为优选，所述碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂的制备方法包括以下步骤：
22.s1、人乳头瘤病毒抗体更换为无氨基及巯基缓冲液后浓缩，然后在人乳头瘤病毒抗体中加入二硫代苏糖醇(dtt)或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(tcep)进行反应，加入甘氨酸溶液，继续反应，过脱盐柱，并浓缩至2～4mg/ml(以人乳头瘤病毒抗体质量计算)；
23.s2、将碱性磷酸酶更换为无氨基及巯基缓冲液后浓缩，然后加入smcc溶液进行反应，加入甘氨酸溶液，继续反应，过脱盐柱，并浓缩至2～4mg/ml(以碱性磷酸酶质量计算)；
24.s3、将步骤s1的产物和步骤s2的产物混合，然后加入氯化镁溶液进行反应；
25.s4、将步骤s3的产物进行纯化，然后稀释至终浓度为0.2～2μg/ml。
26.上述步骤s1和步骤s2中，无氨基及巯基缓冲液可以列举为硼酸盐缓冲液、hepes缓冲液等，ph为7.0～7.5、浓度为0.01-0.05mol/l。
27.上述步骤s1和步骤s2中，更换为无氨基及巯基缓冲液的方法包括透析或采用pd-10脱盐柱。人乳头瘤病毒抗体和碱性磷酸酶更换缓冲液后浓缩至2～4mg/ml。
28.上述步骤s1中，加入二硫代苏糖醇(dtt)或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(tcep)进行反应的时间为10～30min，反应在15～40℃下进行。
29.上述步骤s1中，加入的dtt或tcep为溶液形式，例如可以用ph8.0～9.0、0.01～0.05mol/l hepes缓冲液溶解dtt或tcep，dtt或tcep溶液的浓度优选为10～50mmol/l，每毫克抗体质量加入0.5～2.5微升dtt或tcep溶液。
30.上述步骤s1和步骤s2中，甘氨酸溶液的ph为7.0～7.4，浓度为0.5～2mol/l。步骤s1中，甘氨酸溶液的加入体积量同dtt或tcep溶液的加入量；步骤s2中，甘氨酸溶液的加入体积量同smcc溶液的加入量；加入甘氨酸溶液后继续反应5～10min。
31.上述步骤s1和步骤s2中，过脱盐柱时，用例如ph8.0～9.0、0.01-0.05mol/l hepes
缓冲液进行洗脱，然后再浓缩至2～4mg/ml。
32.上述步骤s2中，smcc溶液为smcc溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中形成，浓度优选为5～8mg/ml。
33.上述步骤s2中，每毫克碱性磷酸酶加入2.5～7.5μl smcc溶液，反应在20～40℃下进行，反应时间为10～30min。
34.上述步骤s3中，步骤s1的产物和步骤s2的产物的质量比优选为1：(0.5～2)。
35.上述步骤s3中，氯化镁溶液浓度为0.1～0.5mol/l，每毫升反应体积中加入1～5μl氯化镁溶液。
36.上述步骤s3中，加入氯化镁溶液进行反应的温度为2～8℃，反应时间为8～20h。
37.步骤s4中，纯化步骤包括：将步骤s3的产物过superdex200分子筛柱，根据蛋白出峰情况，进行收集。稀释采用的缓冲液可列举为ph7.0～7.5、0.01～0.05mol/l hepes缓冲液。
38.本发明提供的一种人乳头瘤病毒检测试剂，还包括人乳头瘤病毒抗体校准品试剂，所述人乳头瘤病毒抗体校准品试剂为人乳头瘤病毒抗体用校准品缓冲液稀释到多个系列浓度而得。系列浓度可以包括0.2、1.0、5、25、100pg/ml等。
39.作为优选，校准比缓冲液包括1～10g/l hepes、20～60g/l bsa、2～10g/l氯化钠、0.5～2mmol/l氯化镁、0.05～0.2mmol/l氯化锌、1-4g/l防腐剂、水，调节缓冲液的ph为7.0～9.0。
40.本发明的另一个目的通过以下技术方案实现：
41.上述人乳头瘤病毒检测试剂在测定人乳头瘤病毒抗体中的应用，包括以下步骤：在待测样本中加入人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂，混匀后孵育；
42.添加磁场，使孵育后体系在磁场中沉降，去除上清液，沉淀经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡；
43.然后加入发光底物，充分混悬后检测相对发光强度值。
44.上述方法中，所述孵育优选为：在35～38℃下孵育6～8min。
45.上述方法中，所述待测样本、人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂的体积比优选为1:0.9～1.1：0.9～1.1。
46.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
47.1、本发明采用化学发光法来定量检测人乳头瘤病毒抗体，采用人乳头瘤病毒抗原直接包被磁性微粒，避免了生物素-亲和素系统对检测结果的干扰；
48.2、本发明的人乳头瘤病毒检测试剂中，人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒采用由2～10wt％peg6000溶液、db1130和0.1～1wt％明胶溶液混合而成的封闭剂封闭，三者具有优异的协同效果，与单一封闭剂、两者混合的封闭剂相比具有更好的封闭效果，磁性微粒更为分散，未团聚，磁性微粒状态更好，灵敏度和准确度更高，大大提高了试剂性能，对干扰有很大的改善；
49.3、本发明采用的检测人乳头瘤病毒抗体的体系，弥补了国内hpv化学发光抗体检测的空缺，且灵敏度和准确度高，有很高的临床价值。
dtt溶液，每毫克抗体质量加入1微升dtt溶液，室温反应20分钟；加入ph7.3、1mol/l甘氨酸溶液，加入体积量同dtt的加入体积量，室温反应8min；使用pd-10脱盐柱更换缓冲液(ph8.5、0.02mol/l hepes缓冲液)，浓缩到3mg/ml备用；
76.s2、将1mg碱性磷酸酶用pd-10脱盐柱更换为无氨基及巯基缓冲液(用ph7.0、0.02mol/l hepes缓冲液)，用浓缩管浓缩到3mg/ml；称取smcc，用dmf溶解到6mg/ml，每毫克碱性磷酸酶加入5μl smcc溶液，室温反应20分钟；加入ph7.3、1mol/l甘氨酸溶液，加入体积量量同smcc溶液加入体积量，室温反应15min；使用pd-10脱盐柱更换缓冲液(ph8.5、0.02mol/l hepes缓冲液)，浓缩到3mg/ml；
77.s3、将步骤s1的产物和步骤s2的产物按照质量比1:1进行混合，加入0.2mol/l氯化镁溶液，每毫升反应体积中加入2μl氯化镁溶液，4℃反应16小时；
78.s4、将步骤s3的产物进行纯化，然后稀释至终浓度为1μg/ml。
79.对比例1
80.对比例1与实施例1的区别在于，封闭剂为db1130，其它与实施例1相同。
81.对比例2
82.对比例2与实施例1的区别在于，封闭剂为0.5wt％明胶水溶液，其它与实施例1相同。
83.对比例3
84.对比例3与实施例1的区别在于，封闭剂为封闭剂为5wt％peg6000水溶液，其它与实施例1相同。
85.对比例4
86.对比例4与实施例1的区别在于，封闭剂由5wt％peg6000水溶液、db1130以质量比1:1混合而成，其它与实施例1相同。
87.对比例5
88.对比例5与实施例1的区别在于，封闭剂由5wt％peg6000水溶液、0.5wt％明胶水溶液以质量比1:1混合而成，其它与实施例1相同。
89.对比例6
90.对比例6与实施例1的区别在于，封闭剂由db1130、0.5wt％明胶水溶液以质量比1:1混合而成，其它与实施例1相同。
91.对比例7
92.对比例7与实施例1的区别在于，封闭剂为10％bsa，其它与实施例1相同。
93.对比例8
94.对比例8与实施例1的区别在于，封闭剂为为ce210(blockmaster
tm
)，其它与实施例1相同。
95.对比例9
96.对比例9与实施例1的区别在于，封闭剂由5wt％peg6000水溶液、ce210、0.5wt％明胶水溶液以质量比1:1:1混合而成，其它与实施例1相同。
97.将实施例1，以及对比例1-9的人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒进行超声，超声结束后用显微镜进行镜检观察磁性微粒状态，用相机进行拍照，记录磁性微粒状态结果。
98.图1-10分别为实施例1、对比例1-9的人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒的显微镜
照片，从图1-10可以看出，采用本发明的混合封闭剂封闭后的人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒相对于其他封闭剂封闭的来说，更为分散，链接物未发生团聚现象，封闭效果更好。
99.采用实施例1和对比例1-9的人乳头瘤病毒检测试剂同时测定空白限，具体方法为：用零浓度校准品作为样本进行检测，在25μl零浓度校准品中加入50μl人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和50μl碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂，混匀后在37℃下孵育7min；添加磁场，使孵育后体系在磁场中沉降，去除上清液，沉淀经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡；然后加入发光底物，充分混悬后检测相对发光强度值。
100.重复测定20次，得出20次测量结果的发光值(rlu)。计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m+2sd所对应的发光值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-rlu值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m+2sd发光值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限，结果见表1。
101.表1实施例1和对比例1-9的人乳头瘤病毒检测试剂测试空白限结果
[0102][0103]
从试验结果看出，实施例1采用的混合封闭剂制备的抗原包被磁性微粒的空白限最低，为0.015pg/ml，和其他的条件相比，空白限有很大的改善。
[0104]
实施例2
[0105]
实施例2与实施例1的区别在于，实施例2的混合封闭剂由5wt％peg6000水溶液、db1130、0.5wt％明胶水溶液以质量比为1:1:3混合而成。
[0106]
实施例3
[0107]
实施例3与实施例1的区别在于，实施例2的混合封闭剂由5wt％peg6000水溶液、db1130、0.5wt％明胶水溶液以质量比为1:1:5混合而成。
[0108]
对比例10
[0109]
对比例10与实施例1的区别在于，对比例10的混合封闭剂由5wt％peg6000水溶液、db1130、0.5wt％明胶水溶液以质量比为0.5:0.5:5混合而成。
[0110]
对比例11
[0111]
对比例11与实施例1的区别在于，对比例11的混合封闭剂由5wt％peg6000水溶液、db1130、0.5wt％明胶水溶液以质量比为1:1:0.5混合而成。
[0112]
将实施例2-3以及对比例10-11的人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒进行超声，超声结束后用显微镜进行镜检观察磁性微粒状态，用相机进行拍照，记录磁性微粒状态结果。
[0113]
图11和12分别为实施例2-3的人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒的显微镜照片，从图1、11和12可以看出，采用不同比例(1:1:1，1:1:3，1:1:5)的混合封闭剂进行封闭，磁珠状态均很分散，链接物未发生团聚现象，封闭效果较好。
[0114]
采用实施例2-3和对比例10-11的人乳头瘤病毒检测试剂同时测定空白限，测定方法同上，空白限结果如表2所示。
[0115]
表2实施例2-3和对比例10-11的人乳头瘤病毒检测试剂测试空白限结果
[0116]
实施例实施例2实施例3对比例10对比例11
空白限(pg/ml)0.0160.0190.0270.025
[0117]
从表2可以看出，采用不同比例(1:1:1，1:1:3，1:1:5)的混合封闭剂进行封闭的磁性微粒，相对于其它比例混合的封闭剂，空白限降低。
[0118]
实施例4
[0119]
实施例4与实施例1的区别在于，实施例4中每10mg磁性微粒中添加100μl封闭剂，其它与实施例1相同。
[0120]
实施例5
[0121]
实施例5与实施例1的区别在于，实施例5中每10mg磁性微粒中添加150μl封闭剂，其它与实施例1相同。
[0122]
图13和14分别为实施例4-5的人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒的显微镜照片，从图1、13和14可以看出，用不同体积(100μl/10mg磁性微粒，125μl/10mg磁性微粒，150μl/10mg磁性微粒)的混合封闭剂(1:1:1)进行封闭，磁性微粒状态均很分散，链接物未发生团聚现象，封闭效果较好。
[0123]
采用实施例4-5的人乳头瘤病毒检测试剂同时测定空白限，测定方法同上，空白限结果如表3所示。
[0124]
表3实施例4-5的人乳头瘤病毒检测试剂测试空白限结果
[0125]
实施例实施例4实施例5空白限(pg/ml)0.0140.016
[0126]
从表3可以看出，采用不同体积的混合封闭剂进行封闭的磁性微粒，空白限较低。
[0127]
本发明的各方面、实施例、特征应视为在所有方面为说明性的且不限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
[0128]
在本发明的制备方法中，各步骤的次序并不限于所列举的次序，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，对各步骤的先后变化也在本发明的保护范围之内。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
[0129]
最后应说明的是，本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明，而并非对本发明的实施方式进行限定。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，这里无需也无法对所有的实施方式予以全例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

技术特征：
1.一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，所述人乳头瘤病毒检测试剂包括：人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂。2.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，所述人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂的制备方法包括以下步骤：磁性微粒分散液中加入人乳头瘤病毒抗原，再加入反应催化剂混悬反应，然后调节ph为7.0～8.0，加入封闭剂进行封闭反应，清洗后，加入稀释液重悬获得人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂。3.根据权利要求2所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，磁性微粒与人乳头瘤病毒抗原的质量比为1:5～1:100；和或，反应催化剂为ph 9.0～10.0、0.5～4mol/l的硫酸铵溶液；和或，混悬反应在20～35℃下反应20～80h；和或，封闭反应在20～35℃下反应15～30h；和或，加入稀释液后重悬获得人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂的浓度为5～20mg/ml。4.根据权利要求2所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，封闭剂由2～10wt％peg6000溶液、db1130和0.1～1wt％明胶溶液混合而成。5.根据权利要求4所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，2～10wt％peg6000溶液、db1130和0.1～1wt％明胶溶液以质量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1～5)进行混合。6.根据权利要求4所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，每10mg磁性微粒中添加100～150μl封闭剂。7.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂的制备方法包括以下步骤：s1、人乳头瘤病毒抗体更换为无氨基及巯基缓冲液后浓缩，然后在人乳头瘤病毒抗体中加入二硫代苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，加入甘氨酸溶液，继续反应，过脱盐柱，浓缩；s2、将碱性磷酸酶更换为无氨基及巯基缓冲液后浓缩，然后加入smcc溶液进行反应，加入甘氨酸溶液，继续反应，过脱盐柱，浓缩；s3、将步骤s1的产物和步骤s2的产物混合，然后加入氯化镁溶液进行反应；s4、将步骤s3的产物进行纯化，然后稀释至终浓度为0.2～2μg/ml。8.根据权利要求7所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，步骤s1中，加入二硫代苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应的时间为10～30min，反应在15～40℃下进行；和或，步骤s2中加入smcc溶液后反应在20～40℃下进行，反应时间为10～30min；和或，步骤s3中加入氯化镁溶液进行反应的温度为2～8℃，反应时间为8～20h。9.根据权利要求7所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂，其特征在于，步骤s1中和步骤s2，甘氨酸溶液的ph为7.0～7.4，浓度为0.5～2mol/l，加入甘氨酸溶液后继续反应5～10min。10.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒检测试剂在测定人乳头瘤病毒抗体中的应
用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：在待测样本中加入人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂，混匀后孵育；添加磁场，使孵育后体系在磁场中沉降，去除上清液，沉淀经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡；然后加入发光底物，充分混悬后检测相对发光强度值。

技术总结
本发明属于检测技术领域，涉及一种人乳头瘤病毒检测试剂及其应用。所述人乳头瘤病毒检测试剂，包括：人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒试剂和碱性磷酸酶标记的人乳头瘤病毒抗体试剂。所述人乳头瘤病毒抗原包被的磁性微粒采用由2～10wt％PEG6000溶液、DB1130和0.1～1wt％明胶溶液混合而成的封闭剂封闭。本发明采用的检测人乳头瘤病毒抗体的体系，弥补了国内HPV化学发光抗体检测的空缺，且灵敏度和准确度高，有很高的临床价值。有很高的临床价值。有很高的临床价值。


技术研发人员：曹建全 郭俊美 汪云峰 贺率 柳建敏
受保护的技术使用者：宁波海尔施智造有限公司
技术研发日：2023.03.15
技术公布日：2023/7/13