一种肿瘤亲和肽及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤亲和肽及其应用。


背景技术：

2.肿瘤危害人类健康，其死亡率还在持续上升。在癌症转移到其它器官之前，早期发现恶性病变可以尽早进行明确的局部治疗，从而获得极高的生存率。因此，恶性肿瘤的早期诊断和治疗至关重要。
3.对于肿瘤，常规影像诊断技术主要为b超、ct和mri。这些影像诊断技术是通过显示组织的功能变化来达到诊断的结果，有较好的应用价值，但在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价上仍存在一定的不足。
4.近年来，随着对肿瘤及其相关学科的认识和研究，研究的重点开始转移到针对肿瘤细胞内异常表达靶点的特异性肿瘤诊断药物，用于进行肿瘤的早期诊断。针对靶点的特异性肿瘤诊断药物主要特异性结合于肿瘤细胞上，对正常细胞无结合，因而可以达到高选择、低毒性的诊断效果。目前认为，靶向多肽是比较理想的肿瘤靶向治疗手段，具有以下优势：1)血浆清除速度快，亲和力高，特异性强；2)良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞所摄取；3)易于化学合成，且免疫原性低，可避免单克隆抗体治疗的不足。
5.肿瘤细胞与肿瘤微环境之间复杂的交互作用及信号调节在肿瘤发生发展中起着重要作用。肿瘤微环境中的成纤维细胞在激活后即为肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，cafs)。cafs不同于普通成纤维细胞的特性之一就是高表达成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，fap)。fap是隶属于脯氨酰寡肽酶家族的ii型跨膜丝氨酸蛋白酶，主要存在于细胞膜上，胞质、跨膜和胞外结构分别由6、18和736个氨基酸组成。常见形式为95ku的单体形式或分子质量为170ku的同型二聚体，这种二聚体结构由两个具有相同酶活性且分子质量为97
×
103的亚单位组成。作为二肽基肽酶家族主要成员之一，fap不仅与dpp4具有相同的结构域，而且在完整的氨基酸序列中有48％的相同氨基酸。fap的亚单位组成包括β螺旋结构域和α/β水解催化域。由ser624、asp702和his734组成的催化三联体定位在β螺旋结构域和α/β水解催化域的交界面，8片β螺旋桨叶位于催化三联体的顶部，作为选择性过滤蛋白质的出入口。
6.cafs在调节恶性上皮细胞、细胞外基质和大量非肿瘤细胞(如内皮细胞、脂肪细胞、炎症细胞和免疫细胞)之间的动态和共生网络中具有重要的作用，参与肿瘤发生、进展、血管形成、免疫调节、信号传导、耐药及转移等过程。fap作为cafs的特异性标志物，在超过90％上皮来源恶性肿瘤(如乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、软组织及骨源性肉瘤)基质中的cafs中有高度表达，而正常组织中的成纤维细胞无fap表达或表达较低。因此，fap作为潜在的生物标志物及特异性肿瘤治疗靶点，已经在多种肿瘤性疾病中被研究。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明目的在于提供一种肿瘤亲和肽及其应用。所述的肿瘤亲和肽能够靶向人成纤维细胞激活蛋白(fap)，使其能够对fap受体高表达的肿瘤进行在体诊断，可用于制备新型的靶向药物载体。
8.技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.本发明提供了一种肿瘤亲和肽，其氨基酸序列为seq id no.1～4之一所示的氨基酸序列：
10.seq id no.1：ser-met-val-gly-pro-ser-gln-gly-arg-ser；
11.seq id no.2：thr-gly-pro-gly-pro-asn-gln-cys；
12.seq id no.3：ser-gly-pro-gly-pro-asn-gln-cys；
13.seq id no.4：gly-gly-pro-gly-pro-asn-gln-cys。
14.上述肿瘤亲和肽能够靶向人成纤维细胞激活蛋白(fap)。
15.本发明还提供了上述肿瘤亲和肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用。优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用。
16.本发明还提供了上述肿瘤亲和肽在制备肿瘤的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用。优选在制备用于肿瘤边界的精准定位和术中影像导航的肿瘤诊断显像剂以及放射性核素显像试剂中的应用。
17.本发明还提供了上述肿瘤亲和肽在制备肿瘤靶向药物载体中的应用。
18.本发明所述的肿瘤亲和肽能高度模拟fap(成纤维细胞激活蛋白)的肿瘤靶向，高效结合成纤维细胞激活蛋白(fap)至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的摄取和滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。
19.本发明所述的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、肺癌、前列腺癌等。
20.本发明的另一个目的在于提供一种修饰的多肽，在上述任一肿瘤亲和肽的氨基酸序列n端连接m标记；
21.本发明所述修饰的多肽，可用通式m-fap-x表示。
22.其中，所述m为光标记或放射性核素标记。
23.x为1～4中的任意整数。
24.fap-1为氨基酸序列为seq id no.1的多肽；fap-2为氨基酸序列为seq id no.2的多肽；fap-3为氨基酸序列为seq id no.3的多肽；fap-4为氨基酸序列为seq id no.4的多肽。
25.当m为光标记时，此时的m-fap-x为一种具有优良显像功能的荧光分子影像探针，其结构中含有用于靶向肿瘤的本发明多肽fap-x和用于光学成像的光标记m。
26.优选地，所述光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物或生物发光分子。
27.进一步优选地，所述有机荧光团为近红外荧光染料。更进一步地，所述近红外荧光染料为icg-der-02(mpa)、irdye800、cy7.5、cy5.5；更进一步优选mpa。
28.优选地，所述放射性核素选自
99m tc、
68
ga，
64
cu，
67
ga，
90
y，
111
in、
177
lu或
125
i。
29.本发明还提供了上述修饰的多肽在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂中的应用。优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用。
30.本发明还提供了上述修饰的多肽在制备肿瘤的荧光成像试剂或放射性显像试剂中中的应用。优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中中的应用。
31.当m为荧光标记时，上述修饰的多肽为一种荧光分子影像探针，又称为肿瘤亲和探针(荧光靶向探针)。
32.有益效果：
33.1、本发明开发了一系列新的模拟fap(成纤维细胞激活蛋白)的高亲和力的多肽，可用于靶向成纤维细胞激活蛋白(fap)。利用fap受体在肿瘤中高表达，基于fap-x(x＝1-4)多肽与fap受体特异性结合的原理，可用于fap高表达肿瘤的早期诊断。
34.2、这些多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉，且这些多肽在活体内较稳定。通过延长多肽的半衰期来提高其在体内的循环时间，促进影像探针在肿瘤部位的浓聚和滞留，进而获得更好的肿瘤显像效果，使其更利于临床推广应用。
35.3、这些多肽均为首次报道，制备方法简单，获取渠道方便。
36.4、fap-x(x＝1-4))系列多肽可以和肿瘤细胞特异性结合，经活体光学成像和结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括乳腺癌、结直肠癌及肺癌等。
37.5、本发明利用近红外荧光染料mpa穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。
38.6、fap-x(x＝1-4)多肽放射性药物可用于肿瘤的筛查和早期诊断，还可以实时无损在位监测早期恶性肿瘤以及治疗。
附图说明
39.图1为肿瘤亲和肽fap-1的结构式。
40.图2为肿瘤亲和肽fap-1的质谱图。
41.图3为肿瘤亲和探针(荧光靶向探针)mpa-fap-1的质谱图。
42.图4为流式细胞术检测不同荧光靶向探针对mcf-7细胞的亲和力结果。
43.图5为荧光靶向探针mpa-fap-1在乳腺癌mcf-7荷瘤鼠体内的光学成像图。
44.图6为荧光靶向探针mpa-fap-2在乳腺癌mcf-7荷瘤鼠体内的光学成像图。
45.图7为荧光靶向探针mpa-fap-3在肺癌a549荷瘤鼠体内的光学成像图。
46.图8为荧光靶向探针mpa-fap-4在结直肠腺癌hct116荷瘤鼠体内的光学成像图。
具体实施方式
47.下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
48.本发明所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均为可以通过市场购买的常规产品。
49.本发明所用氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司，rink amide mbha树脂购自江苏吉泰肽业有限公司，所用dmem培养基购自江苏凯基生物技术有限公司，mcf-7细胞购中科
院上海细胞库。
50.实施例1多肽fap-1的制备
51.fap-1的氨基酸序列为：ser-met-val-gly-pro-ser-gln-gly-arg-ser。
52.通过固相合成方法合成多肽，具体如下：
53.(1)树脂溶胀
54.称取1mmol当量rink amide mbha树脂放入多肽合成管，加入适量二氯甲烷(dcm)没过树脂即可，溶胀30min。抽掉dcm溶液，用dmf洗涤，抽干。
55.(2)脱除fmoc
56.合成管中加入体积分数为20％哌啶的dmf溶液，没过树脂即可，脱保护时间为5min，重复两次。反应结束后用dmf洗涤。
57.(3)偶联
58.向合成管中加入2mmol当量的氨基酸、4mmol当量的dipea、2mmol当量的hctu和dmf，震荡反应1h，抽掉反应液并用dmf洗涤，然后按步骤(2)的方式脱fmoc，洗净，茚三酮检测。
59.(4)按照步骤(3)的方式依次加入序列中不同的氨基酸进行耦合，其中涉及的氨基酸残基可以是l-型，也可以是d-型。脯氨酸(pro)也可以替换成羟脯氨酸(hyp)，精氨酸(arg)可以替换成高精氨酸(homo-arg)，丙氨酸可以替换成β-丙氨酸。
60.(5)裂解
61.将树脂用氮气吹干，向多肽合成管中加入切割液(87.5％tfa+5％苯甲硫醚+2.5％乙二硫醇+2.5％苯酚+2.5％水)，切割液体积和树脂的比例大约为10ml/g，反应2-3h后，抽滤得到滤液，加入大量乙醚，然后离心，固体用乙醚洗涤三遍，得到多肽粗品。
62.(6)分离纯化
63.采用反相高效液相色谱法纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，流动相系统为0.1％的tfa/水溶液和乙腈溶液，采用梯度系统洗脱，采用紫外分光光度法测定多肽紫外吸收进行定量，结果显示成功合成该多肽(fap-1的结构式见图1)，且纯度为95％以上，ms结果如图2所示。将收集好的洗脱液放入冻干机进行浓缩，冻干成白色粉末。
64.实施例2多肽fap-x(x＝2-4)的制备
65.按照实施例1的方法制备肿瘤亲和肽fap-2、fap-3、fap-4。
66.fap-2氨基酸序列为thr-gly-pro-gly-pro-asn-gln-cys；质谱确证[m-h]-＝772.33。
[0067]
fap-3氨基酸序列为ser-gly-pro-gly-pro-asn-gln-cys；质谱确证[m-h]-＝758.29。
[0068]
fap-4氨基酸序列为gly-gly-pro-gly-pro-asn-gln-cys；质谱确证[m-h]-＝728.36。
[0069]
实施例3荧光靶向探针mpa-fap-1的制备
[0070]
mpa的制备参见发明人前期授权专利cn101440282。
[0071]
荧光靶向探针mpa-fap-1的制备方法具体如下：
[0072]
(1)取0.02mmol mpa溶于200μl超干dmso中，加入3.7mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和2.2mg n-羟基琥珀酰亚胺(edci/nhs)(摩尔比mpa:edci:nhs＝1:
1.5:1.5)，避光反应4h，进行羧基活化反应。
[0073]
(2)取实施例1中固相合成的多肽fap-1 0.02mmol与0.1mmol三乙胺和200μl超干dmso加入到5ml反应瓶中，氮气保护下反应10min；将上述步骤(1)中的反应液加入步骤(2)的反应液中，室温搅拌反应12h；
[0074]
(3)反应结束后，通过冻干浓缩反应液，然后加入蒸馏水稀释，用制备液相进行分离纯化。
[0075]
制备液相条件如下所示：
[0076]
使用agilent 1220infinity ii系列hplc系统配备agilent zorbax sb-c18半制备柱(9.4
×
250mm，5um)，梯度淋洗60分钟，流速2ml/min，其中流动相a为超纯水(体积分数为0.01％tfa/水溶液)，b为乙腈。
[0077]
淋洗梯度设定为：0-5分钟时，95％a和5％b；15分钟时，85％a和15％b；30分钟时，70％a和30％b；45分钟时，50％a和50％b；60分钟时，10％a和90％b。
[0078]
最后制得的绿色产物经分析型hplc和esi-ms质谱分析确认为预期产物mpa-fap-1。ms结果如图3所示。
[0079]
在上述制备过程中，以固相合成的fap-x(x＝2、3、4)多肽替代步骤中使用的fap-1多肽，即得到其他多种具有肿瘤靶向光学成像功能的多肽化合物mpa-fap-2、mpa-fap-3、mpa-fap-4。
[0080]
实施例4荧光靶向探针mpa-fap-x(x＝1-4)对mcf-7细胞的体外亲和力实验
[0081]
(1)首先准备铺设12孔板，将生长状态良好且无染菌的mcf-7细胞消化，采用计数板计数法计数，每孔加入相同量的细胞于12孔板内，后放置在37℃、含5％ co2的细胞培养箱中培养24h。
[0082]
(2)细胞生长24h后，弃掉12孔板内的培养基，并加入500μl不含血清的新鲜dmem培养基，设置不同组别：空白组control、单一染料组mpa、加肽组，分别加入5μl的mpa和5μl的mpa-fap-x(x＝1,2,3,4)荧光靶向探针，初始浓度均为500μm，至最终在孔板内浓度为5μm，后继续于培养箱中，培养孵育2h。
[0083]
(3)流式前样品处理：弃掉孔板内的旧培养基，用0.05％的胰蛋白酶消化，加入含10％胎牛血清的培养基重悬，将细胞悬液转移至1.5ml ep管内，1200rpm离心5min，用500μl pbs缓冲液(ph7.2)洗涤3遍，最后加入500μl pbs缓冲液(ph7.2)重悬，备用。
[0084]
(4)流式细胞仪测定细胞荧光强度：设置流式细胞仪参数，流速为medium流速，细胞进样为40000个细胞。上样，测定每组荧光强度，及相对对照组与单一染料组的荧光强度。
[0085]
(5)数据处理：使用flowjo 7.0软件将原始数据做出峰图，并计算平均荧光强度(mean fluorescence intensity,mfi)。使用graphpad prism软件对平均荧光强度进行定量作图，并进行数据差异性分析。
[0086]
当探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值高，参见图4。体外亲和力实验结果显示：浓度相同的mpa-fap-x(x＝1-4)的探针分别与fap高表达的mcf-7细胞孵育后，本发明的fap-4与mcf-7的亲和力强度最大，但fap-1、fap-2、fap-3相较于空白对照组也有明显的亲和力。
[0087]
实施例5荧光靶向探针mpa-fap-1在乳腺癌mcf-7荷瘤鼠体内的光学成像
[0088]
将实施例3制备的荧光靶向探针mpa-fap-1溶于生理盐水溶液，配制成浓度为1mg/
1ml的溶液，通过尾静脉分别给3只乳腺癌mcf-7荷瘤裸鼠(体重约20克)注射探针mpa-fap-1溶液15μl，并于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h进行光学信号采集。观察mpa-fap-1荧光靶向探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。
[0089]
荧光靶向探针mpa-fap-1在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出，探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图5所示。其中，1h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0090]
实施例6荧光靶向探针mpa-fap-2在乳腺癌mcf-7荷瘤鼠体内的光学成像
[0091]
将实施例3制备的荧光靶向探针mpa-fap-2溶于生理盐水溶液，配制成浓度为1mg/1ml的溶液，通过尾静脉分别给3只乳腺癌mcf-7荷瘤裸鼠(体重约20克)注射探针mpa-fap-2溶液15μl，并于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。
[0092]
荧光靶向探针mpa-fap-2在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出，探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图6所示。其中，1h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0093]
实施例7荧光靶向探针mpa-fap-3在肺癌a549荷瘤鼠体内的光学成像
[0094]
将实施例3制备的荧光靶向探针mpa-fap-3溶于生理盐水溶液，配制成浓度为1mg/1ml的溶液，通过尾静脉分别给3只肺癌a549荷瘤裸鼠(体重约20克)注射探针mpa-fap-3溶液15μl，并于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。
[0095]
荧光靶向探针mpa-fap-3在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出，探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图7所示。其中，1h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0096]
实施例8荧光靶向探针mpa-fap-4在结直肠腺癌hct116荷瘤鼠体内的光学成像
[0097]
将实施例3制备的荧光靶向探针mpa-fap-4溶于生理盐水溶液，配制成浓度为1mg/1ml的溶液，通过尾静脉分别给3只结直肠腺癌hct116荷瘤裸鼠(体重约20克)注射探针mpa-fap-4溶液15μl，并于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。
[0098]
荧光靶向探针mpa-fap-4在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出，探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至12h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图8所示。其中，0.5h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
[0099]
以上药效学实验表明：本发明的多肽能和多种肿瘤细胞特异性结合，优选乳腺癌、结直肠癌、肺癌。利用靶向肽高亲和力特性可用于恶性肿瘤的光学成像。这些高亲和力多肽单体，多肽二聚体或者多肽的多聚体直接或间接的偶联荧光染料可作为肿瘤特异性靶向分子探针，预期能达到对肿瘤边界精准定位的效果，可为术前和术中影像导航带来实时性，具有提高手术精确度的优点。
[0100]
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

技术特征：
1.一种肿瘤亲和肽，其特征在于，所述肿瘤亲和肽的氨基酸序列为seq id no.1～4之一所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述的肿瘤亲和肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用。3.权利要求1所述的肿瘤亲和肽在制备肿瘤的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用。4.权利要求1所述的肿瘤亲和肽在制备肿瘤靶向药物载体中的应用。5.一种修饰的多肽，其特征在于，在权利要求1所述的任一肿瘤亲和肽的氨基酸序列n端连接m标记；其中，所述m标记为光标记或放射性核素标记。6.根据权利要求5所述的一种修饰的多肽，其特征在于，所述光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物或生物发光分子。7.根据权利要求5所述的一种修饰的多肽，其特征在于，所述放射性核素选自
99m tc、
68
ga，
64
cu，
67
ga，
90
y，
111
in、
177
lu或
125
i。8.权利要求5～7任一项所述的一种修饰的多肽在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂中的应用。9.权利要求5～7任一项所述的一种修饰的多肽在制备肿瘤的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，当m为荧光标记时，所述的修饰的多肽为一种荧光分子影像探针。

技术总结
本发明公开了一种肿瘤亲和肽及其应用。本发明的肿瘤亲和肽为模拟FAP(成纤维细胞激活蛋白)的高亲和力的多肽，可用于靶向成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在本发明肿瘤亲和肽的氨基酸N端连接M标记，可获得一种修饰的多肽。本发明肿瘤亲和肽与修饰的多肽能够用于制备肿瘤诊断试剂，制备肿瘤的荧光成像试剂或放射性显像试剂，制备肿瘤靶向药物载体。制备肿瘤靶向药物载体。制备肿瘤靶向药物载体。


技术研发人员：顾月清 尚乾 韩智豪 菅富元 聂振凯 祖丽阿依
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/13