酸响应嵌段共聚物、其响应胶束、制备方法和应用与流程

1.本发明属于纳米药物制剂领域，具体涉及一种靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物、其响应胶束、制备方法和应用。


背景技术：

2.乳腺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，是由乳腺上皮细胞无限增殖导致的恶性肿瘤。根据世界卫生组织最新发布的数据显示，2020年乳腺癌新发病例高达230万，占女性癌症新发病例的24.5％，已经取代肺癌成为全球第一大癌症。而我国乳腺癌的发病情况更加不容乐观，新发病例和死亡病例均居世界首位。乳腺癌可分为不同亚型，其中雌激素受体(estrogen receptor，er)阳性乳腺癌最为常见，占乳腺癌患者的70％以上，转移后5年生存率较低，因此对于此类乳腺癌的治疗尤为重要。
3.现阶段，国内外临床上针对er阳性乳腺癌的治疗主要采用以氟维司群等为代表的药物进行内分泌治疗。氟维司群是er的竞争性拮抗剂，可有效屏蔽雌激素对癌细胞的促增殖效应，并下调er的表达。然而，氟维司群的长期使用会导致几乎所有的患者产生继发性耐药，并且部分从未接受过氟维司群治疗的患者也可形成原发性耐药，进一步降低了内分泌治疗的效果。另一方面，氟维司群溶解性差，必须溶解在乙醇、苯甲醇与蓖麻油的混合溶剂中，方可采用臀部肌肉注射的方式给药。给药时，需连续缓慢肌注两支5ml的注射液，每支注射时长不得短于2分钟，此过程将导致严重的疼痛，显著降低患者的用药依从性。另一方面，临床上对于此类大体积的肌肉注射对专业技能要求极高，据统计肌肉注射的成功率仅为32％～52％。而且蓖麻油的存在使得注射液十分粘稠，造成注射部位肿胀结节，严重时甚至会发生坏死和溃疡，加之药物的毒副作用进一步降低了患者的依从性。因此，临床上针对er阳性乳腺癌采用的内分泌治疗仍存在着易耐药和依从性差的缺点，迫切需要发展出新的给药剂型或给药策略。
4.研究表明，氟维司群耐药的分子机制与细胞周期具有十分密切的关系。尤其是cdk4与cdk6在促进乳腺癌细胞增殖与耐药形成中发挥着至关重要的作用，这一现象在多数乳腺癌患者(≥50％)中均存在，因此抑制cdk4/cdk6的活性成为克服氟维司群耐药的新兴策略。临床实验同样表明，在氟维司群的基础上联合cdk4/cdk6的抑制剂，可提高氟维司群耐药患者的治疗效果，显著延长患者的无进展生存期。目前，最新一代的cdk4/cdk6抑制剂为阿贝西利(abemacilib)，其与氟维司群联用可起到良好的乳腺癌抑制效果，然而阿贝西利与氟维司群的水溶性严重限制了联合给药策略的生物利用度与疗效。
5.近年来，纳米技术的兴起为解决上述问题提供了新的思路，但er阳性乳腺癌的临床治疗手段仍以手术切除、放化疗、内分泌治疗等传统方式为主，智能响应型纳米递药策略尚未有突破性进展。目前，纳米体系用于递送氟维司群的研究鲜有报道。例如，聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇与聚己内酯-聚乙二醇可包载氟维司群并自组装成纳米颗粒，但药物释放不完全且十分缓慢，50天后仍只释放出30％的氟维司群，体外细胞实验验证了该聚合物递送体系的抗肿瘤活性。介孔二氧化硅也可用于氟维司群的包载，但并未对其进行任何抗肿瘤
效果的评估。上述仅有的几项研究主要聚焦于载体的构建与表征，对于载体的生物学功能关注较少，缺少或只在细胞水平进行了简单的药效评价，并未在活体水平进行药效研究，也未关注肌肉注射造成疼痛的问题，与真实的临床应用相差甚远。因此，如何利用纳米技术寻找有效的乳腺癌治疗策略，可为众多乳腺癌患者带来希望，受益人群庞大，具有重大的社会意义。


技术实现要素：

6.因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物、其响应胶束、制备方法和应用，以解决氟维司群溶解性差、疗效有效且易耐药、毒副作用大、依从性低等缺点。通过借助纳米技术的优势，设计并构建可经静脉注射的氟维司群新剂型，该纳米药物可主动靶向在肿瘤组织富集，并响应微酸环境发生解体从而定点释药，增强肿瘤杀伤效果，并降低毒副作用。
7.在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
8.术语“pd-1/pd-l1单抗”是指：程序性死亡受体1或程序性死亡受体配体1。
9.术语“rgd motif”是指：rgd片段。
10.术语“pae”是指：聚-β氨基酯。
11.术语“peg”是指：聚乙二醇。
12.术语“fmoc”是指：9-芴甲氧羰基。
13.术语“fmoc-peg-oh”是指：9-芴甲氧羰基-聚乙二醇-羟基。
14.术语“fmoc-peg-pae”是指：9-芴甲氧羰基-聚乙二醇-聚β氨基酯。
15.术语“nhs-c6-mal”是指：n-(6-马来酰亚胺己酸)琥珀酰亚胺。
16.术语“peg-pae”是指：聚乙二醇-聚β氨基酯
17.术语“nhs-peg-oh”是指：琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-羟基。
18.术语“pae-peg-nhs”是指：聚β氨基酯-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯术语“pae-peg-nh
2”是指：聚β氨基酯-聚乙二醇-氨基。
19.术语“pae-peg-mal”是指：聚β氨基酯-聚乙二醇-马来酰亚胺。
20.术语“michael加成反应”是指：迈克尔加成反应，亲电的共轭体系(电子受体)与亲核的负碳离子(电子给体)进行的共轭加成反应。
21.术语“pae-peg-crgd”是指：靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物。
22.术语“saline”是指：生理盐水。
23.术语“er”是指：雌激素受体(estrogen receptor)。
24.术语“ppfa”是指：载带有氟维司群与阿贝西利的酸响应胶束。
25.术语“ppfa-mrgd”是指：载带有氟维司群与阿贝西利且具有突变肽修饰的酸响应胶束。
26.术语“ful+abe”是指：游离的氟维司群与阿贝西利。
27.术语“ppae-f-crgd”是指：载带有氟维司群且具有crgd肿瘤靶向肽修饰的酸响应胶束
28.术语“ppae-a-crgd”是指：载带有阿贝西利且具有crgd肿瘤靶向肽修饰的酸响应胶束。
29.术语“ppae-crgd”是指：空载的且crgd肿瘤靶向肽修饰的酸响应胶束。
30.术语“ppfa-crgd”是指：载带有氟维司群与阿贝西利且具有crgd肿瘤靶向肽修饰的酸响应胶束。
31.为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物，所述靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物包括肿瘤靶向肽与嵌段共聚物片段；其中，
32.所述肿瘤靶向肽为整合素受体靶向肽，所述嵌段共聚物片段包括亲水性片段和酸响应片段。
33.根据本发明第一方面的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物，其中，
34.所述整合素受体靶向肽为环肽，优选为其内含有一个d型氨基酸，由头尾部连接以肽键成环的单环活性肽，更优选为环状五肽；
35.所述亲水性片段选自以下一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚丙烯酸，优选选自以下一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺，更优选为聚乙二醇或聚乙烯亚胺，最优选为聚乙二醇；和/或
36.所述酸响应片段为含有酸响应基团或化学键的聚合物片段，优选选自以下一种或多种：含有席夫碱结构的聚合物、含有可质子化基团的聚合物、含有β-羧酸酰胺键的聚合物、含有缩酮或缩醛结构的聚合物、含有原酸酯键的聚合物，更优选选自以下一种或多种：含有季铵基团的聚合物、含有苯甲亚胺键的聚合物、含有酰腙键的聚合物、含有2，3-二甲基马来酸酐的聚合物、聚-β氨基酯、聚组氨酸、聚甲基丙烯酸，最优选为聚-β氨基酯；
37.优选地，所述环状五肽的序列选自以下一种或多种：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6，更优选选自以下一种或多种：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4，进一步优选为seq id no.1或seq id no.2，最优选为seq id no.1。
38.根据本发明第一方面的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物，其中，
39.所述靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物具有通式i所示的结构：
[0040][0041]
式i中：
[0042]
x为亲水性片段单体的个数，优选为1～1000，更优选为1～500，进一步优选为10～100；
[0043]
y为酸响应片段单体的个数，优选为1～1000，更优选为1～500，进一步优选为10～50；
[0044]
优选地，所述肿瘤靶向肽通过化学键与嵌段共聚物片段的亲水性片段部分通过化学键发生共价连接；
[0045]
更优选地，所述肿瘤靶向肽与马来酰亚胺修饰的聚乙二醇通过巯基与马来酰亚胺间发生亲和加成反应生成稳定的硫醚键，从而共价连接。
[0046]
本发明的第二方面提供了一种氟维司群酸响应胶束，所述氟维司群酸响应胶束包括：第一方面所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物与药物形成的纳米颗粒；其中，
[0047]
所述药物包括氟维司群和氟维司群以外的其他抗肿瘤药物；
[0048]
优选地，所述其他抗肿瘤药物选自以下一种或多种：烷化剂类药物、抗肿瘤抗生素、激素类药物、金属铂类药物、生物活性肽、细胞因子、抗体、抗代谢药物，更优选选自以下一种或多种：阿贝西利、哌柏西利、达尔西利、瑞博西利、阿那曲唑、阿培利司、依维莫司、pd-1/pd-l1单抗，进一步优选选自以下一种或多种：阿贝西利、哌柏西利、达尔西利、瑞博西利、阿那曲唑、阿培利司，更进一步优选选自以下一种或多种：阿贝西利、哌柏西利、达尔西利、瑞博西利，最优选为阿贝西利。
[0049]
根据本发明第二方面的氟维司群酸响应胶束，其中，所述氟维司群酸响应胶束的粒径为10～1000nm，优选为10～500nm，更优选为10～250nm，进一步优选为50～200nm。
[0050]
本发明的第三方面提供了制备第一方面所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0051]
(1)制备pae-peg-nh2；
[0052]
(2)制备聚合物pae-peg-mal；
[0053]
(3)将步骤(2)制备的聚合物pae-peg-mal与肿瘤靶向肽反应，得到所述靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物。
[0054]
根据本发明第三方面的方法，其中，所述步骤(1)中还包括：以fmoc-peg-oh为原料，与丙烯酰氯反应，再向中间产物中加入试剂反应得到fmoc-peg-pae，最后脱fmoc得到pae-pae-nh2；
[0055]
优选地，fmoc基团为保护基团；和/或
[0056]
优选地，所述试剂为1,6-双(丙烯酰氧基)己烷和/或1,3-二(4-哌啶)丙烷。
[0057]
根据本发明第三方面的方法，其中，
[0058]
所述步骤(2)中还包括：引入马来酰亚胺基团修饰得到聚合物pae-peg-mal；优选地，所述修饰的试剂选自以下一种或多种：nhs-c6-mal、nhs-c7-mal、nhs-c8-mal，更优选为nhs-c6-mal或nhs-c7-mal，最优选为nhs-c6-mal；和/或
[0059]
所述步骤(3)中：所述反应为加成反应，优选为巯基与马来酰亚胺间的michael加成反应。
[0060]
本发明的第四方面提供了制备第二方面所述的氟维司群酸响应胶束方法，所述方法包括：
[0061]
(4)将步骤(3)中得到的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物与药物在超声条件下，借助于疏水作用，形成胶束，将药物包载于内部；
[0062]
优选地，所述超声的时间为0.5～30min，更优选为0.5～20min，进一步优选为0.5～10min。
[0063]
本发明的第五方面提供了第一方面所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物或第二方面所述的氟维司群酸响应胶束在制备用于治疗抗乳腺癌药物中的应用；
[0064]
优选地，所述乳腺癌为激素受体阳性乳腺癌；
[0065]
更优选地，所述乳腺癌为激素受体阳性人类表皮生长因子受体2阴性乳腺癌；
[0066]
进一步优选地，所述乳腺癌为激素受体阳性人类表皮生长因子受体2阴性的局部晚期或转移性乳腺癌。
[0067]
本发明提供了一种肿瘤靶向肽，所述肿瘤靶向肽为环状五肽，其氨基酸序列如seq id no.1～6所示的氨基酸序列：
[0068]
seq id no.1：cyclo(arg-gly-asp-dphe-cys)，即c(rgdfc)(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状(cyclo)，因此，seq id no.1以说明书此处记载的序列信息为准)。
[0069]
seq id no.2：cyclo(arg-gly-asp-dtyr-cys)，即c(rgdyc)(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状(cyclo)，因此，seq id no.2以说明书此处记载的序列信息为准)。
[0070]
seq id no.3：cyclo(arg-gly-asp-dphe-lys)，即c(rgdfk)(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状(cyclo)，因此，seq id no.3以说明书此处记载的序列信息为准)。
[0071]
seq id no.4：cyclo(arg-gly-asp-dtyr-lys)，即c(rgdyk)(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状(cyclo)，因此，seq id no.4以说明书此处记载的序列信息为准)。
[0072]
seq id no.5：cyclo(arg-gly-asp-dphe-glu)，即c(rgdfe)((由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状(cyclo)，因此，seq id no.5以说明书此处记载的序列信息为准)。
[0073]
seq id no.6：cyclo(arg-gly-asp-dtyr-glu)，即c(rgdye)((由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状(cyclo)，因此，seq id no.6以说明书此处记载的序列信息为准)。
[0074]
根据本发明的一个具体实施方案，本发明第一方面提供了一种靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物及其合成方法，所述的嵌段共聚物包括肿瘤靶向肽与嵌段共聚物片段。
[0075]
优选地，所述肿瘤靶向肽为整合素受体靶向肽。
[0076]
优选地，所述整合素受体靶向肽为环肽。
[0077]
优选地，所述环状整合素受体靶向肽为环状五肽，即是一种由头尾部连接以肽键成环的单环活性肽，其内含有一个d型氨基酸，具体序列为cyclo(arg-gly-asp-dphe-cys)，即c(rgdfc)。
[0078]
优选地，嵌段共聚物包含了亲水部分为聚乙二醇((poly(ethylene glycol),peg))，酸响应片段为含有酸响应基团或化学键的聚合物片段。
[0079]
优选地，具有酸响应片段为聚(β-氨基酯)，(poly(β-amino ester),pae)，其在中型环境下为疏水性，从而形成胶束体系将氟维司群与另一种药物共同包载于内部，而在肿瘤微酸环境下，可发生质子化，从而pae部分转变为亲水性，胶束破裂，释放出载带的药物。
[0080]
优选地，c(rgdfc)通过化学键与两亲性聚合物片段的聚乙二醇部分通过化学键发生共价连接。
[0081]
优选地，c(rgdfc)与马来酰亚胺修饰的聚乙二醇通过巯基与马来酰亚胺间发生亲和加成反应生成稳定的硫醚键，从而共价连接。
[0082]
优选地，所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物具体结构为pae-peg-crgd。
[0083]
优选地，所述pae-peg-crgd中pae与peg部分的分子量均为1kd～20kd。
[0084]
优选地，所述pae-peg-crgd中pae与peg部分的分子量分别为5kd与10kd。
[0085]
优选地，该靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物的合成方法如下：
[0086][0087]
其中x为乙二醇单体的个数，y为β-氨基酯单体的个数。
[0088]
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物自组装形成纳米药物递送体系的制备方法。
[0089]
本发明，采取乳化法，从而形成载有两种药物的胶束纳米颗粒。
[0090]
优选地，两种药物包括氟维司群与另一种抗肿瘤药物，其包括化疗药物或免疫药物等等。
[0091]
优选地，本发明中两种药物为氟维司群与阿贝西利
[0092]
优选地，所述氟维司群聚合物胶束的粒径为10 1000nm，例如可以是10nm、50nm、100nm、150nm、200nm、500nm、1000nm等。
[0093]
优选地，胶束的自组装过程需将聚合物材料和药物溶于二氯甲烷，在分散与水中，经超声而乳化形成的胶束，超声功率为10-200w，时长为0.5-30分钟。
[0094]
优选地，上述乳化过程中所涉及的二氯甲烷需在形成胶束后，旋蒸除去。
[0095]
本发明提供的制备方法合成简单、载药量大、释药持久且粒径均一。
[0096]
第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的氟维司群聚合物胶束在乳腺癌治疗中的应用。
[0097]
根据本发明的另一个具体的实施方案，本发明提供了一种氟维司群酸响应胶束，所述的氟维司群酸响应胶束包括肿瘤靶向肽修饰的酸响应材料单体与药物形成的纳米颗
粒；
[0098]
所述的酸响应材料包含亲水性片段和酸响应片段；
[0099]
所述酸响应片段为聚-β氨基酯(poly(β-amino ester),pae)；
[0100]
所述亲水性片段为聚乙二醇(poly(ethylene glycol),peg)；
[0101]
所述肿瘤靶向肽为整合素受体靶向肽，所述整合素受体靶向肽为环肽，序列；
[0102]
为精氨酸甘氨酸天冬氨酸-d型苯丙氨酸-半胱氨酸；
[0103]
所述靶向肽修饰的酸响应聚合物的结构式如下图所示：
[0104][0105]
利用肿瘤靶向肽修饰的酸响应聚合物形成的胶束体系，将氟维司群与另一种药物共同靶向递送到肿瘤组织，并响应肿瘤微酸环境，释放出药物，发挥抗肿瘤作用。
[0106]
所述氟维司群聚合物胶束的制备方法包括以下步骤：
[0107]
(1)以fmoc-peg-oh为原料，将其与丙烯酰氯反应，再向中间产物中加入1,6-双(丙烯酰氧基)己烷和1,3-二(4-哌啶)丙烷发生反应得到fmoc-peg-pae，最后脱fmoc得到pae-peg-nh2；
[0108]
(2)进一步引入马来酰亚胺基团修饰得到聚合物pae-peg-mal；
[0109]
(3)pae-peg-mal进一步与crgd环肽发生加成反应，从而得到crgd靶向肽修饰的酸响应的两亲性嵌段聚合物pae-peg-crgd；
[0110]
(5)将步骤(3)中得到的pae-peg-crgd与氟维司群及另一种抗肿瘤药物在超声条件下，借助于疏水作用，形成胶束，将药物包载于内部。
[0111]
步骤(1)中所述的保护基团为fmoc基团。
[0112]
步骤(2)中所述的偶联试剂为nhs-c6-mal。
[0113]
步骤(3)中所述的偶联反应为巯基与马来酰亚胺间的michael加成反应。
[0114]
步骤(4)中所述的超声时间为1-30min，所述的所述的药物为氟维司群与另一种抗肿瘤药物。
[0115]
本发明还提供了氟维司群胶束在制备抗乳腺癌药物中的应用。
[0116]
在本发明中，可将该酸响应胶束体系作为递送平台，实现氟维司群与其他多种药物的联合递送，实现两种药物的协同增效，制备成为肿瘤治疗的药物组合物，发挥抗肿瘤效果。
[0117]
发明提供了一种氟维司群给药新剂型及其制备方法与应用。本发明提供了一种氟维司群酸响应胶束递送系统，用于雌激素受体阳性乳腺癌的治疗。该递送系统包括：药物与酸响应材料。药物为氟维司群与另一种以阿贝西利为代表的多种抗肿瘤药物；酸响应材料包括聚-β氨基酯等具有酸响应能力的材料的一种或多种。本发明的氟维司群胶束新剂型可以较高的包封率与载药量分别将氟维司群与另一种化疗药包载于胶束的疏水内核之中，该胶束具有良好的稳定性，可将氟维司群与另一种化疗药物靶向共递送至肿瘤组织，并响应微酸环境释放药物，在特异性地实现对肿瘤细胞高效杀伤的同时，避免了对正常组织的毒
副作用，生物相容性好，具有非常广阔的应用前景。
[0118]
整合素作为一类普遍存在的细胞黏附因子，为细胞表面的异二聚体跨膜糖蛋白受体。研究表明，整合素特别是αvβ3在多种肿瘤细胞中过表达,在肿瘤的增殖、侵袭与转移等生理过程中发挥着至关重要的，是肿瘤诊断及治疗的理想靶点。由于整合素αvβ3可以特异性识别精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arg-gly-asp，rgd)序列，因此含有rgd序列的靶向肽被研发以用于靶向整合素αvβ3。此类rgd靶向肽根据结构可分为直链和环状两种，二者均具有良好的整合素靶向能力，但环状rgd多肽靶向能力更强。而且与直链肽相比，一方面环状多肽分子结构的刚性得到增强，另一方面由于精氨酸中的胍基与天冬氨酸的羧基之间的盐桥可防止多肽被降解，因此环状多肽的稳定性要显著强于直链多肽。本发明人团队进一步将rgd环肽中的苯丙氨酸或酪氨酸替换为d型氨基酸，可再次提高环状rgd多肽的稳定性。
[0119]
本发明的氟维司群酸响应胶束可以具有但不限于以下有益效果：
[0120]
本发明从氟维司群临床应用中存在的实际问题(易耐药、患者依从性低以及药代动力学差等)出发，选择生物相容性较好的纳米材料，发展可有效改善氟维司群疗效的纳米载药体系，以期研发出一种氟维司群给药的新剂型。本发明中可响应肿瘤微酸环境的聚(β-氨基酯)(poly(β-amino ester),pae)作为疏水部分，聚乙二醇(poly(ethylene glycol),peg)作为亲水部分，构筑酸响应嵌段共聚物(pae-peg)，并修饰上肿瘤靶向肽(crgd环肽)，从而得到同时具有酸响应特性以及肿瘤细胞靶向能力的嵌段共聚物(pae-peg-crgd)。该聚合物可通过疏水作用自组装成为胶束，将氟维司群与阿贝西利包载于内部，得到载药的纳米药物(ppfa-crgd)。本发明提供的纳米药物表面的crgd可与肿瘤细胞表面的整合素特异性结合，从而在肿瘤组织富集。当进入肿瘤组织后，其可响应微酸环境，pae部分发生质子化，从疏水性转化为亲水性，胶束发生解体并快速释放出药物分子。一方面，氟维司群与阿贝西利的共递送可避免耐药的产生，协同增效；另一方面相比于长期低剂量的药物作用，纳米药物解体诱导的短期高剂量的药物突释，可在肿瘤细胞形成耐药前便将其消灭。与以往研究相比，本发明在细胞水平进行疗效验证的基础上，首次在荷瘤小鼠活体水平进行抗肿瘤效果评价。而且本发明提供的纳米药物可通过静脉注射给药，从而避免肌注造成的严重疼痛，为氟维司群提供了一种全新的给药途径，有效改善氟维司群易耐药、依从性低、药代动力学差等缺点。本发明具有十分重要的临床应用价值，或将为雌激素受体阳性乳腺癌的临床治疗提供新的策略。
附图说明
[0121]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0122]
图1示出了本发明的氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的形貌表征(标尺为100nm)。
[0123]
图2示出了本发明合成的ppfa-crgd的药物释放曲线；其中，图2a为氟维司群的释放曲线，表示出ppfa-crgd可响应微酸环境释放出氟维司群；图2b为阿贝西利的释放曲线，表示出了阿贝西利ph依赖性的释放行为。
[0124]
图3示出了本发明ppfa-crgd肿瘤细胞杀伤能力。
[0125]
图4示出了本发明ppfa-crgd活体肿瘤组织靶向能力。
[0126]
图5示出了本发明ppfa-crgd在人源肿瘤异种移植(patient derived tumor xenograft,pdx)模型中的治疗效果。
[0127]
图6示出了氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的示意图；其中，图6a示出了ppfa-crgd胶束的制备过程；图6b示出了ppfa-crgd靶向肿瘤组织后，响应微酸环境释放出药物，进而杀伤肿瘤细胞的作用机制。
具体实施方式
[0128]
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0129]
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
[0130]
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
[0131]
试剂：
[0132]
阿贝西利、氟维司群，均购自selleck生物科技有限公司。
[0133]
十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，购自上海麦克林生化科技股份有限公司。
[0134]
二氯甲烷、醋酸铀、透析袋、pbs(磷酸盐缓冲液)、均购买自上海吉至生化科技有限公司。
[0135]
cell counting kit-8(cck)溶液购自日本同仁化学研究所。
[0136]
nod-scid小鼠与裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0137]
仪器：
[0138]
细胞超声破碎仪，型号jy92
‑ⅱ
d，购自宁波新芝生物科技有限公司。
[0139]
旋转蒸发仪，型号re52cs型，购自上海亚荣生化仪器厂。
[0140]
透射电镜，型号ht7700，购自日本hitachi公司。
[0141]
高效液相色谱仪，型号lc-20at，购自日本shimadzu公司。
[0142]
低温高速离心机，型号multifuge x1 pro，购自美国赛默飞世尔(thermo fisher)科技公司。
[0143]
小动物光学3d活体成像系统，型号ivis spectrum，购自美国珀金埃尔默(perkinelmer)。
[0144]
实施例1
[0145]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的制备方法。
[0146]
本实施例所使用的环状五肽为seq id no.1所示的序列：cyclo(arg-gly-asp-dphe-cys)，即c(rgdfc)。
[0147]
称取2.0g fmoc-peg-oh溶于20ml三氯甲烷中，加入丙烯酰氯和三乙胺，室温下搅拌反应12h，即得fmoc-peg-丙烯。称取2.0g fmoc-peg-丙烯溶于20ml三氯甲烷中，加入1,6-双(丙烯酰氧基)己烷和1,3-二(4-哌啶)丙烷，55℃下搅拌反应48h，纯化后可得fmoc-peg-pae。脱fmoc保护基团后得到pae-peg-nh2。其与nhs-6-mal溶解于三氯甲烷，加入三乙胺，室温反应12h，纯化后得pae-peg-mal。100mg pae-peg-mal溶于5ml dmf，加入crgd溶解完全，室温反应12h，透析24h后(截留分子量3500da)，冷冻干燥即得pae-peg-crgd。
[0148]
将120mg的peg-pae和60mg的pae-peg-crgd分别溶解在2ml二氯甲烷中。加入阿贝
西利6mg和氟维司群3mg，加入去离子水7.5ml。用探头超声仪作用1min后进行乳化(100w，工作5s，间歇5s)。然后于37℃下通过旋转蒸发30min去除有机溶剂，得到载药聚合物胶束(ppfa-crgd)。然后，以15000g离心5分钟收集纳米颗粒，并用纯水洗涤3次。使用前用0.22μm滤膜灭菌。
[0149]
实施例2
[0150]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的制备方法。
[0151]
本实施例的方法步骤同实施例1，不同之处在于本实施例所使用的环状五肽为seq id no.2所示的序列：cyclo(arg-gly-asp-dtyr-cys)，即c(rgdyc)。
[0152]
实施例3
[0153]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的制备方法。
[0154]
本实施例所使用的环状五肽为seq id no.3所示的序列：cyclo(arg-gly-asp-dphe-lys)，即c(rgdfk)。
[0155]
称取2.0g nhs-peg-oh溶于20ml三氯甲烷中，加入丙烯酰氯和三乙胺，室温下搅拌反应12h，即得nhs-peg-丙烯。称取2.0g nhs-peg-丙烯溶于20ml三氯甲烷中，加入1,6-双(丙烯酰氧基)己烷和1,3-二(4-哌啶)丙烷，55℃下搅拌反应48h，纯化后可得nhs-peg-pae。100mg pae-peg-nhs溶于5ml dmf，加入crgd溶解完全，室温反应12h，透析24h后(截留分子量3500da)，冷冻干燥即得pae-peg-crgd。
[0156]
将120mg的pae-peg和60mg的pae-peg-crgd分别溶解在2ml二氯甲烷中。加入阿贝西利6mg和氟维司群3mg，加入去离子水7.5ml。用探头超声仪作用1min后进行乳化(100w，工作5s，间歇5s)。然后于37℃下通过旋转蒸发30min去除有机溶剂，得到载药聚合物胶束(ppfa-crgd)。然后，以15000g离心5分钟收集纳米颗粒，并用纯水洗涤3次。使用前用0.22μm滤膜灭菌。
[0157]
实施例4
[0158]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的制备方法。
[0159]
本实施例的方法步骤同实施例3，不同之处在于本实施例所使用的环状五肽为seq id no.4所示的序列：cyclo(arg-gly-asp-dtyr-lys)，即c(rgdyk)。
[0160]
实施例5
[0161]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的制备方法。
[0162]
本实施例所使用的环状五肽为seq id no.5所示的序列：cyclo(arg-gly-asp-dphe-glu)，即c(rgdfe)。
[0163]
按照实施例1中的条件合成纯化得pae-peg-nh2后，100mg pae-peg-nh2溶于5ml dmf，加入该靶向肽溶解完全，室温反应12h，透析24h后(截留分子量3500da)，冷冻干燥即相应的pae-peg-crgd。进一步按照实施例1中相同的方法制备载药聚合物胶束(ppfa-crgd)
[0164]
实施例6
[0165]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的制备方法。
[0166]
本实施例的方法步骤同实施例5，不同之处在于本实施例所使用的环状五肽为seq id no.6所示的序列：cyclo(arg-gly-asp-dtyr-glu)，即c(rgdye)。
[0167]
实施例1-6制备的氟维司群酸响应胶束，因seq id no.1～seq id no.6所示的rgd环肽中半胱氨酸或赖氨酸的存在赋予体系游离的巯基或氨基从而使得这6种环状靶向肽均
可便捷高效地与多种功能分子进行偶联，因此仅以示例性地选择实施例1制备的氟维司群酸响应胶束进行以下试验，但是本领域技术人员应当理解实施例7-10的试验结果同样适用于实施例2-6。
[0168]
实施例7
[0169]
本实施例用来说明氟维司群酸响应胶束ppfa-crgd的表征及药物的ph响应性释放。
[0170]
(1)将实施例1中得到ppfa-crgd进行表征
[0171]
形貌表征：氟维司群聚合物胶束经醋酸铀染色后，采用透射电镜对其形貌进行表征，如图1所示，纳米胶束为球形，粒径较为均一，平均粒径约为100nm。
[0172]
(2)药物的ph响应性释放：在含有0.1％十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的磷酸盐缓冲液(pbs)中，分别在ph 5.0、6.5和7.4的条件下进行了氟维斯群和阿贝西利的体外释放实验。将制备的ppfa-crgd与10ml pbs在透析袋中进行透析，截留分子量为10kd，37℃，100rpm摇动。在指定时间点采集透析液(100μl)样品，加入等量pbs。用高效液相色谱法测定释放药物的浓度，并对照标准曲线进行定量。所得药物释放曲线如图2所示。由图2可说明本发明提供的氟维司群聚合物胶束可响应微酸环境，快速释放出载带的氟维司群与阿贝西利，呈现出ph依赖与时间依赖的释药特性。
[0173]
实施例8
[0174]
本实施例用来评价ppfa-crgd对雌激素受体阳性乳腺癌细胞的杀伤效果,具体步骤如下:
[0175]
将mcf-7细胞接种于96孔板内(3000细胞/每孔)，在对数生长期内，向孔板内加入不同组别的药物。处理24h后，将培养基吸出，加入100μl含有10％的cell counting kit-8(cck)溶液，孵育约1个小时后，于450nm处测定吸光度。由图3可说明，ppfa-crgd对mcf-7细胞具有很强的杀伤能力。
[0176]
实施例9
[0177]
本实施例用来评价纳米药物ppfa-crgd的活体肿瘤靶向能力,具体步骤如下:
[0178]
将cy5.5标记的ppfa(无靶向肽修饰组)、ppfa-mrgd(突变肽修饰组)ppfa-crg(靶向肽修饰组)以及游离的cy5.5溶液经静脉注射于mcf-7乳腺癌模型鼠(n＝3)体内。在注射后的特定时间点，麻醉小鼠后采用活体成像系统对小鼠进行全身荧光成像。所得结果如图4所示，ppfa-crgd组具有十分明显的肿瘤组织靶向能力，从而特异地将药物递送到肿瘤组织。
[0179]
实施例10
[0180]
本实施例通过构建人乳腺癌患者来源异种移植瘤(pdx)模型来评价实施例1中得到ppfa-crgd的活体抗肿瘤疗效，具体步骤如下：
[0181]
取雌激素受体阳性肿瘤组织，移植于nod-scid小鼠乳房脂肪垫内，待肿瘤组织长大后，收集肿瘤组织并继续接种于裸鼠乳房垫，从而成功构建pdx模型。当肿瘤体积约为100mm3时，小鼠随机分为7组(n＝6)。分别给予生理盐水、ppae-crgd、ful+abe、ppae-f-crgd、ppae-a-crgd、ppfa-mrgd、ppfa-crgd治疗，共治疗5次，每隔2天用游标卡尺监测肿瘤大小。如图5所示，相比于其他各组，ppfa-crgd能够有效地抑制肿瘤的生长。
[0182]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米药物及其制备方法和应
用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0183]
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

技术特征：
1.一种靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物，其特征在于，所述靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物包括肿瘤靶向肽与嵌段共聚物片段；其中，所述肿瘤靶向肽为整合素受体靶向肽，所述嵌段共聚物片段包括亲水性片段和酸响应片段。2.根据权利要求1所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物，其特征在于：所述整合素受体靶向肽为环肽，优选为其内含有一个d型氨基酸，由头尾部连接以肽键成环的单环活性肽，更优选为环状五肽；所述亲水性片段选自以下一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚丙烯酸，优选选自以下一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺，更优选为聚乙二醇或聚乙烯亚胺，最优选为聚乙二醇；和/或所述酸响应片段为含有酸响应基团或化学键的聚合物片段，优选选自以下一种或多种：含有席夫碱结构的聚合物、含有可质子化基团的聚合物、含有β-羧酸酰胺键的聚合物、含有缩酮或缩醛结构的聚合物、含有原酸酯键的聚合物，更优选选自以下一种或多种：含有季铵基团的聚合物、含有苯甲亚胺键的聚合物、含有酰腙键的聚合物、含有2，3-二甲基马来酸酐的聚合物、聚-β氨基酯、聚组氨酸、聚甲基丙烯酸，最优选为聚-β氨基酯；优选地，所述环状五肽的序列选自以下一种或多种：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6，更优选选自以下一种或多种：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4，进一步优选为seq id no.1或seq id no.2，最优选为seq id no.1。3.根据权利要求1或2所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物，其特征在于，所述靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物具有通式i所示的结构：式i中：x为亲水性片段单体的个数，优选为1～1000，更优选为1～500，进一步优选为10～100；y为酸响应片段单体的个数，优选为1～1000，更优选为1～500，进一步优选为10～50；优选地，所述肿瘤靶向肽通过化学键与嵌段共聚物片段的亲水性片段部分通过化学键发生共价连接；更优选地，所述肿瘤靶向肽与马来酰亚胺修饰的聚乙二醇通过巯基与马来酰亚胺间发生亲和加成反应生成稳定的硫醚键，从而共价连接。4.一种氟维司群酸响应胶束，其特征在于，所述氟维司群酸响应胶束包括：权利要求1所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物与药物形成的纳米颗粒；其中，
所述药物包括氟维司群和氟维司群以外的其他抗肿瘤药物；优选地，所述其他抗肿瘤药物选自以下一种或多种：烷化剂类药物、抗肿瘤抗生素、激素类药物、金属铂类药物、生物活性肽、细胞因子、抗体、抗代谢药物，更优选选自以下一种或多种：阿贝西利、哌柏西利、达尔西利、瑞博西利、阿那曲唑、阿培利司、依维莫司、pd-1/pd-l1单抗，进一步优选选自以下一种或多种：阿贝西利、哌柏西利、达尔西利、瑞博西利、阿那曲唑、阿培利司，更进一步优选选自以下一种或多种：阿贝西利、哌柏西利、达尔西利、瑞博西利，最优选为阿贝西利。5.根据权利要求4所述的氟维司群酸响应胶束，其特征在于，所述氟维司群酸响应胶束的粒径为10～1000nm，优选为10～500nm，更优选为10～250nm，进一步优选为50～200nm。6.制备权利要求1至3中任一项所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备pae-peg-nh2；(2)制备聚合物pae-peg-mal；(3)将步骤(2)制备的聚合物pae-peg-mal与肿瘤靶向肽反应，得到所述靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中还包括：以fmoc-peg-oh为原料，与丙烯酰氯反应，再向中间产物中加入试剂反应得到fmoc-peg-pae，最后脱fmoc得到pae-pae-nh2；优选地，fmoc基团为保护基团；和/或优选地，所述试剂为1,6-双(丙烯酰氧基)己烷和/或1,3-二(4-哌啶)丙烷。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中还包括：引入马来酰亚胺基团修饰得到聚合物pae-peg-mal；优选地，所述修饰的试剂选自以下一种或多种：nhs-c6-mal、nhs-c7-mal、nhs-c8-mal，更优选为nhs-c6-mal或nhs-c7-mal，最优选为nhs-c6-mal；和/或所述步骤(3)中：所述反应为加成反应，优选为巯基与马来酰亚胺间的michael加成反应。9.制备权利要求4或5所述的氟维司群酸响应胶束方法，其特征在于，所述方法包括：(4)将步骤(3)中得到的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物与药物在超声条件下，借助于疏水作用，形成胶束，将药物包载于内部；优选地，所述超声的时间为0.5～30min，更优选为0.5～20min，进一步优选为0.5～10min。10.权利要求1至3中任一项所述的靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物或权利要求4或5所述的氟维司群酸响应胶束在制备用于治疗抗乳腺癌药物中的应用；优选地，所述乳腺癌为激素受体阳性乳腺癌；更优选地，所述乳腺癌为激素受体阳性人类表皮生长因子受体2阴性乳腺癌；进一步优选地，所述乳腺癌为激素受体阳性人类表皮生长因子受体2阴性的局部晚期或转移性乳腺癌。

技术总结
本发明提供了一种靶向肽修饰的酸响应嵌段共聚物、其响应胶束、制备方法和应用。本发明的氟维司群胶束新剂型可以较高的包封率与载药量分别将氟维司群与另一种化疗药包载于胶束的疏水内核之中，该胶束具有良好的稳定性，可将氟维司群与另一种化疗药物靶向共递送至肿瘤组织，并响应微酸环境释放药物，在特异性地实现对肿瘤细胞高效杀伤的同时，避免了对正常组织的毒副作用，生物相容性好，具有非常广阔的应用前景。可用于雌激素受体阳性乳腺癌的治疗。治疗。治疗。


技术研发人员：聂广军 李素萍 戚飞龙 李博朝
受保护的技术使用者：国家纳米科学中心
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/13