Tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用

tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.急性肾损伤(aki)是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征，主要表现为血清肌酐升高和/或尿量减少。约5％的住院患者可能发生aki，在重症监护室中aki的发生率高达30％，轻症患者仅出现轻度肾损伤，重症患者可出现严重的肾功能衰竭。由于目前仍无特异治疗aki的药物，因此患aki的患者的死亡率居高不下。aki是肾脏病中的危急重症。aki治疗主要包括尽早识别并纠正可逆病因、维持内环境稳定、营养支持、防治并发症及肾脏替代治疗等方面。积极治疗原发病，及时发现导致急性肾小管坏死的危险因素并加以去除，是防治aki的关键。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的新的应用，从而为特异性治疗aki提供有效的治疗靶点。
5.本发明是这样实现的：
6.第一方面，本发明提供了tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用，药物能够促进tiki2蛋白的表达。
7.wnt信号通路在肾脏疾病发生和发展过程中起重要作用，tiki2蛋白是一类wnt信号通路抑制分子。发明人研究发现：tiki2基因高表达于肾近端小管上皮细胞中，并且其在小管上皮细胞中的表达量与急性肾损伤的严重程度呈负相关。在小鼠肾近端小管上皮细胞中特异性敲除tiki2基因会加重单侧缺血再灌注损伤(uiri)诱导的小鼠急性肾损伤症状。发明人利用流体动力学的方法尾静脉注射tiki2表达质粒，可以缓解uiri手术诱导的急性肾损伤症状。这些研究结果表明，tiki2蛋白可以作为预防和/或治疗肾脏疾病的靶点，尤其是作为急性肾损伤的治疗靶点，增加tiki2蛋白在肾小管上皮细胞中的表达有可能治疗急性肾损伤。
8.针对tiki2蛋白研发的药物将有可能从根本上减缓并逆转肾脏疾病的病程，尤其是减缓并逆转急性肾损伤病程。
9.在本发明应用较佳的实施方式中，上述肾脏疾病为急性肾损伤。急性肾损伤包括缺血、感染、药物毒性等因素造成的急性肾损伤。
10.在一种可选的实施方式中，急性肾损伤是肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤。
11.在一种可选的实施方式中，上述药物能够促进肾小管上皮细胞中tiki2蛋白的表达。
12.在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括如下的作用：减少肾脏小管损伤。
13.在一种可选的实施方式中，降低肾脏损伤分子的表达。
14.在一种可选的实施方式中，降低肾脏损伤分子kim1的表达。
15.第二方面，本发明还提供了一种tiki2蛋白上调表达的促进剂在制备肾脏疾病的治疗药物中应用。
16.只要能促进tiki2蛋白上调表达的试剂、药物均可以作为上述的促进剂。
17.在一种可选的实施方式中，肾脏疾病为急性肾损伤；
18.在一种可选的实施方式中，急性肾损伤是肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤。
19.在一种可选的实施方式中，上述促进剂能够促进肾小管上皮细胞中tiki2蛋白上调表达。上述表达上调是指相对于正常的没有肾损伤疾病的对象而言，在肾小管上皮细胞中，患有肾损伤疾病的对象的肾小管上皮细胞中tiki2蛋白表达水平略有升高、升高或者明显升高均在本发明的保护范围之内。
20.第三方面，本发明还提供了一种用于治疗急性肾损伤的重组载体，其包括编码tiki2蛋白的核苷酸序列，其中，编码tiki2蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。
21.重组载体为pcdh-ha-tiki2。
22.第四方面，本发明还提供了一种治疗急性肾损伤的药物，其包括上述的重组载体。
23.第五方面，本发明还提供了一种重组载体在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，其包括能够编码tiki2蛋白的核苷酸序列，其中，编码tiki2蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。重组载体为pcdh-ha-tiki2。
24.在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物的剂型为片剂、胶囊剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、散剂、颗粒剂、注射剂、冻干粉针剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、软膏剂、洗剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂或贴剂。
25.在一种可选的实施方式中，药物的剂型为注射剂。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的添加剂或辅料。
27.在一种可选的实施方式中，药学上可接受的添加剂或辅料选自如下一种或多种：溶剂、缓冲液、乳化剂、悬浮剂、分解剂、崩解剂、分散剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润湿剂、润滑剂、吸收延迟剂、香味剂、甜味剂、色素以及脂质体。
28.在一种可选的实施方式中，药物还包括联用药物，联用药物例如选自延胡索乙素。延胡索乙素包括(-)-thp，(+)-thp及(
±
)-thp。有研究表明延胡索乙素对顺铂所致小鼠肾损伤具有很好的保护作用。
29.在本发明应用较佳的实施方式中，药物还包括药学上可接受的盐。
30.合适的药学可接受盐包括无机酸的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸和硫酸，以及有机酸的盐，所述有机酸例如甲磺酸、富马酸、马来酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、乳酸、柠檬酸、谷氨酸、乙酰水杨酸、烟酸、氨苯甲酸、d-酸、马尿酸、磷酸和门冬氨酸。优选的盐是盐酸盐或磷酸盐。
31.赋形剂可以是例如：水、乙醇、2-丙醇、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、右旋糖、糖蜜、淀粉、改性淀粉、明胶、山梨醇、肌醇、甘露醇、微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙酸纤维素、虫胶、鲸蜡醇、聚乙烯基吡咯烷酮、石蜡、
蜡、天然和合成橡胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、右旋糖酐、饱和和不饱和脂肪酸、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸甘油酯、月桂基硫酸钠、食用油、芝麻油、椰子油、花生油、大豆油、卵磷脂、乳酸钠、聚氧乙烯脂肪酸酯和聚氧丙烯脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯、山梨酸、苯甲酸、柠檬酸、抗坏血酸、鞣酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氧化镁、氧化锌、二氧化硅、氧化钛、二氧化钛、硫酸镁、硫酸锌、硫酸钙、碳酸钾、磷酸钙、磷酸二钙、溴化钾、碘化钾、滑石、高岭土、果胶、交聚维酮、琼脂和膨润土。
32.在本发明应用较佳的实施方式中，上述病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及慢病毒载体中的任一种。
33.在一种可选的实施方式中，病毒载体选自腺相关病毒载体；
34.在一种可选的实施方式中，腺相关病毒选自aav1～13中的任意一种或多种。
35.本发明具有以下有益效果：
36.本发明研究发现了一种治疗急性肾损伤的新靶点——tiki2。经实验表明，tiki2敲除可以显著加重单侧缺血再灌注损伤(uiri)诱导的小鼠急性肾损伤症状。利用流体动力学的方法尾静脉注射tiki2表达质粒，可以缓解uiri手术诱导的急性肾损伤症状。这些研究结果表明，tiki2蛋白可以作为急性肾损伤的治疗靶点，增加tiki2蛋白在肾小管上皮细胞中的表达有可能治疗急性肾损伤。针对tiki2蛋白研发的药物将有可能从根本上减缓并逆转肾脏疾病的病程，尤其是减缓并逆转急性肾损伤病程。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
38.图1为tiki2基因敲除鼠模型进行sham或uiri后的肾脏近端小管上皮细胞切片结果图；
39.图2为8-12周龄野生型(tiki2+/+)和纯合子(tiki2-/-)敲除小鼠建立单侧肾脏缺血再灌注模型后的左肾pas染色结果图以及评分统计结果图；
40.图3为8-12周龄野生型(tiki2+/+)和纯合子(tiki2-/-)敲除小鼠建立单侧肾脏缺血再灌注模型后的肾小管上皮细胞损伤分子kim1的免疫荧光分析和qpcr定量分析结果图；
41.图4为特异性tiki2敲除小鼠进行假手术和uiri手术后的肾近端小管上皮细胞切片图和损伤评分统计结果图；
42.图5为特异性tiki2敲除小鼠进行假手术和uiri手术后的肾小管上皮细胞损伤分子kim1的免疫荧光分析和qpcr定量分析结果图；
43.图6为tiki2过表达后的单侧肾脏缺血再灌注模型的左肾pas染色结果；
44.图7为tiki2过表达后的单侧肾脏缺血再灌注模型的肾小管上皮细胞损伤分子kim1的免疫荧光分析和qpcr定量分析结果图；
45.图8为免疫印迹实验验证ha-tiki2在小鼠肾脏中的蛋白表达水平的结果图。
具体实施方式
46.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
47.除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
48.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
49.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
50.实施例1
51.本实施例利用同源重组的方法构建了一种tiki2基因敲除小鼠模型(该小鼠模型由美国哈佛医学院贺熹教授实验室赠送)，利用细菌半乳糖苷酶基因(lacz)编码dna序列取代小鼠的tiki2基因编码区，在敲除tiki2基因的同时，利用tiki2启动子驱动lacz基因表达半乳糖苷酶，通过x-gal染色可以指示tiki2基因的表达。对8-12周龄tiki2杂合子(+/-)小鼠进行肾脏假手术(sham)或单侧肾脏缺血再灌输手术(uiri)，手术后7天取肾脏，进行oct包埋、冰冻切片制备、x-gal染色和切片观察。
52.切片结果参照图1所示，左侧(sham)为经过肾脏假手术的处理组，右侧为单侧肾脏缺血再灌输手术(uiri，i/r-d7)。发现tiki2蛋白高表达于小鼠的肾近端小管上皮细胞，且缺血再灌注后肾小管上皮细胞表达tiki2明显减少。
53.实施例2
54.本实施例证实了降低小鼠tiki2基因表达会加重uiri手术诱导的急性肾损伤症状。
55.分别取8-12周龄野生型(tiki2+/+)和纯合子(tiki2-/-)敲除小鼠建立单侧肾脏缺血再灌注模型(左肾缺血30min，小鼠体温维持在37
±
0.2℃)，在术后的第七天杀鼠取小鼠左肾进行固定、包埋、切片、脱蜡和pas染色，并对损伤小管损伤程度进行组织学定量评分
统计。
56.结果表明，纯合子和野生型小鼠相比肾脏小管损伤显著增加(图2)。
57.检测肾脏损伤分子kim1的表达，免疫荧光分析和qpcr定量分析，结果表明kim1在纯合子小鼠中的表达显著高于野生型小鼠(图3)。
58.实施例3
59.本实施例构建tiki2条件性敲除小鼠模型(该小鼠模型由美国哈佛医学院贺熹教授实验室赠送)，与肾小管上皮细胞特异性cre转基因小鼠杂交，在肾近端小管上皮细胞中特异性敲除tiki2。取8-12周龄对照小鼠(tiki2fl/fl)和tiki2敲除小鼠(tiki2fl/fl,ggt-cre)如实施例2所示的方法分别进行假手术和uiri手术，手术后7天取材并对损伤小管进行评分统计。
60.结果表明，肾近端小管上皮细胞中特异性敲除tiki2显著加重小鼠肾损伤症状(图4)。肾近端小管上皮细胞特异性tiki2敲除增加小鼠uiri导致的肾小管上皮细胞损伤分子表达(图5)。
61.实施例4
62.取7-8周龄野生型小鼠，分成2组，分别尾静脉注射pcdh-gfp(购买的商业化质粒)和pcdh-ha-tiki2质粒(利用分子生物学方法将编码ha-tiki2融合蛋白的dna插入到pcdh-gfp多克隆位点处)(ha-tiki2编码核苷酸序列如seq id no.1所示)。质粒注射24h后建立单侧肾脏缺血再灌注模型(左肾缺血30min，小鼠体温维持在37
±
0.2℃)，于手术后7天取材，观察肾损伤情况，并进行定量分析。通过免疫印迹实验验证ha-tiki2在小鼠肾脏中的蛋白表达情况。
63.参照图6可知，tiki2过表达缓解小鼠uiri导致的肾小管上皮细胞损伤。
64.参照图7可知，tiki2过表达减少小鼠uiri导致的肾小管上皮细胞损伤分子表达。因此注射tiki2表达质粒可以显著缓解缺血再灌注导致的急性肾损伤。
65.参照图8可知，ha-tiki2在小鼠肾脏中成功表达。图中数字代表小鼠编号。可见ha抗体可以检测到ha-tiki2在3只小鼠肾脏中的表达情况。
66.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够促进tiki2蛋白的表达。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾脏疾病为急性肾损伤；优选地，所述急性肾损伤是肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤；优选地，所述药物能够促进肾小管上皮细胞中tiki2蛋白的表达。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下的作用：减少肾脏小管损伤；优选地，降低肾脏损伤分子的表达；优选地，降低肾脏损伤分子kim1的表达。4.一种tiki2蛋白上调表达的促进剂在制备肾脏疾病的治疗药物中应用；优选地，所述肾脏疾病为急性肾损伤；优选地，所述急性肾损伤是肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤；优选地，所述促进剂促进肾小管上皮细胞中tiki2蛋白上调表达。5.一种用于治疗急性肾损伤的重组载体，其特征在于，其包括能够编码tiki2蛋白的核苷酸序列，其中，所述编码tiki2蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pcdh-ha-tiki2。7.一种治疗急性肾损伤的药物，其特征在于，其包括权利要求5-6任一项所述的重组载体。8.一种重组载体在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，其特征在于，其包括能够编码tiki2蛋白的核苷酸序列，其中，所述编码tiki2蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组载体为pcdh-ha-tiki2。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、散剂、颗粒剂、注射剂、冻干粉针剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、软膏剂、洗剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂或贴剂；优选地，所述药物的剂型为注射剂；优选地，药物还包括联用药物。

技术总结
本发明公开了Tiki2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。该药物能够促进Tiki2蛋白的表达。发明人发现Tiki2蛋白可以作为急性肾损伤的治疗靶点，增加Tiki2蛋白在肾小管上皮细胞中的表达有可能治疗急性肾损伤。针对Tiki2蛋白研发的药物将有可能从根本上减缓并逆转肾脏疾病的病程，尤其是减缓并逆转急性肾损伤病程。病程。病程。


技术研发人员：权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图3页
受保护的技术使用者：四川省医学科学院
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/13