一株菌株T9及其应用

一株菌株t9及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一株菌株t9及其应用。


背景技术：

2.果蔗是一种鲜食甘蔗，富含蔗糖、葡萄糖和果糖等易吸收的糖类以及富含人体所必需的多种氨基酸、维生素和微量元素，其中铁含量最为突出，达9mg/kg，被称为“补血果”。果蔗主要生产在广西、广东、福建、云南、海南、四川江西等南方省区，仅广西果蔗种植面积就超过2.7万公顷，占全国种植面积的10％以上，居全国首位。每年元旦前至春节后为果蔗集中采收季节，大量的果蔗运往北方地区消费，果蔗在运输和贮存期间，容易感染真菌发生霉变甚至产生真菌毒素。自1972年我国首次发现霉变果蔗会引起中毒病例以来，几乎每年都有因食用霉变果蔗引起中毒的病例发生。从霉变果蔗中可分离出真菌，经鉴定为节菱孢菌(arthrinium arundinis)。果蔗节菱孢菌的代谢产物中含有3-硝基丙酸，是一种神经毒素，主要损害中枢神经系统。误食含有一定量的3-硝基丙酸的霉变果蔗可导致严重的食物中毒，表现出恶心、头晕、呕吐和视力障碍等症状，严重时会出现昏迷、呼吸衰竭和死亡等，目前还没有特效的治疗措施。因此，对于如何防止果蔗在贮藏或者运输过程中发生霉变是一件亟待解决的科学难题。
3.在过去，化学合成杀菌剂通常被作为水果采后保鲜的主要方式，然而，化学合成杀菌剂长期使用会诱发病原菌产生抗药性，而且化学合成杀菌剂的药物残留对人类和环境安全有潜在很大的危害。因此，生物防治已逐步取代化学杀菌剂的使用，也成为了控制果蔬采后病害的主要方式，其中拮抗微生物在生物防治中的应用成为了研究热点。目前，能够抑制果蔬采后病害的拮抗微生物有芽孢杆菌属、假单胞菌属、酵母菌属及真菌等。
4.菌株t9是从从广西壮族自治区农业科学院健康果蔗根际土壤筛选分离出现的一株细菌，将其与节菱孢菌平板对峙培养发现，菌株t9对果蔗霉变病菌节菱孢菌具有很强的抑制作用，可以为开发新型果蔬保鲜剂提供技术支持，目前尚未见有相关报道。
5.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种菌株t9及其应用。
7.本发明提供的菌株t9是从从广西壮族自治区农业科学院健康果蔗根际土壤采集中得到，经形态学和分子生物学鉴定为bacillus velezensis，于2022年12月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：gdmcc no.62265。
8.本发明还提供了所述的菌株t9在抑制节菱孢菌生长中的应用。
9.本发明还提供了所述的菌株t9在防止果蔗霉变中应用。
10.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
11.本发明通过形态学观察、革兰氏染色、16s rrna序列测序对筛选的菌株进行鉴定，并测定其对果蔗霉变病菌节菱孢菌的抑制效果，获得一株菌株t9，其对果蔗霉变病菌节菱孢菌具有很强的抑制作用，为果蔗霉变病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。
12.保藏信息说明
13.菌株t9，保藏编号为gdmcc no.62265，保藏日期为2022年12月08日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
14.图1为菌株t9与节菱孢菌平板对峙培养图；
15.图2为菌株t9在na平板上的菌落形态；
16.图3为菌株t9的菌体形态；
17.图4为菌株t9的16s rrna基因序列系统发育树；
18.图5为菌株t9发酵上清液对节菱孢菌抑制效果的单个重复图。
19.有关附图标记的说明：
20.图1中左侧为处理组，右侧为对照组。
具体实施方式
21.下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
22.下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
23.实施例
24.1.菌株分离纯化
25.从广西壮族自治区农业科学院健康果蔗根际土壤采集土壤，称取10.0g置于内含玻璃珠和无菌水的三角瓶中，于28℃、180r/min振荡30min，以此为原液进行梯度稀释，取10-3
、10-4
和10-5
梯度分别涂布于lb固体平板上，于37℃培养24h。观察菌落生长状况，选取密度适中的平板，挑取单一的菌落进行划线纯化，挑取不同形态菌落反复划线纯化，将纯化的菌株保存。
26.2.菌株筛选
27.以节菱孢菌(arthrinium arundinis)作为指示菌株，采用平板对峙法对分离的细菌进行菌体活性初筛。其中，节菱孢菌由本实验室广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所提供，接种于pda平板上，28℃下培养3d，备用。
28.将分离出的菌株在lb肉汤中以180r/min，30℃培养过夜。无菌条件下，用灭菌打孔器在接种有节菱孢菌的pda平板上打取直径5mm的菌饼，并将节菱孢菌菌饼转接到含pda的培养皿中央，在距中央位置2cm四周各接种2μl初筛菌株的培养液(od
600
为0.8)，并设置接种节菱孢菌菌饼且不接种细菌的处理为对照组，每种处理重复3皿。
[0029][0030]
在28℃下培养6d后，采用十字交叉法测量各处理节菱孢菌的直径，并计算抑菌率。
[0031]
结果得到一株对节菱孢菌抑制作用很强的拮抗细菌，其与节菱孢菌平板对峙培养结果如图1所示，将该株菌株编号为t9。
[0032]
3.菌株形态鉴定
[0033]
3.1将t9菌株接种于na培养基上，置于28℃下培养24h，观察菌株的菌落形态特征，结果见图2。
[0034]
从图2可以看出，菌株t9在na平板上呈单菌落，且菌落呈圆形或近似圆形，菌落表面突起，干燥，不光滑，有褶皱。
[0035]
3.2取上述培养后的菌株进行革兰氏染色并镜检，将所观察到的形态结果显微照相，结果见图3。
[0036]
菌株t9革兰氏阴性染色阳性。由图3可知，菌体t9形态为：有芽孢，菌体直杆状。
[0037]
4.菌株测序和系统发育树构建
[0038]
4.1制备dna模板
[0039]
(a)将1.5ml细菌过夜培养液置于灭菌ep管内，12000rpm离心1min，弃去上清液，收集菌体；
[0040]
(b)在沉淀物中加入400μl裂解缓冲液，用吸管反复吹打均匀使之混合；其中，裂解缓冲液为：tris-ac(ph为7.8)40mm，naac 20mm，edta 1mm，sds 1％(w/v)；
[0041]
(c)加入200ul 5m nacl，充分混匀，12000rpm离心10min；
[0042]
(d)取600μl步骤(c)上清液，加入等体积的酚/氯仿(1：1)，轻轻颠倒数次混匀，12000rpm离心10min，将上清液转入另一干净的ep管中；
[0043]
(e)向上清液中加入等体积的氯仿，混匀，12000rpm离心10min，将上清液转入另一干净的ep管中；
[0044]
(f)向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，置于室温10min，12000rpm离心15min，弃去上清液，保留沉淀物；
[0045]
(g)用体积浓度为70％乙醇的洗涤所得沉淀物，晾干，即为dna；
[0046]
(h)将已干的dna溶于30μl双蒸水ddh2o中，-20℃下保存。
[0047]
4.2pcr扩增
[0048]
采用下表1的16s rdna序列pcr反应体系进行扩增。其中，16s rdna的序列如下表2所示。
[0049]
表1 16s rdna序列pcr反应体系
[0050][0051]
表2 16s rdna序列
[0052][0053]
pcr反应程序：95℃变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min。
[0054]
4.3由广州擎科生物科技有限公司对pcr扩增产物进行测序，其核苷酸序列见seq id no.3。
[0055]
4.4将所测的16s rdna序列与genbank基因库中细菌的16s rdna序列进行比对，通过mega6.0分析的邻接算法进行系统分析并构建系统进化树，系统进化树见图4。
[0056]
通过genebank数据库比对和mega6.0分析，确定菌株t9为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，菌株代号为t9，命名为bacillus velezensis t9。
[0057]
5.菌株t9发酵液对节菱孢菌菌丝生长的抑制作用
[0058]
将菌株t9悬浮液(od
600
为1.0)按1％接种量接种到含有100ml nb培养基的三角烧瓶内，28℃培养72h，3500rpm/min离心20min，上清液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，去除孢子，得到菌株t9发酵液上清液。
[0059]
分别制作菌株t9发酵上清液质量百分含量为1％、3％、5％、10％的pda平板。无菌条件下，用灭菌打孔器在接种有节菱孢菌的pda平板上打取直径5mm的菌饼，并将节菱孢菌菌饼接种到pda平板中央。同时设含咪鲜胺水乳剂(拜耳施保克，400g/l)的pda平板为阳性对照，设接种有节菱孢菌且不含任何药剂的pda平板为阴性对照，每种处理重复三次。
[0060]
将所有pda平板置于28℃下培养，待阴性对照的菌落快长满培养皿时，采用十字交叉法测量各处理节菱孢菌的直径，并计算抑菌率，结果表3。其中，菌株t9发酵上清液对节菱孢菌的抑制效果见图5。
[0061][0062]
表3不同处理对节菱孢菌菌丝生长的抑制率
[0063]
[0064]
由表3可知，菌株t9发酵液对果蔗霉变病菌节菱孢菌的菌丝生长抑制率为38.3-90.0％。与阳性对照咪鲜胺水乳剂相比，当pda中菌株t9发酵上清液含量为10％时，其对节菱孢菌菌丝生长抑制率已经接近于阳性对照。说明本发明的菌株t9具有开发成生物保鲜剂的前景。
[0065]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

技术特征：
1.一株菌株t9，其特征在于，所述菌株t9的分类学名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，保藏号为gdmcc no.62265。2.根据权利要求1所述的菌株t9在抑制节菱孢菌菌丝生长中的应用。3.根据权利要求1所述的菌株t9在防止果蔗霉变中应用。

技术总结
本发明属于微生物学技术领域，具体涉及的是一株菌株T9及其应用。一株菌株T9，所述菌株T9的分类学名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏号为GDMCC No.62265。本发明通过形态学观察、革兰氏染色、16S rRNA序列测序对筛选的菌株进行鉴定，并测定其对果蔗霉变病菌节菱孢菌的抑制效果，获得一株菌株T9，其对果蔗霉变病菌节菱孢菌具有很强的抑制作用，为果蔗霉变病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。用前景。用前景。


技术研发人员：廖洁 王天顺 梁雪莲 蒋文艳 陈伟 李慧玲 刘英 韦宇宁 魏源文 莫仁甫 何洁 王海军
受保护的技术使用者：广西壮族自治区农业科学院
技术研发日：2023.02.27
技术公布日：2023/7/13