一种HD致病基因突变检测的扩增引物的制作方法

一种hd致病基因突变检测的扩增引物
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，尤其是一种hd致病基因突变检测的扩增引物。


背景技术：

2.hd编码蛋白在微管介导的转运和囊泡功能中发挥作用，正常hd基因序列中cag核苷酸序列有10-35次拷贝，而当这种不稳定的序列拷贝数达到36-120次，会导致亨廷顿舞蹈症。亨廷顿舞蹈症是一种神经退行性疾病，以精神紊乱、痴呆为主要特征，常病发于30-40岁。发病时间和临床发病程度取决于poly-gln的重复程度。而现有的检测 hd基因的技术主要是基于某个突变位点的扩增和测序方法，步骤繁琐，费用昂贵。


技术实现要素：

3.针对现有的不足，本发明提供一种hd致病基因突变检测的扩增引物。
4.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种hd致病基因突变检测的扩增引物，所述扩增引物包含的引物序列对是hd致病基因中包含cag拷贝序列片段的引物序列对，所述引物序列对为hd forward：atggcgaccctggaaaagct，hd reward：ggcggtggcggctgttgct。
5.作为优选，所述引物序列对是选取目标区域hd致病基因片段前后1kb的序列进行设计的。
6.作为优选，所述cag拷贝序列片段的基因序列为atggcgaccctggaaaagctgatgaaggccttcgagtccctcaagtccttccagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcaacagc cgccaccgcc。
7.本发明的有益效果在于：该发明利用hd基因序列中不稳定的gaa拷贝，设计的引物序列对是hd致病基因中包含cag拷贝序列片段的引物序列对，能将包含cag重复序列的片段扩增出来，能直接通过判断目的产物的大小来区分hd基因是否发生突变，操作简单方便，能高效的区分hd基因是否异常，降低了费用。
8.附图说明
图1是本发明实施例24个样本的电泳检测图；图2是本发明实施例验证样本扩增片段大小检测图。
具体实施方式
9.下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如
无特殊说明，均可从商业途径得到。
10.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
11.在本发明中，一种hd致病基因突变检测的扩增引物，所述扩增引物包含的引物序列对是hd致病基因中包含cag拷贝序列片段的引物序列对，所述引物序列对为hd forward：atggcgaccctggaaaagct，hd reward：ggcggtggcggctgttgct，引物序列对的设计则是先采取被检测者的静脉血，然后提取基因组dna，之后选取目标区域hd致病基因片段前后1kb的序列，使用工具primer3进行引物序列的设计，挑选出横跨靶向目标区域hd致病基因中包含cag拷贝序列的区域进行设计，该引物序列对的扩增目的片段长度适中，且引物具有特异性，不容易发生脱靶的情况，在设计后引物序列对后，使亨廷顿舞蹈症的致病基因hd在体外合适的条件下进行扩增，得到大量的目的dna片段，通过检测片段的大小就可以区分hd基因是否异常，正常hd基因的目的片段在98bp-173bp之间，属阴性；而异常目的片段在176bp-428bp，属阳性。通过核酸电泳，对扩增片段的大小进行比对，之后使用labchip gx touch生物分析仪验证扩增片段的大小。同时cag拷贝序列片段的基因序列则为atggcgaccctggaaaagctgatgaaggccttcgagtccctcaagtccttccagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcaacagc cgccaccgcc。
12.在实际应用中，首先对被检测者静脉采血，采取外周静脉血于edta抗凝试管中，立即混匀，使用tiangen试剂盒relaxgeneblood dna system提取基因组dna，所采集的血液在来不及提取基因组dna的情况下，保存在温度为4℃的环境下，且保存的血液不得超过一周，外周静脉血采集的量为1.5ml，每次血液用量为300
µ
l；接下来利用设计好序列的引物hd forward和hd reward，以基因组dna为模板，使hd基因在体外扩增，扩增的具体反应程序为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，15s；充分延伸72℃，10min；循环数30。扩增过程采用热启动，先将样品加热到94℃，暂停程序，再加入taq酶，重新启动程序，使用takara premix taq，25
µ
l体系进行反应；在扩增完成后，通过核酸电泳，对扩增片段的大小进行比对，就可以区分hd基因是否发生突变。如图1所示是24个样本的检测结果图，24个样本均符合hd基因的正常目的片段大小，属阴性；接着还可以对扩增片段的大小进行验证，使用labchip gx touch生物分析仪来验证扩增片段的大小。如图2所示，101号样本在124bp处存在有效峰值，在正常目的片段范围98bp-173bp之间，为正常样本，即符合hd基因正常扩增的大小，属阴性。
13.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种hd致病基因突变检测的扩增引物，其特征在于:所述扩增引物包含的引物序列对是hd致病基因中包含cag拷贝序列片段的引物序列对，所述引物序列对为hd forward：atggcgaccctggaaaagct，hd reward：ggcggtggcggctgttgct。2.根据权利要求1所述hd致病基因突变检测的扩增引物，其特征在于: 所述引物序列对是选取目标区域hd致病基因片段前后1kb的序列进行设计的。3.根据权利要求1所述hd致病基因突变检测的扩增引物，其特征在于:所述cag拷贝序列片段的基因序列为atggcgaccctggaaaagctgatgaaggccttcgagtccctcaagtccttccagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcaacagc cgccaccgcc。

技术总结
本发明涉及一种HD致病基因突变检测的扩增引物，所述扩增引物包含的引物序列对是HD致病基因中包含CAG拷贝序列片段的引物序列对，所述引物序列对为HD Forward：ATGGCGACCCTGGAAAAGCT，HD Reward：GGCGGTGGCGGCTGTTGCT。该发明的引物序列对是HD致病基因中包含CAG拷贝序列片段的引物序列对，能将包含CAG重复序列的片段扩增出来，操作简单方便，能高效的区分HD基因是否异常，降低了费用。了费用。了费用。


技术研发人员：李生斌 李小明 韩婷婷 常辽
受保护的技术使用者：西安华壹健康医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/7/13