一种利用声表面波打开血脑屏障的方法及应用与流程

1.本发明涉及血脑屏障技术领域，更具体地说，本发明涉及一种利用声表面波打开血脑屏障的方法及应用。


背景技术：

2.血脑屏障(blood-brain barrier，bbb)是分隔血液和中枢神经系的物理和生理屏障。血脑屏障能阻挡血液中绝大部分大分子物质、小分子物质和离子的穿透，从而维持中枢神经系统的稳态。组成血脑屏障的细胞主要包括脑微血管内皮细胞、周皮细胞和星形胶质细胞。脑微血管内皮细胞构成血管壁，细胞之间有致密的紧密连接蛋白相互交联，保证了血脑屏障的屏障功能。周皮细胞是血管的平滑肌细胞，能调控血管的收缩舒张，促进紧密连接的形成。星形胶质细胞终足为脑微血管内皮细胞提供生化支持，通过释放一些信号调节血脑屏障的功能。正常情况下，血脑屏障的存在能够保护中枢神经系统免受有毒物质的侵扰；然而，中枢神经系统疾病情况下，通常需要适度的打开或者绕过血脑屏障进行药物递送，才能使药物达到理想的治疗浓度。
3.如何安全的打开血脑屏障，成为了中枢神经系统药物递送的关键问题。当前，打开血脑屏障的方式可以分为生物和物理类。生物类方法主要包括受体/载体介导的内吞、病毒载体介导的递送、纳米颗粒系统、外泌体以及细胞介导的递送和细胞渗透性肽类，物理方法主要是超声波介导的血脑屏障开放。这类方法均有各自的优点和缺点，例如生物类的方法，通常需要对药物进行精细的设计或者改造。超声波是一类频率大于20khz的压力波，研究表明超声波能够短暂性的改变血脑屏障的完整性并改善帕金森综合征病人的症状。然而，超声波介导的血脑屏障破坏通常是由微囊泡引起的，这些微囊泡引起的血脑屏障及脑组织损失难以预料。因此，如何安全可逆地打开血脑屏障，是有效中枢神经系统药物递送的关键。
4.声表面波是沿着材料表面进行传播的声波，近年来，研究发现声表面波能够改变细胞的生物学特性，操纵细胞、粒子和液体的运动。声表面波处理能够引起细胞的拉伸，并且可以使细胞从培养表面移除。目前关于声表面波介导的血脑屏障破坏未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种利用声表面波打开血脑屏障的方法，解决现有技术打开血脑屏障不可逆的缺陷，从而为中枢神经系统可控的药物递送提供更优方案。
6.鉴于此，本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一个目的在于提出声表面波在打开血脑屏障中的应用。
8.在本发明一个实施例中，所述血脑屏障打开中脑微血管内皮细胞跨皮电阻降低至阈值后恢复。
9.在本发明一个实施例中，所述血脑屏障中脑微血管内皮细胞形态及活性不变。
10.本发明的第一个目的在于提出一种利用声表面波打开血脑屏障的方法，包括：将血脑屏障模型或对象血脑屏障部位贴近声表面波发生器压电晶体表面的步骤，调整并检测
声表面波频率与功率的步骤，及检测脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻的步骤；通过控制声表面波频率与功率使脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻降低至阈值即实现血脑屏障的打开。
11.在本发明一个实施例中，所述血脑屏障模型为人脑血脑屏障模型，基于人脑微血管内皮细胞体外培养得到。
12.优选地，所述血脑屏障模型贴近压电晶体表面步骤中，预先在压电晶体表面构建模型腔室，将人脑微血管内皮细胞置于腔室内培养。
13.优选地，在打开血脑屏障模型时，所述声表面波的频率为10-100mhz，功率为20-40dbm。
14.更优选地，所述声表面波的功率为20dbm、25dbm、30dbm、35dbm或37.8dbm。
15.本发明再一个目的在于提供以上所述打开血脑屏障的方法在打开斑马鱼脑血脑屏障中的应用。
16.相对于现有技术，本发明的有益效果包括但不限于：
17.1.本发明提供的声表面波应用于打开血脑屏障，可实现血脑屏障打开可逆化，推进中枢神经系统药物递送的应用前景。
18.2.本发明提供的利用声表面波打开血脑屏障的方法，由于声表面波能量集中于介质表面，操控强；利用声表面波的特性，通过控制声表面的参数并检测脑微血管内皮细胞跨皮电阻变化可判断血脑屏障的打开，安全性好，可靠性强。
19.3.本发明提供声表面波应用于斑马鱼脑血脑屏障打开时，通过血脑屏障示踪指示剂发现指示剂渗透进入斑马鱼脑组织，并在脑组织中呈点状分布，为血脑屏障的打开应用于中枢神经系统药物递送提供了可靠依据。
附图说明
20.图1为本发明所述saw的idt设备示意图。
21.图2为本发明所述设备saw波密度与频率的关系。
22.图3为本发明实施例2中saw和对照组分别处理transwell小室后hbmecs跨内皮电阻的变化结果。
23.图4为本发明35dbm情况下血脑屏障完整性与频率的关系。
24.图5为本发明实施例3中saw刺激对hbmecs的细胞活性影响结果。
25.图6为本发明实施例3中saw刺激对hbmecs的跨内皮电阻的影响结果。
26.图7为本发明实施例4中saw刺激后hbmecs对naf和fitc-dextran的细胞旁通透性影响结果。
27.图8为本发明实施例5中saw刺激斑马鱼后脑组织荧光分布结果。
具体实施方式
28.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.为了实现声表面波(saw)打开血脑屏障，本发明的一个实施例中，基于本领域人员
知晓的声表面波发生器的基本原理，基于信号发生器和功率放大器设计了能激发saw的叉指换能器器件(idt)，该器件能够很好的将saw作用于体外血脑屏障模型-transwell模型。利用该模型，评估了saw引起血脑屏障通透性改变的参数，证实saw是一种实用的、全新的能安全打开血脑屏障可选方式。
30.在一个实施例中，基于saw适用于transwell分析的idt设计如下：
31.本方案的saw装置基于印刷电路板偶联的idt，使用印刷电路板能够减小设备体积，增强仪器的稳定性。idt采用机械固定的方式紧压于压电晶体表面，从而产生稳定可调控saw的idt器件。在压电晶体中央，镶有环形塑料，能够储存少量培养基供saw刺激transwell小室，其结构示意图如图1所示。根据idt电极距离大小，idt可以设计成mhz～ghz的工作频率，并探究了工作频率与单位面积声波密度之间的关系，如图2所示。证实工作频率越高，单位面积声波密度越大。
32.使用方法为：将transwell放入塑料圆环中，打开信号发生器，即可对idt器件中的transwell进行刺激，后续可以通过测定transwell的参数，来评估血脑屏障通透性的改变。通过调整该设备saw的输入信号，可以实现从0-40dbm不同功率的saw对transwell的刺激。
33.在本发明的另一个实施例中，提出一种利用声表面波打开血脑屏障的方法，包括：将血脑屏障模型或对象血脑屏障部位贴近声表面波发生器压电晶体表面的步骤，调整并检测声表面波频率与功率的步骤，及检测脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻的步骤；通过控制声表面波频率与功率使脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻降低至阈值即实现血脑屏障的打开。
34.本发明中，所述的，声表面波作用于血脑屏障的打开过程中细胞旁通透性受到影响，血脑屏障的通透性改变导致人脑微血管内皮细胞跨皮电阻值降低。
35.在本发明一个实施例中，通过检测脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻的变化来判断血脑屏障是否打开；并且在血脑屏障打开过程中脑微血管内皮细胞跨皮电阻降低至阈值后恢复，可判断为血脑屏障的打开是可逆的。
36.在本发明一个实施例中，通过本领域人员掌握的检测和观察手段发现，脑微血管内皮细胞形态及活性不变，或变化在正常范围内，可判断声表面波对hbmecs的刺激过程中不改变脑微血管内皮细胞形态及活性，进一步证实血脑屏障的打开过程是可逆的。
37.在本发明一个实施例中，所述血脑屏障模型包括但不限于人脑血脑屏障模型或其他动物模型，人脑血脑屏障模型可基于人脑微血管内皮细胞体外培养得到。
38.在优选的实施例中，预先在压电晶体表面构建模型腔室，将人脑微血管内皮细胞置于腔室内培养，实现所述血脑屏障模型贴近压电晶体表面，实现声表面波能量集中于介质表面，因而容易操控。
39.在一个实施例中，在打开人脑部血脑屏障模型时，所述声表面波的频率为10-100mhz，功率为20-40dbm；对于不同形成时期的血脑屏障模型，所述声表面波在功率为20dbm、25dbm、30dbm、35dbm或37.8dbm时均可实现人脑微血管内皮细胞跨皮电阻值降低，且可在数分钟之后恢复，可视为可逆化打开血脑屏障。
40.基于上述人脑部血脑屏障模型打开参数，本领域人员可以根据不同脑部对象的血脑屏障情况，通过本发明提供的声表面波发生器调节频率与功率可通过有限次的实验实现血脑屏障的打开，通过检测脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻值变化来获取频率与功率的参
数，均在本发明实施例范围之内。
41.特别地，本发明所述血脑屏障打开是为了提供血脑屏障临时破坏的生物学状态，目的在于为中枢神经系统药物递送提供通道，非直接诊断或治疗疾病的方式，因此不属于诊断或治疗疾病的范畴。
42.以下是本方案提供的较佳的实施例，用于说明上述方案并验证技术效果。
43.实施例1.人脑微血管内皮细胞(hbmecs)培养及transwell模型的构建
44.为了利用idt设备刺激血脑屏障，还需构建体外bbb模型。采用hbmecs构建transwell模型。hbmecs培养于rmpi 1640培养基，三到四天进行传代。为了构建transwell模型，首先对transwell小室，进行胶原蛋白包被，然后用pbs清洗，置于37℃二氧化碳培养箱。在6.5mm的transwell小室中，每孔加入8104个细胞于100l培养，下室为24孔板，每孔加入1.5ml培养基。含transwell小室的培养板随后置于37℃二氧化碳培养箱中培养，一段时间后即可形成体外bbb模型。
45.实施例2.saw诱导体外bbb的打开
46.为了分析saw对体外血脑障的作用，我们将信号发生器的频率调至idt工作频率，使用不同的功率及不同时间的saw刺激idt装置中的transwell，通过检测hbmecs的跨内皮电阻，来反应血脑屏障完整性的改变。有文献报道，血脑屏障的破坏伴随着跨内皮电阻的降低，因此通常使用跨内皮电阻的变化情况来评价血脑屏障完整性。对于24h的早期血脑屏障，分别使用功率为20dbm、25dbm和30dbm的saw处理transwell小室5min，然后立即检测血脑屏障的跨内皮电阻。实验结果表明，20dbm、25dbm和30dbm均能有效的降低hbmecs的跨内皮电阻，证实血脑屏障的打开。进一步观察发现，跨内皮电阻在hbmecs培养一段时间之后，均能恢复至正常水平，甚至还略有增加，证实saw诱导bbb的打开是可逆的。随后，我们将saw功率固定在30dbm(功率为1w)，使用不同的处理时间刺激transwell小室。测试情况如图3所示，图3结果表明，对于24h的早期形成的血脑屏障，30dbm的saw处理1min、3min和5min均能有效的降低hbmecs的跨内皮电阻。然而，对48h形成的牢固血脑屏障，30dbm的saw不足以减小hbmecs的跨内皮电阻，此时saw的功能只有达到35dbm才能降低hbmecs的跨内皮电阻。另外，在血脑屏障被打开后继续培养一段时，跨内皮电阻有所回升，表明血脑屏障的功能的恢复。通过这些实验证实，基于saw的idt装置能够打开体外bbb，并且具有一定的剂量依赖性。早期血脑屏障30dbm就足以打开，而对于晚期血脑屏障需要35dbm或更高功率才能打开。
47.声表面波操控细胞的原理是声波产生的声辐射力，公式为：
48.当频率越高时波长越短，声辐射力越大，操纵细胞更有效。通过对35dbm情况下，对血脑屏障完整性与频率建模分析，如图4所示。图4的结果可以看出，从10-100mhz范围内，35dbm的saw刺激下bbb完整性是随着频率的增加而降低，对于其他频率诱导血脑屏障破坏，需要改变saw的功率才能达到最佳效果。
49.实施例3.saw刺激不改变hbmecs的细胞活性
50.传统的超声波由于其在处理过程中，容易产生微囊泡，因而易导致组织损伤。为了分析saw处理对hbmecs的影响，我们在saw刺激后分析了hbmecs的生长状态。首先，分别利用35dbm和37.8dbm的saw刺激transwell小室的hbmecs。实验发现，35dbm和37.8dbm的saw刺激均能打开血脑屏障(图5a)。利用细胞活性检测cck8试剂盒进行分析，观察到即使在35dbm和
37.8dbm高功率的saw刺激下，hbmecs细胞活性仍能保持93％和85％(图5b)。此外，细胞形态观察证实saw刺激未改变hbmecs的细胞形态。此结果表明，saw处理不改变hbmecs的细胞活性。此外，通过检测hbmecs的跨内皮电阻，如图6所示，功率为37.8dbm的saw刺激下，hbmecs的跨内皮电阻变化呈降低后升高的趋势，进一步证实了saw诱导bbb的打开是可逆的。基于高功率saw刺激能够实现bbb的可逆化打开，在低下也是能够实现的。
51.实施例4.saw刺激增加hbmecs对不同分子量物质的细胞旁通透性
52.细胞旁通透性是评价血脑屏障完整性的另一个指标。为了证实saw刺激介导的bbb破坏，确实能够促进药物的递送，我们选取了荧光素钠(naf，376da)、fitc标记的葡聚糖(fitc-dextran 10kd)和fitc-dextran 70kd分别代表小分子和大分子物质，在saw刺激后检测这些物质从hbmecs间隙穿过到达下室(细胞旁通透性)的荧光强度，检测结果如图7所示。结果表明，saw刺激增加了hbmecs对naf和fitc-dextran的通透性，证实saw是一种有效打开血脑屏障并进行药物递送的方案。
53.实施例5.saw刺激促进naf渗透进入斑马鱼脑组织
54.为了证实saw在体内能促进药物渗透，我们选取了身体透明的的斑马鱼(受精第10天，10dpf)作为体内模型，使用naf(376da)作为血脑屏障示踪指示剂。实验中，斑马鱼放于含有1mg/ml naf的水溶液中，然后使用或者不使用saw处理。处理结束后，立即用清水清洗，荧光显微镜观察鱼体荧光分布，结果如图8(a-d)所示。实验结果显示，saw刺激促进了naf渗透进入斑马鱼脑组织，并在脑组织中呈点状分布(图8d，箭头所示)。此外，我们还发现，saw刺激的鱼体内，眼睛处的荧光强度高于对照组(图8a，图8b)。这些结果表明，saw刺激确实能够打开血脑屏障，促进naf的渗透；并且，saw作用的屏障并不局限于血脑屏障，例如例如眼睛处的血视网膜屏障也能被saw打开。
55.最后应说明的几点是，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.声表面波在打开血脑屏障中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血脑屏障中脑微血管内皮细胞跨皮电阻降低至阈值后恢复。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血脑屏障中脑微血管内皮细胞形态及活性不变。4.利用声表面波打开血脑屏障的方法，其特征在于，包括：将血脑屏障模型或对象血脑屏障贴近声表面波发生器压电晶体表面的步骤，调整并检测声表面波频率与功率的步骤，及检测脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻的步骤；通过控制声表面波频率与功率使脑微血管内皮细胞的跨内皮电阻降低至阈值即实现血脑屏障的打开。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述血脑屏障模型为人脑血脑屏障模型，基于人脑微血管内皮细胞体外培养得到。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述血脑屏障模型贴近压电晶体表面步骤中，预先在压电晶体表面构建模型腔室，将人脑微血管内皮细胞置于腔室内培养。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，打开血脑屏障模型时，所述声表面波的频率为10-100mhz，功率为20-40dbm。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述声表面波的功率为20dbm、25dbm、30dbm、35dbm或37.8dbm。9.权利要求4所述打开血脑屏障的方法在打开斑马鱼脑血脑屏障中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用声表面波打开血脑屏障的方法及应用，所述血脑屏障在打开过程中脑微血管内皮细胞跨皮电阻降低至阈值后恢复，且实现脑微血管内皮细胞活性和形态不变；本发明提供的方案可解决现有技术血脑屏障不可逆的缺陷，从而为中枢神经系统可控的药物递送提供更优方案。供更优方案。供更优方案。


技术研发人员：杨欣 王珂 孙超
受保护的技术使用者：武汉欧必诺生物科技有限公司
技术研发日：2023.02.09
技术公布日：2023/7/13