一种利用EDTA-Fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法

一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法
技术领域
1.本发明涉及微藻培养技术领域，尤其是涉及一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法。


背景技术：

2.作为研究最广泛和最有前途的生物降解材料，聚乳酸(pla)可以在自然环境中通过微生物、水等介质逐渐降解为小分子，最终降解为对环境无害的二氧化碳和水。在用于制备乳酸的各种基质中，纤维素因其储量大、价格低廉而被认为是制备乳酸的最佳原料，但其结构的复杂性一直是研究的难点，因此，寻找一种新的制备乳酸的原料已经迫在眉睫。
3.微藻是自然界分布广泛、繁殖力强、生存能力强的自养生物，也是一种新型的生物质资源。微藻生长速度快，光合作用效率是陆生植物的3-4倍。它们可以通过光合作用有效地将太阳能、水和二氧化碳转化为碳水化合物并将其储存在细胞中。与植物细胞相比，微藻细胞的木质素和半纤维素含量较低，并且微藻细胞含有iα纤维素而不是iβ纤维素，由于氢键较弱，更容易降解为单糖。微藻的强适应性使其在生物质催化转化反应体系中具有巨大优势，在各种微藻中，斜生栅藻(scenedesmus obliquus)培养期短，含糖量高，是生产乳酸的绝佳原料。
4.国内外学者围绕微藻生物量的提高和油脂积累特性方面进行了了大量研究，但是对于微藻碳水化合物含量的提升研究则相对较少，且利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量尚未报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法。本发明解决了微藻培养中无法提高碳水化合物的含量的问题，具有成本低、绿色环保、适于工业化生产等优点。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
8.a1、将斜生栅藻的藻种液接种于加有edta-fe和1-萘乙酸即naa溶液的培养基中；培养基中的edta-fe浓度为10-5
～6
×
10-5
mol/l，naa的浓度为10～30mg/l；
9.a2、控制培养条件为光照强度2800～3200lux，温度23～26℃，调节初始ph为6.8～7.2，光暗比为12h:12h，每日采用恒温摇床120～150r/min摇2～3次，每次10～20min，培养至稳定期。
10.优选的，步骤a1所述的斜生栅藻为scenedesmus obliquus fachb-12。
11.优选的，步骤a1所述的藻种液的制备如下：
12.将斜生栅藻加入到bg11液体培养基中，在23～26℃、光强2800～3200lux的恒温培
养箱下培养至对数增长期，每日采用恒温摇床120～150r/min摇2～3次，每次10～20min。
13.优选的，步骤a1所述培养基为bg11培养基。
14.优选的，步骤a1所述的藻种液中斜生栅藻的细胞密度为1.0～2.0g/l。
15.优选的，所述的斜生栅藻碳水化合物含量的测定方法包括以下步骤：
16.b1、每天同时用吸管在离心管中取1毫升步骤a2培养至稳定期的藻液，以5000转/分钟的速度离心机4分钟，除去上清液，加入蒸馏水使体积达到10毫升，摇匀；
17.b2、将充分摇动的藻液放入超声波细胞粉碎机中进行冰浴超声，超声间隔3s，超声时间30min；然后将超声藻液在80℃水浴中加热2h，取出，冷却至室温；
18.b3、取冷却后的藻液2毫升放入10毫升离心管中，依次快速加入1毫升5％苯酚溶液和5毫升浓硫酸，放置10分钟，充分摇动后，室温黑暗中放置20分钟，用分光光度计测其od
490
值；
19.b4、将od
490
值代入绘制的葡萄糖标准曲线后，根据稀释系数计算出当天的斜生栅藻的碳水化合物浓度；所述碳水化合物含量为藻液中碳水化合物浓度占生物量浓度的百分比。
20.本发明还提供了所述方法制备得到的高碳水化合物含量的藻粉，制备方法如下：
21.将步骤a2培养至稳定期收获的藻液进行离心收获细胞，收集的斜生栅藻细胞用去离子水洗涤数次，直到没有观察到附着在上层的白色菌落，然后在真空冷冻干燥器中冷冻干燥，即可得到高碳水化合物含量的藻粉。
22.本发明有益的技术效果在于：
23.本发明所述斜生栅藻采用自养培养的方式进行培养，通过恒温培养箱的鼓风系统鼓入的空气中的co2提供碳源，实现碳减排的同时还节约了成本。本发明添加的edta-fe和naa中，铁离子具有多种生理功能，可以促进微藻的代谢生长和脂质积累，植物激素对藻类的生长和代谢物的合成有明显的刺激作用，从而增加了斜生栅藻的碳水化合物含量；且通过转录组学的分析，揭示了斜生栅藻细胞中成分变化的原因。本研究发现，同时添加20mg/l naa和2
×
10-5
mol/l edta-fe后，栅藻碳水化合物含量高达46.03％。
附图说明
24.图1为实施例中斜生栅藻碳水化合物含量变化图；
25.图2为实施例中斜生栅藻生物量变化图；
26.图3为实施例中斜生栅藻油脂含量变化图；
27.图4为实施例中斜生栅藻色素含量变化图；
28.图5为实施例中斜生栅藻蛋白质含量与sod酶活性变化图；
29.图6为本发明糖酵解的kegg路径图；
30.图7为本发明淀粉合成和代谢的kegg路径图；
31.图8为本发明脂肪酸合成的kegg路径图。
具体实施方式
32.下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在
没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
34.本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术都将包含在本技术中。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
36.本发明所使用的斜生栅藻(scenedesmus obliquus，fachb-12)，购置于中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库；乙二胺四乙酸铁钠(edta-fe)购于国药集团化学试剂有限公司，为化学纯；1-萘乙酸(naa)购于国药集团化学试剂有限公司，为化学纯。
37.实施例1：
38.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
39.(1)制备藻液：将斜生栅藻扩培在bg11培养基内，在光强3000lux、25℃的恒温培养箱下培养到对数增长期，以作为后续实验激素诱导的藻种液；
40.(2)微藻培养：步骤(1)所获得的藻种液接种于150ml bg11培养基中，培养基中含有浓度为10-5
mol/l的edta-fe溶液；控制培养条件为光照强度3000lux，温度25℃，调节初始ph为7，光暗比12h:12h，每日采用恒温摇床150r/min摇3次，每次15min，培养至稳定期收获；
41.(3)藻液的提取：培养15天后，以3000rpm离心5分钟收获细胞，收集的斜生栅藻细胞用去离子水洗涤数次，直到没有观察到附着在上层的白色菌落，在真空冷冻干燥器中冷冻干燥。冻干的细胞被磨成粉末，储存在低于0℃的温度下；
42.(4)斜生栅藻碳水化合物含量的测定：每天同时用吸管在离心管中取1毫升步骤(2)培养至稳定期收获的藻液，以5000转/分钟的速度离心机4分钟，除去上清液，加入蒸馏水使体积达到10毫升，摇匀。
43.将充分摇动的藻液放入超声波细胞粉碎机中进行冰浴超声，超声间隔3s，超声时间30min；然后将超声藻液在80℃水浴中加热2h，取出，冷却至室温。
44.取冷却后的栅藻溶液2毫升放入10毫升离心管中，依次快速加入1毫升5％苯酚溶液和5毫升浓硫酸，放置10分钟，充分摇动后，室温黑暗中放置20分钟，用分光光度计测其od
490
值。
45.将od
490
值代入绘制的葡萄糖标准曲线后，就可以根据稀释系数计算出当天的斜生栅藻碳水化合物浓度。碳水化合物含量是藻液中碳水化合物浓度占生物量浓度的百分比。
46.实施例2：
47.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
48.(1)微藻培养：向150ml bg11培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，并加入2
×
10-5
mol/l的edta-fe，其他方法同实施例1所述方法。
49.(2)斜生栅藻碳水化合物含量的测定同实施例1所述方法。
50.实施例3：
51.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
52.(1)微藻培养：向150ml bg11培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，并加入4
×
10-5
mol/l的edta-fe，其他方法同实施例1所述方法。
53.(2)斜生栅藻碳水化合物含量的测定同实施例1所述方法。
54.实施例4：
55.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
56.(1)微藻培养：向150ml培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，并加入20mg/l的naa，其他方法同实施例1所述方法。
57.(2)斜生栅藻碳水化合物含量的测定同实施例1所述方法。
58.实施例5：
59.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
60.(1)微藻培养：向150ml bg11培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，并加入20mg/l的naa与10-5
mol/l的edta-fe，其他方法同实施例1所述方法。
61.(2)斜生栅藻碳水化合物含量的测定同实施例1所述方法。
62.实施例6：
63.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
64.(1)微藻培养：向150ml bg11培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，并加入20mg/l的naa与2
×
10-5
mol/l的edta-fe，其他方法同实施例1所述方法。
65.(2)斜生栅藻碳水化合物含量的测定同实施例1所述方法。
66.实施例7：
67.本实施例提供了一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，包括如下步骤：
68.(1)微藻培养：向150ml bg11培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，并加入20mg/l的naa与4
×
10-5
mol/l的edta-fe，其他方法同实施例1所述方法。
69.(2)斜生栅藻碳水化合物含量的测定同实施例1所述方法。
70.对比例1：
71.微藻培养：向150ml bg11培养基中接种15ml实施例1的步骤(1)制备得到的藻种液，未向bg11培养基中添加edta-fe与naa，其他方法同实施例1所述方法。斜生栅藻碳水化合物含量测定方法同实施例1所述方法。
72.测试例：
73.对实施例1-7以及对比例1进行斜生栅藻碳水化合物含量测试，结果如图1所示。仅添加edta-fe或naa，或同时添加edta-fe和naa后，7个实施例的斜生栅藻的碳水化合物含量均有所增加，且碳水化合物含量高于对比例。而碳水化合物含量在第11天左右达到峰值，然后下降。而同时添加20mg l-1
naa和2
×
10-5
mol l-1
edta-fe时，碳水化合物含量为46.03％，是所有实施例中最高的。
74.edta-fe与naa加快了斜生栅藻的生长速率，结果如图2所示。仅添加edta-fe或naa，或同时添加edta-fe与naa后，7个实施例斜生栅藻的生长速度均增加，总生物量高于对比例，而生物量在第11天左右达到峰值，然后下降。
75.edta-fe与naa的添加降低了油脂含量，结果如图3所示。只有edta-fe的实施例与对比例相比有10％左右的小幅下降，而同时添加edta-fe和naa的组下降幅度更大20％以上，20mg/l naa和2
×
10-5
mol/l实施例下降幅度最大。随着edta-fe浓度的增加，斜生栅藻含油量先下降后上升，而naa的加入引起的含油量下降幅度更大。
76.edta-fe与naa的添加提升了色素含量，结果如图4所示。所有7个实施例的色素含量都高于对比例。随着edta-fe浓度的增加，藻细胞中色素含量呈先增加后降低的趋势，这与藻类生物量和碳水化合物含量的变化是一致的。添加naa后色素含量持续增加，这说明edta-fe和naa都能促进藻类细胞中色素的合成，从而进一步增强叶绿体中色素催化的光合作用，促进斜生栅藻的生长，最终提高斜生栅藻的生物量和碳水化合物含量。
77.edta-fe与naa的添加不会对斜生栅藻细胞造成损害，结果如图5所示。对比例的蛋白质含量为15.03％。只添加edta-fe时，蛋白质含量在15.44-15.82％之间变化。而只添加naa和同时添加edta-fe和naa时，蛋白质含量从15.15-15.71％不等。实施例和对比例之间的变化量不超过1％，表明实施例的蛋白质含量与对比例相比差别很小。故虽然edta-fe和naa的加入会引入一定的ros，但是藻细胞内sod的存在会抵御ros可能对细胞造成的氧化损伤。而蛋白质含量无显著差异这一点，则说明了实验组的处理并未对斜生栅藻造成功能性的损伤，细胞仍处于稳态之中。
78.藻类细胞中淀粉合成的途径见图6。首先，6-磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖变位酶(ec：5.4.2.2)的催化下转化为1-磷酸葡萄糖，然后adp-葡萄糖焦磷酸化酶(ec:2.7.7.27)将1-磷酸葡萄糖和atp催化转化成adp-葡萄糖和无机焦磷酸，最后adp-葡萄糖在淀粉合成酶(ec：2.4.1.21)和1,4-α-葡聚糖分支酶(ec：2.4.1.18)的催化下变成葡聚糖链，导致淀粉颗粒的进一步延伸。
79.淀粉合成和代谢的kegg途径图见图7。磷酸葡萄糖变位酶(ec:5.4.2.2)在只添加edta-fe的实施例和同时添加edta-fe与naa的实施例中均有明显差异，影响该酶合成的基因trinity_dn22886_c0_g1在实验组中均上调，这就促进了磷酸葡萄糖变位酶的生成，从而为淀粉生成提供更多的1-磷酸葡萄糖。
80.adp-葡萄糖焦磷酸化酶(ec:2.7.7.27)和1,4-α-葡聚糖分支酶(ec:2.4.1.18)在实施例和对比例中无显著差异，而淀粉合成酶(ec:2.4.1.21)在同时添加edta-fe与naa的实验组别中显著上升，影响该酶合成的基因trinity_dn12805_c0_g1、trinity_dn10271_c0_g1、trinity_dn4824_c1_g2在只添加edta-fe的实施例和对比例差异不显著，但是在同时添加edta-fe与naa的实施例中显著上调，并随edta-fe浓度上升呈现先增大后减小的趋势。
81.虽然添加edta-fe与naa都可以为淀粉的生成提供更多的原料，但添加naa可以通过提高淀粉合成酶的活性来进一步促进淀粉的合成与延伸，从而积累更多的碳水化合物，这也解释了斜生栅藻的碳水化合物量在同时添加edta-fe与naa时总体高于只添加edta-fe时的原因。
82.淀粉生成后，会因斜生栅藻生长过程中呼吸作用水解释放能量而被消耗。淀粉首
先在α-淀粉酶(ec:3.2.1.1)的催化下水解为低聚糖，低聚糖再在寡聚-1，6-葡糖苷酶(ec:3.2.1.10)的催化下，进一步被水解为α-d-葡萄糖。
83.由图7可知，两种酶的活性在只添加edta-fe与同时添加edta-fe与naa的实施例中差异显著，影响α-淀粉酶(ec:3.2.1.1)生成的基因trinity_dn4726_c0_g1、trinity_dn3216_c0_g1、trinity_dn1755_c0_g2与影响寡聚-1，6-葡糖苷酶(ec:3.2.1.10)生成的基因trinity_dn5308_c0_g1均上调，并随edta-fe浓度的升高呈现出先增大后减小的趋势。
84.以上说明了实施例中淀粉的水解酶活性增大，可以更快将淀粉水解为葡萄糖，释放出更多能量用于斜生栅藻的生长，同时也解释了生物量差异的原因。
85.微藻对脂肪酸进行合成的路径如图8所示。微藻中对脂肪酸合成的第一步在藻细胞叶绿体中进行，乙酰辅酶a由其羧化酶和碳酸盐一起被催化为丙二酰辅酶a。接着，丙二酸单酰coa-acp转酰基酶(ec:2.3.1.39)将丙二酰辅酶a催化为丙二酰-acp，即为脂肪酸合成的前体。
86.然后，丙二酰-acp不断地由酮酰基-acp聚合酶以及其他同工酶催化，并与乙酰辅酶a发生一系列缩合反应。脂肪酸的碳链在缩合反应中得以逐渐延伸，十六碳/十八碳的脂肪酸由此形成。
87.脂肪酸合成过程中的关键限速酶是乙酰辅酶a羧化酶，由图8可知，该酶(ec:6.4.1.2)在只添加edta-fe实施例和同时添加edta-fe与naa的实施例中均有明显差异，而且影响该酶合成的基因trinity_dn1463_c0_g1在实施例中均下降，这使得丙二酰辅酶a的产率下降，合成脂肪酸前体物质的原料减少。
88.3-氧乙酰基-[酰基载体蛋白]合成酶iii(ec:2.3.1.180)和3-氧代乙酰基-[酰基载体蛋白]合成酶ii(ec:2.3.1.180)在实施例和对比例中无显著差异，但是长链酰基-coa合成酶iii(ec:6.2.1.3)在同时添加edta-fe与naa的实施例中均显著下调。且影响该酶合成的基因trinity_dn409_c0_g5的表达量随着edta-fe浓度增加呈现先降低后升高的趋势。
[0089]
通过图6、图7、图8的转录组学分析，揭示了斜生栅藻细胞中成分变化的原因。总的来说，kegg数据库的注释结果解释了藻类细胞内成分变化的原因。对实施例碳水化合物代谢的糖酵解途径的分析表明，斜生栅藻细胞进行碳水化合物代谢时，不同的处理都促进了糖酵解途径中葡萄糖磷酸酯转移酶的产生，可以提供更多的葡萄糖1-磷酸酯作为淀粉生产的原料。
[0090]
加入naa后的实施例中，淀粉合成酶会增加，这就会促进淀粉的延伸和合成。此外，淀粉水解酶的活性也会增加，使得水解能量释放的速度加快，使斜生栅藻细胞生长更快。另一方面，对实施例中栅藻的脂肪酸代谢通路进行分析表明，添加naa和edta-fe会降低脂肪酸合成过程中关键限速酶-乙酰coa羧化酶的含量，影响脂肪酸合成前体物质的形成。
[0091]
此外，延长脂肪酸碳链的长链酰基-coa合成酶的含量减少，使脂质的合成和延长速度减慢，从而进一步降低脂质的含量。上述也解释了实验组斜生栅藻的脂质含量整体下降的原因。
[0092]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发
明并不限于特定的细节。

技术特征：
1.一种利用edta-fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：a1、将斜生栅藻的藻种液接种于加有edta-fe和1-萘乙酸即naa溶液的培养基中；培养基中的edta-fe浓度为10-5
～6
×
10-5
mol/l，naa的浓度为10～30mg/l；a2、控制培养条件为光照强度2800～3200lux，温度23～26℃，调节初始ph为6.8～7.2，光暗比为12h:12h，每日采用恒温摇床120～150r/min摇2～3次，每次10～20min，培养至稳定期。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a1所述的斜生栅藻为scenedesmus obliquus fachb-12。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a1所述的藻种液的制备如下：将斜生栅藻加入到bg11液体培养基中，在23～26℃、光强2800～3200lux的恒温培养箱下培养至对数增长期，每日采用恒温摇床120～150r/min摇2～3次，每次10～20min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a1所述培养基为bg11培养基。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a1所述的藻种液中斜生栅藻的细胞密度为1.0～2.0g/l。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的斜生栅藻碳水化合物含量的测定方法包括以下步骤：b1、每天同时用吸管在离心管中取1毫升步骤a2培养至稳定期的藻液，以5000转/分钟的速度离心机4分钟，除去上清液，加入蒸馏水使体积达到10毫升，摇匀；b2、将充分摇动的藻液放入超声波细胞粉碎机中进行冰浴超声，超声间隔3s，超声时间30min；然后将超声藻液在80℃水浴中加热2h，取出，冷却至室温；b3、取冷却后的藻液2毫升放入10毫升离心管中，依次快速加入1毫升5％苯酚溶液和5毫升浓硫酸，放置10分钟，充分摇动后，室温黑暗中放置20分钟，用分光光度计测其od
490
值；b4、将od
490
值代入绘制的葡萄糖标准曲线后，根据稀释系数计算出当天的斜生栅藻的碳水化合物浓度；所述碳水化合物含量为藻液中碳水化合物浓度占生物量浓度的百分比。7.权利要求1所述方法制备得到的高碳水化合物含量的藻粉，其特征在于，制备方法如下：将步骤a2培养至稳定期收获的藻液进行离心收获细胞，收集的斜生栅藻细胞用去离子水洗涤数次，直到没有观察到附着在上层的白色菌落，然后在真空冷冻干燥器中冷冻干燥，即可得到高碳水化合物含量的藻粉。

技术总结
本发明提供了一种利用EDTA-Fe和1-萘乙酸提高斜生栅藻碳水化合物含量的方法，涉及微藻培养技术领域。所述方法包括如下步骤：A1、将斜生栅藻的藻种液接种于加有EDTA-Fe和1-萘乙酸即NAA溶液的培养基中；培养基中的EDTA-Fe浓度为10-5


技术研发人员：沈峥 张亚雷 蔡文虎 高艺珊
受保护的技术使用者：同济大学
技术研发日：2022.12.14
技术公布日：2023/7/13