干细胞诱导分化为造血祖细胞的方法与流程

1.本发明属于细胞技术领域，更具体地，本发明涉及干细胞诱导分化为造血祖细胞的方法。


背景技术：

2.血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，其常表现为贫血、出血、发热等症状。我国儿童恶性癌症的发病率呈上升趋势，截止2014年的数据显示，儿童恶性肿瘤中，白血病的发病率居第一位，约占三分之一。对于恶性血液系统疾病而言，临床上的化疗效果往往不甚理想。自从二十世纪中期thomas教授首先开展了造血干细胞(hemato poieticstem cell,hsc)移植以来，hsc移植广泛地被应用于白血病的临床治疗中，已经成为治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、重型再障等病的有效手段之一。
3.目前hsc主要来源于脐带血、骨髓和外周血。hsc移植主要分为自体和异体hsc移植两种。尽管自体移植具有无移植排斥、无移植物抗宿主病等并发症的优点，但脐血库储存的自体hsc数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。异体移植虽然远期疗效优于自体移植且复发率低，但是配型效率极低，来源有限，从而限制了异基因hsc移植的临床应用。
4.因此，目前本领域迫切需要寻求更为安全、成本较低、来源稳定的造血干/祖细胞资源。多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞，能分化为体内各种组织，可以用来制作疾病模型、进行药物毒性检验，并可通过细胞移植，取代损伤病变的细胞，促进机体创伤修复和治疗疾病。造血干细胞终身存在于生物体内，能够分化为血液系统的各类细胞，包括红细胞、粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、小胶质细胞、树突细胞、b-淋巴细胞、t-淋巴细胞、nk-淋巴细胞等，在临床治疗血液类疾病、癌症等方面有重要价值。
5.造血干细胞能够重建造血系统，能分化为各种谱系的造血细胞并且维持自身的干性，但是体外在单细胞水平上分离造血干细胞难以大量扩增，而体外通过干细胞诱导分化难以获得体内长期重建的造血干细胞，只能获得体内短期重建的造血祖细胞，而造血祖细胞具有造血干细胞的特性，可以分化各谱系血细胞，用于解决临床血液类疾病。
6.目前诱导人类多能干细胞向造血祖细胞分化的途径主要有：拟胚体分化法和基质细胞共培养法。这些方法也存在一些缺陷：拟胚体法一般需要消耗大量多能干细胞，其分化阶段的不一致导致其分化效率普遍较低且耗时较长；基质细胞共培养法效率不稳定，会引入动物源成分；或者使用了含有血清的培养体系或滋养层细胞，因而不适于后续临床级细胞制剂的生产。因此，本领域迫切需要开发在无血清条件下，化学成分确定的、高效、快速制备分化稳定的造血祖细胞的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于开发在无血清条件下，化学成分确定的、高效、快速制备分化稳定的造血祖细胞的方法。
8.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一个方面，提供造血祖细胞的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将多能干细胞进行培养，获得拟胚体；
11.(2)将所述拟胚体进行中胚层分化培养，获得中胚层细胞；
12.(3)将所述中胚层细胞进行生血内皮分化培养，获得生血内皮细胞；
13.(4)将所述生血内皮细胞进行造血祖细胞分化培养，获得造血祖细胞。
14.优选的，所述步骤(1)的培养体系包含rock抑制剂。优选的，所述rock抑制剂包括但不限于选自以下的至少一种：blebbistatin、ha-100、y-27632、ha-1077、kd-025、y-33075和narciclasine。优选的，所述rock抑制剂的浓度为1-50μm；更优选为5-20m；更进一步优选为10μm。优选的，所述rock抑制剂是y-27632，其浓度为1-50μm；更优选为5-20μm；更进一步优选为10μm。
15.优选的，所述步骤(1)的培养体系是包含rock抑制剂的多能干细胞培养基。优选的，所述多能干细胞培养基包括但不限于以下：e8培养基、mtesr培养基、stemfit basic 03、stemfit basic 04、nutristem hpsc xf培养基、stemmacs ips-brew培养基、stem-part ner acf培养基、tesr-aof培养基和tesr2培养基。
16.优选的，所述步骤(1)的培养时间为12-30小时，更优选为15-24小时；更进一步优选为20-24小时。
17.优选的，所述步骤(2)的培养体系中，包含bmp4和/或gsk-3β抑制剂。优选的，所述步骤(2)的培养体系中，包含gsk-3β抑制剂。
18.优选的，所述bmp4的浓度是0-100ng/ml；更优选的，所述bmp4的浓度是5-50ng/ml；更进一步优选的，所述bmp4的浓度是10-20ng/ml。
19.优选的，所述gsk-3β抑制剂包括但不限于选自以下的至少一种：b216763、tws119、np031112、sb216763、chir-98014、azd2858、azd1080、sb415286、ly2090314和chi r-99021。优选的，所述gsk-3β抑制剂的浓度是0.5-20μm；更优选为1-10μm；更进一步优选为3-5μm。优选的，所述gsk-3β抑制剂是chir-99021，其浓度是0.5-20μm；更优选为1-10μm；更进一步优选为3-5μm。
20.优选的，所述步骤(2)的培养体系不包含抗生素。抗生素包括但不限于：两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素、红霉素、青霉素、链霉素。优选的，所述步骤(2)的培养体系中不添加青霉素、链霉素。优选的，所述抗生素为青霉素和/或链霉素。更优选的，所述抗生素为青霉素-链霉素。
21.优选的，所述步骤(2)的培养体系中不添加硫代甘油(monothioglycerol，mtg)。
22.优选的，所述步骤(2)中的培养体系是包含bmp4和/或gsk-3β抑制剂的基础培养基。
23.优选的，所述步骤(2)的培养体系或所述基础培养基包含选自以下的至少一种、至少二种、至少三种或四种：b27添加剂，非必需氨基酸，谷氨酰胺，维生素c。优选的，所述b27添加剂是不含维生素a的b27添加剂。优选的，所述b27添加剂(如不含维生素a的b27添加剂)的添加浓度为0.5-10％，更优选为1-5％，更进一步优选为2％。所述非必须氨基酸的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。所述谷氨酰胺的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。上述百分比均为质量体积比，所述维生素c的
添加浓度为10-100ug/ml，更优选为20-50ug/ml，更进一步优选为50ug/ml。
24.优选的，所述步骤(2)的培养时间为18-54小时，更优选为20-48小时；更进一步优选为24-48小时。
25.优选的，所述步骤(3)的培养体系包含选自以下的至少一种、至少二种、至少三种或四种：bmp4、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、和tgfβ/alk抑制剂。
26.优选的，所述bmp4的浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是2-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是5-10ng/ml。
27.优选的，所述血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)包括但不限于选自以下的至少一种：vegf-a、vegf-165、vegf-183、vegf-110、vegf-121、ve gf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e和胎盘生长因子。优选的，所述vegf的浓度是5-100ng/ml；更优选的，所述浓度是10-50ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是20-50ng/ml。优选的，所述vegf是vegf-165或vegf-a，其浓度是5-100ng/ml；更优选的，所述浓度是10-50ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是20-50ng/ml。
28.优选的，所述成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)由约150-200氨基酸组成的多肽，以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)与酸性成纤维细胞生长因子(afgf)，所述fgf(酸性成纤维细胞因子和/或碱性成纤维细胞因子)的浓度是5-100ng/ml；更优选的，所述浓度是10-50ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是20-50ng/ml。优选的，所述fgf是fgf-2(bfgf)，其浓度是5-100ng/ml；更优选的，所述浓度是10-50ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是20-50ng/ml。
29.优选的，所述tgfβ/alk抑制剂包括但不限于选自以下的至少一种：sb431542、sb-505、a-83-01、gw6604、in-1130、ki26894、ly2157299、ly364947(hts-466284)、ly550410、ly573636、ly580276、npc-30345、sb-505124、sd-093、sm16、sm305、sx-007、antp-sm2a、ly2109761。优选的，所述tgfβ/alk抑制剂的浓度是1-50μm；更优选为5-20μm；更进一步优选为5-10μm。优选的，所述tgfβ/alk抑制剂是sb431542，其浓度是1-50μm；更优选为5-20μm；更进一步优选为5-10μm。
30.优选的，所述步骤(3)的培养体系不包含抗生素。抗生素包括但不限于：两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素、红霉素、青霉素、链霉素。优选的，所述步骤(2)的培养体系中不添加青霉素、链霉素。优选的，所述抗生素为青霉素和/或链霉素。更优选的，所述抗生素为青霉素-链霉素。
31.优选的，所述步骤(3)的培养体系中不添加硫代甘油(monothioglycerol，mtg)。
32.优选的，所述步骤(3)的培养体系是包含选自bmp4、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、和tgfβ/alk抑制剂中的至少一种、至少二种、至少三种或四种的基础培养基中培养。
33.优选的，所述步骤(3)的培养体系或基础培养基包含选自以下的至少一种、至少二种、三种或四种：b27添加剂，非必须氨基酸，谷氨酰胺，维生素c。优选的，所述b27添加剂是不含维生素a的b27添加剂。优选的，所述b27添加剂(如不含维生素a的b27添加剂)的添加浓度为0.5-10％，更优选为1-5％，更进一步优选为2％。所述非必须氨基酸的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。所述谷氨酰胺的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。上述百分比均为质量体积比，所述维生素c的添加浓度
为10-100ug/ml，更优选为20-50ug/ml，更进一步优选为50ug/ml。
34.优选的，所述步骤(3)的培养时间为2-6天，更优选为3-5天；更进一步优选为4天。
35.优选的，所述步骤(4)的培养体系包含选自以下的至少一种、至少二种、或三种：bm p4、血管内皮生长因子和干细胞因子。
36.优选的，所述bmp4的浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是2-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是5-10ng/ml。
37.优选的，所述血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)包括但不限于选自以下的至少一种：vegf-a、vegf-165、vegf-183、vegf-110、vegf-121、ve gf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e和胎盘生长因子。优选的，所述vegf的浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是5-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是10ng/ml。优选的，所述vegf是vegf-165或vegf-a，其浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是5-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是10ng/ml。
38.优选的，所述干细胞生长因子(stem cell factor,scf)的浓度是5-100ng/ml；更优选的，所述浓度是10-50ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是20-50ng/ml。
39.优选的，所述步骤(4)的培养体系不包含抗生素。抗生素包括但不限于：两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素、红霉素、青霉素、链霉素。优选的，所述步骤(2)的培养体系中不添加青霉素、链霉素。优选的，所述抗生素为青霉素和/或链霉素。更优选的，所述抗生素为青霉素-链霉素。
40.优选的，所述步骤(4)的培养体系中不添加硫代甘油(monothioglycerol，mtg)。
41.优选的，所述步骤(4)中的培养体系是包含选自bmp4、血管内皮生长因子和干细胞因子的至少一种、至少二种、或三种的基础培养基。
42.优选的，所述步骤(4)中的培养体系或基础培养基，包含选自以下的至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种：b27添加剂，非必须氨基酸，谷氨酰胺，维生素c，n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)，盐酸米诺环素(minocycline hydrochlori de)，和胰岛素-转铁蛋白-硒(its-g)。优选的，所述b27添加剂是不含维生素a的b27添加剂。优选的，所述b27添加剂(如不含维生素a的b27添加剂)的添加浓度为0.5-10％，更优选为1-5％，更进一步优选为2％。所述非必须氨基酸的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。所述谷氨酰胺的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。上述百分比均为质量体积比，所述维生素c的添加浓度为10-100ug/ml，更优选为20-50ug/ml，更进一步优选为50ug/ml。所述n-乙酰基-l-半胱氨酸的添加浓度为5-100um，更优选为10-50um，更进一步优选为30um。所述盐酸米诺环素的添加浓度为0.1-20um，更优选为1-5um，更进一步优选为2um。所述胰岛素-转铁蛋白-硒的添加的体积百分比为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。
43.优选的，所述步骤(4)的培养时间为4-8天，更优选为5-7天；更进一步优选为6天。
44.优选的，所述造血祖细胞的制备方法是在无血清条件下制备造血祖细胞的方法。
45.优选的，所述造血祖细胞的制备方法是在无维生素a条件下制备造血祖细胞的方法。
46.优选的，所述造血祖细胞的制备方法是在无抗生素条件下制备造血祖细胞的方法。
2％，更进一步优选为1％。上述百分比均为质量体积比，所述维生素c的添加浓度为10-100ug/ml，更优选为20-50ug/ml，更进一步优选为50ug/ml。
71.优选的，所述造血祖细胞分化培养体系包含选自以下的至少一种、至少二种、或三种：bmp4、血管内皮生长因子和干细胞因子。
72.优选的，所述bmp4的浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是2-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是5-10ng/ml。
73.优选的，所述血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)包括但不限于选自以下的至少一种：vegf-a，vegf-165，vegf-183，vegf-110，vegf-121，ve gf-b，vegf-c，vegf-d，vegf-e和胎盘生长因子。优选的，所述vegf的浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是5-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是10ng/ml。优选的，所述vegf是vegf-165或vegf-a，其浓度是1-50ng/ml；更优选的，所述浓度是5-20ng/ml；更进一步优选的，所述浓度是10ng/ml。。
74.优选的，所述干细胞生长因子(stem cell factor,scf)的浓度是5-100ng/ml；更优选的，所述浓度是10-50；更进一步优选的，所述浓度是20-50ng/ml。
75.优选的，所述造血祖细胞分化培养体系不包含抗生素。抗生素包括但不限于：两性霉素、制霉菌素、庆大霉素、四环素、红霉素、青霉素、链霉素。优选的，所述步骤(2)的培养体系中不添加青霉素、链霉素。优选的，所述抗生素为青霉素和/或链霉素。更优选的，所述抗生素为青霉素-链霉素。
76.优选的，所述造血祖细胞分化培养体系不包含硫代甘油(monothioglycerol，mtg)。
77.优选的，所述造血祖细胞分化培养体系是包含选自bmp4、血管内皮生长因子和干细胞因子的至少一种、至少二种、或三种的基础培养基。
78.优选的，所述造血祖细胞分化培养体系包含选自以下的至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种：b27添加剂，非必须氨基酸，谷氨酰胺，维生素c，n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)，盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride)，和胰岛素-转铁蛋白-硒。优选的，所述b27添加剂是不含维生素a的b27添加剂。优选的，所述b27添加剂(如不含维生素a的b27添加剂)的添加浓度为0.5-10％，更优选为1-5％，更进一步优选为2％。所述非必须氨基酸的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。所述谷氨酰胺的添加浓度为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。上述百分比均为质量体积比，所述维生素c的添加浓度为10-100ug/ml，更优选为20-50ug/ml，更进一步优选为50ug/ml。所述n-乙酰基-l-半胱氨酸的添加浓度为5-100um，更优选为10-50um，更进一步优选为30um。所述盐酸米诺环素的添加浓度为0.1-20xx，更优选为1-5um，更进一步优选为2um。所述胰岛素-转铁蛋白-硒的添加的体积百分比为0.2-10％，更优选为0.5-2％，更进一步优选为1％。
79.本发明的第三个方面，提供本发明第一方面所述制备方法，或采用本发明第二方面所述试剂盒制备得到的造血组细胞。
80.优选的，所述造血组细胞具有cd34+表型。
81.优选的，所述造血组细胞具有cd43+表型。
82.优选的，所述造血组细胞具有cd45+表型。
83.优选的，所述造血组细胞具有cd34+cd45+表型。
84.优选的，所述造血组细胞具有cd34+cd43+表型。
85.优选的，所述造血组细胞具有cd43+cd45+表型。
86.优选的，所述造血组细胞具有cd34+cd117+表型。
87.优选的，所述造血组细胞具有cd45+cd117+表型。
88.优选的，所述造血组细胞具有cd43+cd117+表型
89.优选的，所述造血祖细胞为人的造血祖细胞。
90.优选的，所述造血祖细胞为造血祖细胞群。
91.优选的，所述造血祖细胞具有选自下组(a)的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种特征：
92.(i)80％以上，85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原cd34+；
93.(ii)80％以上，85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd43+；
94.(iii)80％以上，85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd45+；
95.(iv)80％以上，85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd34+cd45+；
96.(v)80％以上，85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd34+cd43+；
97.(vi)80％以上，85％以上，90％以上，91％以上，92％以上，93％以上，94％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd43+cd45+；
98.(vii)30％以上，35％以上，40％以上，45％以上，50％以上，或55％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd45+cd117+；
99.(viii)30％以上，35％以上，40％以上，45％以上，50％以上，或55％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd34+cd117+；
100.(ix)30％以上，35％以上，40％以上，45％以上，50％以上，或55％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd43+cd117+。
101.优选的，本发明第一方面所述方法不需经过纯化和/或富集步骤，就可以获得具有上述(i)-(ix)中1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种特征的造血祖细胞。
102.优选的，所述造血祖细胞具有分化为cd34+cd45+血液前体细胞的能力。
103.优选的，所述造血祖细胞具有分化为红系血细胞的能力。
104.优选的，所述的造血祖细胞具有分化为髓系血细胞的能力。
105.优选的，所述的造血祖细胞还具有分化为淋巴细胞的能力。
106.本发明的第四个方面，提供包含本发明第三方面所述造血祖细胞的产品。
107.优选的，所述产品为药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明第三方面所述的造血祖细胞，以及药学上可接受的载体。
108.优选的，所述的药物组合物为液体制剂。优选的，所述的药物组合物为细胞制剂。优选的，所述的药物组合物为静脉注射试剂。优选的，所述药学上可接受的载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、dmso、及其组合。优选的，所述药物组合物中造血祖细胞的浓度为1
×
103个/ml-1
×
107个/ml，较佳地为1
×
10
4-1
×
106个/ml，更佳地为1
×
105个/ml-9.9
×
105个/ml。
109.本发明的第五个方面，提供本发明第三方面所述细胞的应用。
110.优选的，所述应用为在制备治疗和/或预防血液病的药物中的应用。
111.优选的，提供一种治疗血液病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第三方面所述的造血祖细胞、或施用本发明第四方面所述药物组合物。
112.优选的，所述的对象为哺乳动物，更优选为灵长类，更进一步优先为人。
113.优选的，施用部位为所述对象的静脉或骨髓内。
114.所述的血液病指与血液中的细胞病变有关的疾病，包括但不限于：贫血、血小板减少症、白血病、淋巴瘤、重型再障、多发性骨髓瘤或其组合。
115.本发明的有益效果是：
116.1本发明的分化方法可用于造血祖细胞的制备、体外扩增、维持；不仅可以快速、高效地制备造血祖细胞，而且所制备的造血祖细胞具有稳定的分化为多种不同血液细胞(包括同时具有红系、髓系及淋巴系细胞)的分化能力。
117.2本发明的分化方法通过对培养体系的优化，显著提高了分化效率以及获得造血祖细胞的数量；各标志物不仅表达比例高且稳定；而且各标志物在目标细胞中表达均一。
附图说明
118.图1是实施例1起始干细胞的显微镜下观察图。
119.图2是实施例1起始干细胞干性标记的流式细胞分析图；图2a是表面干细标记检测；图2b是膜内干系标记检测。
120.图3是实施例1中d0细胞和分化2天后的中胚层阶段的细胞显微镜下观察图；图3上方是d0开始分化时的细胞形态；图3下方是分化两天后中胚层阶段的细胞形态。
121.图4是实施例1中细胞分化两天的中胚层细胞的流式细胞分析图。
122.图5是实施例1中细胞在生血内皮阶段继续分化4天的细胞显微镜下观察图。
123.图6是实施例1中细胞在生血内皮阶段继续分化4天的流式细胞分析图。
124.图7是实施例1中细胞在造血祖细胞阶段继续分化6天的细胞显微镜下观察图。
125.图8是实施例1中细胞在造血祖细胞阶段继续分化6天的流式细胞分析图。
126.图9是实施例2起始干细胞的显微镜下观察图。
127.图10是实施例2起始干细胞干性标记的流式细胞分析图；图10a是表面干细标记检测；图10b是膜内干系标记检测。
128.图11是实施例2中分化2天后的中胚层阶段的细胞显微镜下观察图。
129.图12是实施例2中细胞分化两天的中胚层细胞的流式细胞分析图。
130.图13是实施例2中细胞在生血内皮阶段继续分化4天的细胞显微镜下观察图。
131.图14是实施例2中细胞在生血内皮阶段继续分化4天的流式细胞分析图。
132.图15是实施例2中细胞在造血祖细胞阶段继续分化6天的细胞显微镜下观察图。
133.图16是实施例2中细胞在造血祖细胞阶段继续分化6天的流式细胞分析图。
具体实施方式
134.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
135.定义
136.术语“多能性”是指具有分化成一种或多种组织或器官的所有细胞的潜力的干细胞，例如，三种胚层中的任何一种；内胚层(内部胃壁，胃肠道，肺)，中胚层(肌肉，骨骼，血液，泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。
[0137]“多能干细胞”是指能够产生所有三个生发层细胞的细胞，即内胚层，中胚层和外胚层。虽然理论上多能干细胞可以分化成身体的任何细胞，但多能性实验测定通常基于多能细胞分化成每个生发层的几种细胞类型。优选的，所述多能干细胞来源于哺乳动物，更优选来源于灵长类，更进一步优选来源于人。所述多能干细胞包括但不限于胚胎干细胞和/或诱导型多能干细胞。优选的，所述人多能干细胞(psc)为人胚胎干细胞(hescs)(例如h1、h9)和/或人诱导型多能干细胞(hipscs)(例如wc50、imr90)。优选的，所述人胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。在一些实施方式中，所述人胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
[0138]
术语“诱导的多能干细胞”，通常缩写为ips细胞或ipsc，是指通过引入或接触重编程因子，将非多能细胞(通常是成体体细胞)或终末分化细胞(例如成纤维细胞，造血细胞)人工制备的一种多能干细胞，如肌细胞，神经元，表皮细胞等。
[0139]
术语“胚胎干细胞”通常缩写为es细胞或esc，是源自早期胚胎的多能干细胞。
[0140]
术语“分化”是一种过程，通过该过程，较不特化的细胞形成至少一种更特化的新细胞类型的后代。
[0141]
术语“拟胚体”，即胚状体或聚集体，是指包含分化细胞，部分分化细胞和/或悬浮培养的多能干细胞的均质或异质细胞簇。为了概括体内分化固有的一些线索，本发明的某些方面可以使用三维拟胚体作为中间步骤。在细胞聚集开始时，可以启动分化并且细胞可以在有限程度上开始以重现胚胎发育。虽然它们不能形成滋养外胚层组织，但是生物体中存在的几乎所有其他类型的细胞都可以发育。本发明可以进一步促进拟胚体形成后的造血祖细胞分化。
[0142]
术语“造血祖细胞”，指从多能干细胞定向诱导分化形成的，如本发明第一方面中所述的造血祖细胞。本发明的造血祖细胞是同时具有红系、髓系及淋巴系的分化能力的造血祖细胞。
[0143]
术语“基础培养基”属于化学成分确定的培养基，包括但不限于如iscove's modified dulbecco's medium(imdm)，eagle's basal medium(bme)，eagle mem，dmem，ham，rpmi1640和fischer培养基等基础细胞培养基。
[0144]
术语“维生素c”包括维生素c或其各种形式的盐或其多种形式的衍生物。
[0145]
术语“谷氨酰胺”是指l-谷氨酰胺(l-glutamine)，是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，本发明中作为细胞培养的必需添加物。
[0146]
术语“sb431542”还包括sb431542及其盐，尤其是药学上可接受的盐。
[0147]
术语“chir99021”包括chir99021及其盐，尤其是药学上可接受的盐。
[0148]
术语“y-27632”还包括y-27632及其盐，尤其是药学上可接受的盐。优选的药学上可接受的盐是y-27632 2hcl。
[0149]
术语“硫代甘油”即monothioglycerol，mtg，是培养干细胞所必需的还原剂，与β-巯基乙醇等效。
[0150]
术语“骨形态发生蛋白4”即bone morphogenetic protein-4，bmp4，在胚胎发育时期对多种细胞的增殖分化具有调控作用。
[0151]
术语“不含维生素a的b27添加剂”是定制的添加剂，不含维生素a。维生素a(视黄醇)能被转化成视黄酸，后者可以诱导干细胞向神经细胞的分化。不含维生素a的配方是干细胞培养的理想选择。
[0152]
本领域的普通技术人员可以使用常规方法对造血祖细胞进行使用、处理、施用等操作。如：每批造血祖细胞发放或使用之前，必须通过无菌、内毒素和支原体检查，以及dna同一认定。每批发放的细胞都要符合细胞活力≥95％、细胞纯度(阳性指标≥95％，阴性指标《2％)。造血祖细胞急毒、过敏检测结果均呈阴性。
[0153]
细胞的检测标记
[0154]
本发明干细胞的表面干系标记为ssea4，tra-1-81,tra-1-60；膜内干系标记为nanog，oct4,sox2。中胚层阶段细胞检测标记为kdr。生血内皮阶段细胞检测标记为cd31，cd34，cd43，cd309。用本发明方法制备的造血祖细胞，可通过细胞表面抗原cd34，cd43，cd45，cd90，cd117的检测加以验证。
[0155]
cd34抗原是一种高度糖基化的单次跨膜蛋白，它选择性地表达于人造血干细胞(hsc)造血祖细胞(hpc)和血管内皮细胞(ec)表面。在本发明中，无需纯化和/或富集步骤，步骤(4)分化得到的总细胞群体中，表达cd34的造血祖细胞在总细胞群的比例优选为≥90％。
[0156]
kdr抗原，即cd309，是一种血管内皮生长因子(vegf)受体，在发育过程中于多种中胚层组织广泛表达，并表达于胚胎阶段的血管内皮细胞中。体外和体内数据显示kdr对于血管内皮细胞和造血细胞的发育形成至关重要。在本发明中，无需纯化和/或富集步骤，步骤(4)分化得到的总细胞群体中，表达kdr的造血祖细胞在总细胞群的比例优选为≥90％。
[0157]
cd43抗原是一种由snp基因编码的糖蛋白，又名白细胞唾液酸糖蛋白或唾液酸蛋白，表达于大多数血液白细胞如b细胞、t细胞、nk细胞、粒细胞表面。在本发明中使用cd43阳性这一特征标记从ipsc分化得到的造血祖细胞。在本发明中，无需纯化和/或富集步骤，步骤(4)分化得到的总细胞群体中，表达cd43的造血祖细胞在总细胞群的比例优选为≥90％。
[0158]
cd45抗原由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物p56lck和p59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用。cd45是成熟的血液前体细胞的表面标志物。在本发明中，无需纯化和/或富集步骤，步骤(4)分化得到的总细胞群体中，表达cd45的造血祖细
胞在总细胞群的比例优选为≥90％。
[0159]
可以使用通用的方法检测本发明造血祖细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与相应细胞表面抗原有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如fab'或(fab)2片段；单链fv分子(scfv)；或嵌合抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，可用流式细胞仪对细胞进行自动分析和/或分选。
[0160]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0161]
以下为本发明所采用的试剂的来源：
[0162]
[0163][0164]
实施例1造血祖细胞的制备
[0165]
采用的多能干细胞为esc，具体为h1 cell细胞系。
[0166]
1.造血祖细胞的制备
[0167]
1.1多能干细胞传代分化(h1 cell的培养条件为：六孔板无滋养层贴壁培养；h1 cell的分化为：低贴附六孔板悬浮培养)
[0168]
d-1培养基：e8培养基+10μm y27632
[0169]
将融合度达80％左右的多能干细胞从培养箱中拿出，弃掉培养基，用dpbs清洗一次，弃掉dpbs；每孔加入0.5ml accutase，37
°
二氧化碳培养箱孵育2min，2min后；每孔加入dmem/f12培养基中止酶作用，吹打细胞，将细胞收集到离心管中，离心1200r，5min，弃上清，加入1ml的e8培养基重悬细胞；将细胞进行ao/pi计数，细胞计数取所需细胞量到d-1培养基中，按照8
×
104cell/well的细胞量接种到低贴附六孔板，记为分化d-1。上下左右(十字交叉法)混匀细胞，放入37
°
，5％co2培养箱中培养20-24小时。
[0170]
1.2 stageⅰ：中胚层诱导分化(d0-d1)
[0171]
stageⅰ培养基：rpm1640培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+50ug/ml维生素c+20ng/ml bmp4+3um chir-99021。
[0172]
将d-1接种的细胞从培养箱中拿出，显微镜下观察细胞(拍照记录)，细胞呈球状；将低贴附六孔板倾斜放置，吸掉部分上清，留大约500μl左右上清，加入stageⅰ培养基，每孔2ml，轻轻混匀细胞，放回培养箱，分化两天后，收集细胞将进行流式检测内皮细胞kdr+的表
达比例。培养时间为42-48小时。
[0173]
1.3stageⅱ：生血内皮诱导分化(d2-d5)
[0174]
stageⅱ：rpm1640培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+50ug/ml维生素c+5ng/ml bmp4+50ng/ml vegf-165+50ng/ml fgf2+10um sb431542
[0175]
从培养箱中拿出将分化到d2的细胞，显微镜下观察细胞(拍照记录)。将低贴附六孔板倾斜静置，吸掉部分上清，每孔留大约500μl上清，加入stageⅱ培养基，每孔2ml，轻轻混匀细胞，放回培养箱。分化培养至d4时，从培养箱中拿出细胞，将低贴附六孔板倾斜静置，吸去上清，加入stageⅱ培养基，每孔2ml，混匀细胞，放回培养箱。分化至d6时，收集细胞进行流式检测，检测生血内皮表型的表达比例。
[0176]
1.4 stageⅲ：造血祖细胞诱导分化(d6-d12)
[0177]
stageⅲ培养基：imdm培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％neaa+1％glutama x+50ug/ml维生素c+5ng/ml bmp4+10ng/ml vegf-165+20ng/ml scf+30μm nac(n-乙酰基-l-半胱氨酸)+2μm minocycline hydrochloride
[0178]
将分化到d6的细胞从培养箱中拿出，显微镜下观察细胞(拍照记录)。将低贴附六孔板中的细胞倾斜放置，吸掉上清，每孔留大约500μl左右上清，加入stageⅲ培养基，每孔2ml，轻轻混匀细胞，放回培养箱。分化至d8时，从培养箱中拿出细胞，低贴附六孔板倾斜静置，吸去培养基，加入stageⅲ培养基，每孔2ml，轻轻混匀，放回培养箱。分化至d10时，按照d8同样操作换半液。分化到d12时，将分泌出的细胞离心(1500rpm，5min)收集，弃上清，用5ml的stageⅲ培养基重悬，然后将细胞悬液用40μm的筛网过滤，过滤后的细胞离心(1500rpm，5min)，弃上清，用1ml的stageⅲ培养基重悬进行细胞计数，以及造血祖细胞表面cd34+cd45+等标记比例的流式检测。
[0179]
2.不同阶段细胞的细胞检测
[0180]
流式细胞分析检测方法如下：
[0181]
1)将细胞收集，1500转/分钟，离心3分钟；
[0182]
2)弃上清，用pbs重悬细胞，过40目筛网，细胞ao/pi计数，离心5分钟，1500转/分钟；
[0183]
3)弃上清后，加入pbs，1500转/分钟，离心3分钟，弃去pbs；
[0184]
4)加入200μl含0.5％bsa的pbs,重悬细胞，根据需要加入各流式抗体，取用抗体时注意避光，混匀后在4度冰箱中放置30分钟；
[0185]
5)30分钟后，从4度冰箱中取出细胞，加入1ml的0.5％bsa离心细胞1500转/分钟，离心5分钟；
[0186]
6)弃上清，用500μl pbs洗细胞，每次离心细胞1500转/分钟，离心5分钟；
[0187]
7)弃上清，用200μl pbs重悬细胞，上机进行流式(novocyte 3000，进样器：ns200，厂家为：agilent technologies)分析。
[0188]
2.1起始干细胞
[0189]
取实施例1中起始干细胞，在显微镜下观察，形态分别如图1所示。图1左是4x显微镜下细胞形态，图1右是10x显微镜下细胞形态。
[0190]
对起始干细胞进行流式细胞分析，检测其干性标记。干细胞表面干系标记(ssea4，tr a-1-81,tra-1-60)的检测结果如图2a所示，干细胞膜内干系标记(nanog，oct4,sox2)检
测结果如图2b所示。如图2a所示，ssea4的表达比例为99.85％；tra-1-81的表达比例为99.61％；tra-1-60的表达比例为99.83％；如图2b所示，nanog表达比例为79.33％，oct4的表达比例为93.09％；sox2的表达比例为94.33％。表明初始的胚胎干细胞没有分化趋势，是正常合格的esc。
[0191]
2.2stageⅰ中胚层阶段(d0-d1)
[0192]
取实施例1中分化前的d0细胞，以及分化两天后还未进入生血内皮阶段的d2细胞，在显微镜下观察，形态分别如图3所示。图3上方左图是es细胞d0开始分化时细胞形态(4x)，图3上方右图是es细胞d0开始分化时细胞形态(10x)。图3下方左图是es细胞分化两天时的中胚层细胞形态图(4x)，图3下方右图是es细胞分化两天时的中胚层细胞形态图(10x)。如图3所示，分化两天的中胚层阶段细胞，其直径在100-200μm左右。
[0193]
对分化两天的中胚层阶段细胞进行流式细胞分析，检测其-kdr+(cd309)的表达，如图4所示，对于在stageⅰ中胚层阶段分化两天后的细胞，kdr+细胞的比例高达96.23％，表明分化的细胞处于中胚层-内皮细胞阶段。
[0194]
2.3stageⅱ生血内皮诱导分化阶段(d2-d5)
[0195]
取实施例1中在stageⅱ生血内皮诱导分化阶段继续分化4天的还未进入造血祖细胞诱导分化阶段的d6细胞，在显微镜下观察，形态分别如图5所示。图5左图是4x显微镜下细胞形态，右图是10x显微镜下细胞形态。如图5所示，分化6天的生血内皮阶段细胞，其直径在150-300μm左右。
[0196]
对stageⅱ继续分化4天的生血内皮诱导分化阶段的细胞进行流式细胞分析，检测其标志物cd31、cd34、cd43和kdr(cd309)的表达，如图6所示，fitc-cd31阳性的表达比例为48.08％；pe-cy7-cd34阳性的表达比例为62.68％；apc-cd43阳性的表达比例为43.22％；pe-cd309阳性的表达比例为53.05％。
[0197]
2.4 stageⅲ造血祖细胞诱导分化(d6-d12)
[0198]
取实施例1中在stageⅲ生血内皮诱导分化阶段继续分化6天的d12细胞，在显微镜下观察，形态分别如图7所示。图7是4x显微镜下细胞形态，分化12天的造细胞祖细胞，大小约为8μm，是呈圆形且胞核较大的独核单细胞。
[0199]
对stageⅲ继续分化6天的造血祖细胞进行流式细胞分析，检测其标志物的表达，如图8所示，分化d12的流式结果:cd34+cd45+比例：96.09％，cd34+cd43+比例：90.09％，cd45+cd43+比例：91.08％。
[0200]
3.造血祖细胞的数量检测
[0201]
(1)将分化到d12的细胞从培养箱中取出，显微镜下观察细胞，拍照记录；
[0202]
(2)将细胞放到超净台中，轻轻摇晃细胞板，然后将细胞收集到离心管中；
[0203]
(3)将离心管中的细胞离心1500rpm，5min；
[0204]
(4)弃上清，将细胞用3ml的stageⅲ培养基重悬，之后将细胞悬液用40um的筛网过滤(过滤掉未分化的eb球)；
[0205]
(5)将过滤后的细胞悬液，重新离心1500rpm，5min；
[0206]
(6)弃上清，用1ml的stageⅲ培养基重悬，之后取15ul的细胞悬液与15ul的ao/pi染料混匀，取20ul的液体到细胞计数板中，然后上机计数。
[0207]
h1 cell分化d12的细胞计数结果为：ao/pi细胞计数：2.08
×
106(六孔板一个孔分
泌的细胞量)；细胞活率：90.25％。
[0208]
实施例2造血祖细胞的制备
[0209]
实施例2造血祖细胞的制备与实施例1大致相同，不同之处仅在于采用的胚胎干细胞是h9 cell细胞系。
[0210]
2.不同阶段细胞的细胞检测
[0211]
按照实施例1方法对实施例2的各阶段细胞进行流式细胞分析。
[0212]
2.1起始干细胞
[0213]
取实施例2中起始干细胞，在显微镜下观察，形态分别如图9所示。图9左是4x显微镜下细胞形态，图9右是10x显微镜下细胞形态。
[0214]
按照实施例1方法对实施例2起始干细胞进行流式细胞分析，检测其干性标记。干细胞表面干系标记(ssea4，tra-1-81,tra-1-60)的检测结果如图10a所示，干细胞膜内干系标记(nanog，oct4,sox2)检测结果如图10b所示。图10表明初始的胚胎干细胞没有分化趋势，是正常合格的esc。
[0215]
2.2 stageⅰ中胚层阶段(d0-d1)
[0216]
取实施例2中分化两天后还未进入生血内皮阶段的d2(中胚层)细胞，在显微镜下观察，形态分别如图11所示。图11左右两图均是h9细胞分化两天时的中胚层细胞形态图(10x)。
[0217]
对分化两天的中胚层阶段细胞进行流式细胞分析，检测其-kdr+(cd309)的表达，如图12所示，对于在stageⅰ中胚层阶段分化两天后的细胞，kdr+细胞的比例高达95.96％，表明分化的细胞处于中胚层-内皮细胞阶段。
[0218]
2.3stageⅱ生血内皮诱导分化阶段(d2-d5)
[0219]
取实施例2中在stageⅱ生血内皮诱导分化阶段继续分化4天的还未进入造血祖细胞诱导分化阶段的d6细胞，在显微镜下观察，形态分别如图13所示。图12左图是4x显微镜下细胞形态，右图是10x显微镜下细胞形态。如图13所示，分化6天的生血内皮阶段细胞，其直径在150-300μm左右。
[0220]
对stageⅱ继续分化4天的生血内皮诱导分化阶段的细胞进行流式细胞分析，检测其标志物cd31、cd34、cd43和kdr(cd309)的表达，如图14所示。
[0221]
2.4 stageⅲ造血祖细胞诱导分化(d6-d12)
[0222]
取实施例2中在stageⅲ生血内皮诱导分化阶段继续分化6天的d12细胞，在显微镜下观察，形态分别如图15所示。图15是4x显微镜下细胞形态，分化12天的造细胞祖细胞，大小约为8μm，是呈圆形且胞核较大的独核单细胞。
[0223]
对stageⅲ继续分化6天的造血祖细胞进行流式细胞分析，检测其标志物的表达，如图16所示，分化d12的流式结果:cd34+cd45+比例：98.08％，cd34+cd43+比例：88.44％，cd45+cd43+比例：87.55％。
[0224]
3.造血祖细胞的数量检测
[0225]
按照实施例1方法对实施例2最终获得的目标细胞进行数量检测。
[0226]
h9 cell分化d12的细胞计数结果为：ao/pi细胞计数：1.8
×
106(六孔板一个孔分泌的细胞量)；细胞活率：91.38％。
[0227]
实施例3造血祖细胞的制备
[0228]
实施例的操作与实施例1大致相同，不同之处仅在于采用的是hipscs(购自士泽生物，货号xs-ips)。
[0229]
实施例4造血祖细胞的制备
[0230]
实施例的操作与实施例1大致相同，不同之处仅在于各阶段培养基如下：
[0231]
1.1d-1培养基：e8 medium培养基+10μm y27632
[0232]
1.2stageⅰ：中胚层诱导分化(d0-d1)
[0233]
stageⅰ培养基：rpm1640培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+50ug/ml维生素c+10ng/ml bmp4+5um chir-99021。
[0234]
1.3stageⅱ：生血内皮诱导分化(d2-d5)
[0235]
stageⅱ：rpm1640培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+50ug/ml维生素c+10ng/ml bmp4+20ng/ml vegfa+20ng/ml fgf2+5um sb431542
[0236]
1.4 stageⅲ：造血祖细胞诱导分化(d6-d12)
[0237]
stageⅲ培养基：imdm培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％neaa+1％glutama x+50ug/ml维生素c+10ng/ml bmp4+10ng/ml vegfa+50ng/ml scf+30μm nac(n-乙酰基-l-半胱氨酸)+2μm minocycline hydrochloride
[0238]
实施例5造血祖细胞的制备
[0239]
实施例的操作与实施例1大致相同，不同之处仅在于各阶段培养基以及培养时间如下：
[0240]
1.1 d-1培养基：mtesr培养基+10μm y27632
[0241]
1.2stageⅰ：中胚层诱导分化(d0)
[0242]
stageⅰ培养基：rpm1640培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+50ug/ml维生素c+5um chir-99021。
[0243]
1.3stageⅱ：生血内皮诱导分化(d1-d4)
[0244]
stageⅱ：rpm1640培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％非必须氨基酸+1％谷氨酰胺+50ug/ml维生素c+5ng/ml bmp4+50ng/ml vegfa+50ng/ml fgf2+10um sb431542
[0245]
1.4 stageⅲ：造血祖细胞诱导分化(d5-d12)
[0246]
stageⅲ培养基：α-mem培养基+2％不含维生素a的b27添加剂+1％neaa+1％gluta max+胰岛素-转铁蛋白-硒(its-g)(100x)+50ug/ml维生素c+5ng/ml bmp4+10ng/ml ve gfa+50ng/ml scf+30μm nac(n-乙酰基-l-半胱氨酸)+2μm minocycline hydrochl oride。
[0247]
对比例1
[0248]
与实施例1中制备造血组细胞的方法相同，不同之处在于：在stageⅰ、对stageⅱ和sta geⅲ培养基中均添加1％(质量体积比)含量的青霉素-链霉素。
[0249]
按照实施例1记载的方法检测对比例1得到造血祖细胞的数量和标志物表达。
[0250]
从以上实验结果可知，各阶段培养基中不添加青霉素-链霉素，能够显著提高造血祖细胞的数量，以及分化效率。
[0251]
对比例2
[0252]
与实施例1中制备造血组细胞的方法相同，不同之处在于：在stageⅰ、对stageⅱ和sta geⅲ培养基中均添加0.1mm的硫代甘油。
[0253]
按照实施例1记载的方法检测对比例2得到造血祖细胞的数量和标志物表达。
[0254]
从以上实验结果可知，各阶段培养基中不添加硫代甘油，能够显著提高造血祖细胞的数量，以及分化效率。
[0255]
对比例3
[0256]
与实施例1中制备造血组细胞的方法相同，不同之处在于：在stageⅰ、对stageⅱ和sta geⅲ培养基中均添加0.1mm的硫代甘油以及1％含量的青霉素-链霉素。
[0257]
按照实施例1记载的方法检测对比例3得到造血祖细胞的数量和标志物表达。
[0258]
从以上实验结果可知，各阶段培养基中不添加青霉素-链霉素和硫代甘油，能够显著提高造血祖细胞的数量，以及分化效率。
[0259]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.造血祖细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)将多能干细胞进行培养，获得拟胚体；(2)将所述拟胚体进行中胚层分化培养，获得中胚层细胞；(3)将所述中胚层细胞进行生血内皮分化培养，获得生血内皮细胞；(4)将所述生血内皮细胞进行造血祖细胞分化培养，获得造血祖细胞；所述制备方法在无抗生素条件下和/或无硫代甘油条件下制备造血祖细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的培养体系包含roc k抑制剂。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的培养体系包含bmp4和/或gsk-3β抑制剂。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的培养体系包含选自以下的至少一种：bmp4、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、和tgfβ/alk抑制剂。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的培养体系包含选自以下的至少一种：bmp4、血管内皮生长因子和干细胞因子。6.一种制备造血祖细胞的试剂盒，包括选自以下的至少一种：拟胚体培养体系，中胚层分化培养体系，生血内皮分化培养体系，和造血祖细胞分化培养体系；所述各培养体系不含有抗生素和/或硫代甘油。7.权利要求1-5任一项所述制备方法或权利要求6所述试剂盒制备得到的造血组细胞。8.根据权利要求7所述造血祖细胞，其特征在于：所述造血祖细胞具有选自下组(a)的至少一种特征：(i)90％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原cd34+；(ii)90％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd43+；(iii)90％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd45+；(iv)90％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd34+cd45+；(v)90％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd34+cd43+；(vi)90％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd43+cd45+；(vii)30％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd45+cd117+；(viii)40％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd34+cd117+；和(ix)30％以上的细胞具有造血祖细胞表面抗原组合cd43+cd117+。9.药物组合物，包含权利要求7或8所述的造血祖细胞，以及药学上可接受的载体。10.权利要求7或8所述造血祖细胞在制备治疗和/或预防血液病的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种干细胞诱导分化为造血祖细胞的方法。所述方法包括以下步骤：将多能干细胞进行培养，获得拟胚体；将所述拟胚体进行中胚层分化培养，获得中胚层细胞；将所述中胚层细胞进行生血内皮分化培养，获得生血内皮细胞；将所述生血内皮细胞进行造血祖细胞分化培养，获得造血祖细胞。本发明不仅可以快速、高效地制备造血祖细胞，而且所制备的造血祖细胞具有稳定的分化为多种不同血液细胞(包括同时具有红系、髓系及淋巴系细胞)的分化能力；通过对培养体系的优化，显著提高了分化效率以及获得造血祖细胞的数量。得造血祖细胞的数量。


技术研发人员：李翔 李雨 肖雄 黄陈稳
受保护的技术使用者：士泽生物医药（苏州）有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13