具有增强L-赖氨酸产率的菌株及其应用的制作方法

具有增强l-赖氨酸产率的菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有增强l-赖氨酸产率的菌株及其应用。


背景技术：

2.赖氨酸(lysine)又名2,6-二氨基己酸，属于碱性氨基酸。赖氨酸具有重要的营养生理功能，在医药、食品和饲料工业中应用广泛。同时，其也可作为前体物质用于合成尼龙聚合材料。赖氨酸的生产途径主要包括蛋白水解法、化学合成法以及发酵法三种，其中，微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为赖氨酸工业化生产应用最广的方法。
3.用于生产赖氨酸的原核微生物主要包括棒状杆菌、短杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌等。谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)是发酵生产氨基酸最为重要和安全的菌株，通过代谢改造提高它过量合成各种氨基酸的能力一直是研究热点。例如，过表达赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径强化以及优化细胞膜上赖氨酸转运蛋白等都有效提高了赖氨酸的生产率。
4.除了不断加强生成赖氨酸的代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得深入挖掘。烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶参与烟酸和烟酰胺代谢途径，具有转移含磷基团的功能。现阶段，从烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶角度研究谷氨酸棒状杆菌生产l-赖氨酸尚未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术中缺少一种高产量l-赖氨酸生产基因工程菌的缺陷，本发明通过失活烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的方式，提高谷氨酸棒杆菌在葡萄糖条件下发酵效率，显著提高l-赖氨酸产量。
6.本发明涉及属于棒杆菌属的微生物，其具有增强的l-赖氨酸生产力，还涉及利用其生产l-赖氨酸的方法。本发明提供了一种棒杆菌属物种的微生物以及通过使用该微生物生产l-赖氨酸的方法。所述微生物经过失活烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶cgl2352和过表达nad激酶cgl1413，从而具有提高l-赖氨酸生产能力。同时，当使用秸秆水解液时，重组菌株l-赖氨酸的转化率优于出发菌株。
7.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种基因工程菌，所述基因工程菌为在棒杆菌属出发菌中失活编码烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的基因cgl2352的菌株。
8.如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌还过表达编码nad激酶的基因cgl1413。
9.基因cgl2352编码烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶，基因cgl1413编码nad激酶，两者均在棒杆菌属微生物中天然存在。可从谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组的完整序列分析来
评价该酶活性。
10.如技术方案之一所述的基因工程菌，所述棒杆菌属出发菌为谷氨酸棒状杆菌，和/或，编码所述烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的核苷酸序列如seq id no:1所示，和/或，编码所述nad激酶的核苷酸序列如seq id no:12所示。
11.如技术方案之一所述的基因工程菌，所述棒杆菌属出发菌可以是谷氨酸棒状杆菌caths141，谷氨酸棒状杆菌b253，但不限于这些实施例。谷氨酸棒杆菌caths141的保藏号为cctcc no:m 20211495。c.glutamicum b253购买自上海工业微生物所。
12.可以利用任何本领域已知的方法引入失活。在本发明的微生物中，失活的意思指cgl2352基因的表达低于野生菌株的表达或者根本不表达，或者即使cgl2352基因表达，但cgl2352酶根本不具有活性或具有减弱的活性。过表达cgl1413的意思是通过额外引入、更换启动子等方式提高该基因的表达量。
13.在本发明的一个实施方案中，可以通过用具有抗生素标记和部分cgl2352基因区域、全部cgl1413基因序列的载体转化来引入失活。将所述载体转化到微生物中并在选择标记存在的条件下培养导致部分cgl2352基因序列和微生物固有基因的同源重组。通过同源重组，微生物的原基因被重组，并且在具有重组基因的微生物中，仅具有上述标记的重组微生物被选择。结果，可以获得具有失活cgl2352和过表达cgl1413基因的微生物。然而，获得本发明微生物的方法并不限于该这种同源重组方法，可以使用本领域已知的任何方法，例如通过sirna或crispr技术沉默cgl2352基因，并在出发菌中转化过表达cgl1413基因的质粒，也属于本发明保护的范围。
14.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种制备l-赖氨酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中发酵如技术方案之一所述的基因工程菌；优选地，所述发酵培养基为含有不低于25g/l葡萄糖的培养基，和/或，所述发酵的条件为：温度28-32℃，通气量为1.0-1.7vvm，ph为6.8-7.2，和/或，发酵时进行搅拌，搅拌的转速为400-800rpm。
15.在本发明的一个实施方案中，所述发酵培养基含有80-150g/l的葡萄糖，发酵温度为30℃，ph为7.0，通气量为1.4vvm，搅拌的转速为600rpm。
16.如技术方案之二所述的方法，所述发酵培养基为木质纤维素水解液，例如秸秆水解液，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后形成的水解液。农作物秸秆经酶解糖化后，秸秆中大分子碳水化合物如纤维素、半纤维素和木质素等被降解为小分子碳水化合物，如葡萄糖。
17.在本发明的一个实施方案中，在所述水解液中添加硫酸铵、甲硫氨酸和苏氨酸，例如，在所述水解液中添加15～25g/l硫酸铵和2～8g/l甲硫氨酸和2～8g/l苏氨酸；可选地，所述农作物秸秆在进行酶解糖化制备水解液前进行预处理，所述预处理包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。预处理可以提高农作物秸秆的糖化效率。其中的脱毒处理可以降低乙酸、糠醛、5-羟基苯甲醛、糠醛、羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、乙酰丙酸等毒性抑制物的含量。
18.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：如技术方案之一所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括向出发菌转入失活组件；所述失活组件包含编码烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的基因cgl2352的上游片段、下游片段，以及替换片段，获得所述基因cgl2352失活的基因工程菌。
19.如技术方案之三所述的构建方法，所述上游片段的核苷酸序列如seq id no:4所示；和/或，所述下游片段的核苷酸序列如seq id no:7所示；和/或，所述替换片段的核苷酸序列如seq id no:10所示。
20.在本发明的一个实施方案中，所述失活组件的核苷酸序列如seq id no:11所示。
21.如技术方案之三所述的构建方法，所述构建方法还包括向所述基因工程菌转入nad激酶基因过表达组件，或转入含有所述nad激酶基因过表达组件的重组载体。
22.在本发明的一个实施方案中，所述nad激酶基因过表达组件包含peftu启动子和nad激酶基因cgl1413；和/或，所述nad激酶基因过表达组件整合在所述基因cgl2352的位点；和/或，所述重组载体的骨架质粒为pk18mob。
23.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：如技术方案之一的基因工程菌在制备l-赖氨酸中的应用。
24.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
25.本发明所用试剂和原料均市售可得。
26.本发明的积极进步效果在于：
27.本发明提供的失活烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的方式，有效提高葡萄糖利用效率，进而提高l-赖氨酸的产量。且发现使用秸秆水解液时，本发明的基因工程菌的赖氨酸产量比出发菌明显提升。本发明提供的基因工程菌可以有效利用秸秆等农业废料进行发酵，具备良好的应用前景。
28.生物材料保藏信息
29.本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株caths141，已于2021年11月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctcc no:m 20211495，保藏日期2021年11月29日。培养物名称为caths141，分类名称为corynebacterium glutamicum caths141。
具体实施方式
30.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
31.一、本发明所使用的菌株
32.大肠杆菌e.coli dh5α用于表达质粒和敲除质粒的构建，谷氨酸棒状杆菌caths141是一株用于生产赖氨酸的菌株，本实验中caths141主要作为出发菌株进行使用。
33.二、试剂与培养基
34.纤维素酶ctec 2.0用于水解木质纤维素中的纤维素和半纤维素，购自中国北京的诺维信(中国)公司。根据nrel lap-006指南中的方法测得纤维素酶的滤纸酶活为203.2fpu/ml，纤维二糖酶活为4900.0cbu/ml，根据bradford方法测得蛋白浓度为87.3mg/ml。限制性内切酶用于切割质粒或基因片段产生粘性末端，购自thermo scientific(wilmington,de,usa)。dna聚合酶用于扩增基因片段，dna连接酶用于连接酶切过的基因片段和质粒载体，这两种酶都是购自takara(otsu,japan)。无缝克隆试剂盒用于连接含有同
源片段的基因片段和质粒载体，购自汉恒生物科技公司(nanjing,china)。质粒抽提试剂盒，pcr产物纯化回收试剂盒和凝胶回收试剂盒都是购自上海捷瑞生物科技公司(shanghai，china)。其他试剂从本地供应商处购买。
35.培养大肠杆菌使用的培养基是luria-bertani(lb)培养基，具体成分如下：10.0g/l氯化钠，10.0g/l蛋白胨和5.0g/l酵母提取物。
36.培养谷氨酸棒状杆菌所用的培养基具体成分如下：1)种子培养基：25g/l葡萄糖，1.5g/l磷酸二氢钾，2.5g/l尿素和0.6g/l硫酸镁，25g/l玉米浆。2)发酵培养基：1g/l磷酸二氢钾，3g/l尿素，0.6g/l硫酸镁，20g/l玉米浆，视情况添加葡萄糖作为碳源。
37.实施例1：出发菌谷氨酸棒杆菌的获得
38.收集新疆乌苏的土壤样品，每1g土壤样品添加至10ml无菌水中，剧烈混匀1min后将静置沉淀一段时间，再将原样品分别稀释成10-3
、10-4
、10-5
涂布在含有100mg/l制霉菌素的lb琼脂平板上，并在30℃下培养。经多次划线分离培养，获得纯化单菌落。
39.通过分离纯化获得一株可以生产l-赖氨酸的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行菌体特征、生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落湿润，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为浅黄色；用细菌基因组dna提取试剂盒，提取该菌株的dna，以其dna为模版，使用细菌通用引物27f和1492r，并使用16s rdna进行pcr扩增，进行测序后获得菌株16s rdna序列,将菌株的16s rdna序列在genbank数据库中比对，鉴定该菌株为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。
40.小麦秸秆经过酸预处理、脱毒和酶水解后得到小麦秸秆水解液，以上述分离纯化得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过使用紫外线、亚硝基胍、5-氟尿嘧啶、artp等多次单独诱变及复合诱变，获得能够耐受秸秆水解液中的毒性抑制物进行正常的生长和赖氨酸生产的稳定菌株。将该菌株命名为caths141，现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctcc no:m 20211495，保藏日期2021年11月29日。
41.实施例2：构建cgl2352失活组件
42.具体构建方法为：以c.glutamicum的基因组为模板，利用2352u-f(如seq id no:2所示)和2352u-r(如seq id no:3所示)引物通过pcr的方法扩增得到2352up片段(如seq id no:4所示)；以c.glutamicum的基因组为模板，2352d-f(如seq id no:5所示)和2352d-r(如seq id no:6所示)引物通过pcr的方法扩增得到2352down片段(如seq id no:7所示)；以质粒pxmj19质粒(购买途径见http://www.miaolingbio.com/plus/view.php？aid＝1398)为模板，利用cm-f(如seq id no:8所示)和cm-r(如seq id no:9所示)引物通过pcr的方法扩增得到cm片段(如seq id no:10所示)；以2352u，2352d和cm片段为模板，利用2352u-f和2352d-r引物，通过重叠延伸pcr的方式得到2352-cm融合片段(如seq id no:11所示)。
43.实施例3：构建cgl2352基因失活基因工程菌株
44.通过gibson方法将2352-cm片段插入到用psti和hindiii双酶切后的pk18mob质粒(购买途径见http://www.biovector.net/product/1089.html)，得到pk18-2352质粒。期间，可利用含有卡那霉素抗性的种子培养平板筛选连接成功的质粒。接着通过电转的方式将整合质粒pk18-2352转入c.glutamicum中，通过同源重组的方式将2352-cm片段替换cgl2352基因，引起该基因失活。通过pcr验证的方式筛选出发生正确同源重组的菌株，得到重组谷氨酸棒状杆菌，命名为mut-1。
45.实施例4：构建cgl1413整合在cgl2352位点的基因工程菌株
46.本研究参考实施例2方式构建cgl1413(如seq id no.12所示)过表达在cgl2352位点的组件，用到的引物为k2352-f/r(如seq id no:13和14所示)，peftu-f/r(如seq id no:15和16所示)，o1413-f/r(如seq id no:17和18所示)，kd2352-f/r(如seq id no:19和20所示)。其中，引物k2352-f/r和引物kd2352-f/r分别扩增实施例2中的2352up片段和2352down片段；引物o1413-f/r用来扩增cgl1413片段，并插入在cgl2352位点。期间用到的质粒模板为pk18mob质粒。参考实施例3构建获得失活cgl2352和过表达cgl1413的工程菌株，命名为mut-2。
47.实施例5：利用基因工程菌株发酵生产l-赖氨酸
48.将基因工程菌株mut-1,mut-2和谷氨酸棒杆菌亲本菌株caths141接种到种子培养基中进行两轮活化，然后转接到发酵培养基中。发酵培养基包括1g/l磷酸二氢钾，3g/l尿素，0.6g/l硫酸以及20g/l玉米浆，添加120g/l葡萄糖作为碳源。发酵在250ml的摇瓶中进行，培养条件为30℃，200rpm，发酵时间为48小时。发酵结果如表1所示，发现基因工程菌株葡萄糖-赖氨酸转化率都高于对照菌株，尤其是菌株mut-2。
49.表1 不同重组谷氨酸棒杆菌的发酵
50.菌株葡萄糖-赖氨酸转化率(％)caths14123.39mut-126.52mut-228.42
51.实施例6：基因工程菌在木质纤维素水解液中的发酵
52.秸秆物料的水解液中除了含有葡萄糖等易用碳源外，还存在酚、醛和酸类等抑制物。本专利选用小麦秸秆水解液进一步比较了基因工程菌株和其对照菌株生产l-赖氨酸的性能。具体步骤为：首先将小麦秸秆经过粉碎，再通过直径为10毫米的筛网进行筛分，筛分后的秸秆再经过水洗除去泥土，石块和金属等杂质，在105℃烘箱中烘干至恒重后保存在封闭的塑料袋中备用。再通过酸预处理、生物脱毒和酶解糖化后，分离得到小麦秸秆水解液，其含有95.4g/l葡萄糖。在水解液中添加20g/l硫酸铵和5g/l甲硫氨酸和苏氨酸，发酵温度为30℃，ph用氨水控制在7.0，通气量为1.4vvm，转速为600rpm，以葡萄糖耗完为发酵终止时间。
53.结果发现以小麦秸秆水解液为培养基时，在葡萄糖都耗尽的情况下，两株菌在赖氨酸转化率上出现显著差异，其中对照菌株caths141的葡萄糖到赖氨酸转化率为21.06％，而基因工程菌株mut-2的葡萄糖到赖氨酸转化率达24.42％。当使用谷氨酸棒状杆菌b253为出发菌，按照和菌株mut-2相同的改造方法改造得到菌株命名为b253-mut2，验证其在上述相同的发酵条件下发酵效果，发现b253-mut2最终赖氨酸转化率比对照菌株b253提高了12.75％。据此可知，本发明得到的重组菌株在真实物料水解液中具有高效的赖氨酸生产能力，因而具备良好的应用前景。
54.以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为在棒杆菌属出发菌中失活编码烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的基因的菌株。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还过表达编码nad激酶的基因。3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述棒杆菌属出发菌为谷氨酸棒状杆菌，和/或，编码所述烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的核苷酸序列如seq id no:1所示，和/或，编码所述nad激酶的核苷酸序列如seq id no:12所示。4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述棒杆菌属出发菌为谷氨酸棒状杆菌caths141或谷氨酸棒状杆菌b253。5.一种制备l-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵培养基中发酵如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌；优选地，所述发酵培养基为含有不低于25g/l葡萄糖的培养基，和/或，所述发酵的条件为：温度28-32℃，通气量为1.0-1.7vvm，ph为6.8-7.2，和/或，发酵时进行搅拌，搅拌的转速为400-800rpm；更优选地，所述发酵培养基含有80-150g/l的葡萄糖，发酵温度为30℃，ph为7.0，通气量为1.4vvm，搅拌的转速为600rpm。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为木质纤维素水解液，例如秸秆水解液，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后形成的水解液；优选地，在所述水解液中添加硫酸铵、甲硫氨酸和苏氨酸，例如，在所述水解液中添加15～25g/l硫酸铵和2～8g/l甲硫氨酸和2～8g/l苏氨酸；可选地，所述农作物秸秆在进行酶解糖化制备水解液前进行预处理，所述预处理包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。7.一种如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括向出发菌转入失活组件；所述失活组件包含编码烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的基因cgl2352的上游片段、下游片段，以及替换片段，获得所述基因cgl2352失活的基因工程菌。8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述上游片段的核苷酸序列如seq id no:4所示；和/或，所述下游片段的核苷酸序列如seq id no:7所示；和/或，所述替换片段的核苷酸序列如seq id no:10所示；优选地，所述失活组件的核苷酸序列如seq id no:11所示。9.如权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括向所述基因工程菌转入nad激酶基因过表达组件，或转入含有所述nad激酶基因过表达组件的重组载体；优选地，所述nad激酶基因过表达组件包含peftu启动子和nad激酶基因cgl1413；和/或，所述nad激酶基因过表达组件整合在所述基因cgl2352的位点；和/或，所述重组载体的骨架质粒为pk18mob。10.如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌在制备l-赖氨酸中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有增强L-赖氨酸产率的基因工程菌及其在制备L-赖氨酸中的应用。所述基因工程菌经过失活编码烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的基因，从而具有提高L-赖氨酸生产能力。本发明还公开了一种制备L-赖氨酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中发酵所述基因工程菌。本发明还公开了所述基因工程菌的构建方法。本发明提供的失活烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的方式，有效提高葡萄糖利用效率，进而提高L-赖氨酸的产量，具备良好的应用前景。具备良好的应用前景。


技术研发人员：张明明 杨晓晓 刘修才
受保护的技术使用者：CIBT美国公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13