一株产耐高温蛋白酶的菌株及其蛋白酶的制备方法

1.本发明属于乳品加工技术领域，具体涉及一株产耐高温蛋白酶的菌株及其蛋白酶的制备方法。


背景技术：

[0002][0003]
我国是乳制品生产和消费大国，保障液态乳的品质安全对提高我国国民经济与健康水平具有重要的战略意义。蜡样芽孢杆菌是液态乳中检出率较高的食源性致病菌之一，除了具有耐热性强、产毒素等特点外，部分菌株还会分泌蛋白酶等代谢物，这些酶类物质会持续作用于液态乳，导致液态乳货架期内出现苦味、哈败味、分层、蛋白沉淀等品质缺陷，为液态乳的品质安全带来隐患，同时缩短了液态乳的货架期，造成了严重的经济损失。尽管uht乳杀菌温度较高，仍然不能幸免于耐热性较强的芽孢杆菌的滋生及耐热酶的分解变质。
[0004]
蜡样芽孢杆菌作为危害乳及乳制品品质的一个重要原因，研究蜡样芽孢杆菌蛋白酶的酶学性质及其对液态乳的品质影响尤为重要。


技术实现要素：

[0005]
本发明为了筛选出一株产耐热蛋白酶的蜡样芽孢杆菌及研究此蛋白酶的酶学性质，提供了一株产耐高温蛋白酶的菌株，所述菌株为蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)c58。
[0006]
本发明还提供了一种耐高温蛋白酶的制备方法，具体方法是将上述的蜡样芽孢杆菌 c58接种于一级lb种子培养基中，37℃摇床培养12h，转速2
×
g，再按2％的接种量接种于50ml的二级lb种子培养基中，将培养12h后的菌悬液稀释至106cfu/ml，然后接种至蛋白酶和脂肪酶琼脂培养基中，37℃培养箱培养24h，获得含有蛋白酶的菌悬液，离心取上清液，经纯化后获得所述耐高温蛋白酶。
[0007]
进一步地限定，所述lb种子培养基的组成为按重量分数计，脱脂乳粉8％，琼脂粉 1.5％，余量为水。
[0008]
进一步地限定，所述纯化步骤依次为硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析。
[0009]
进一步地限定，所述蛋白酶为含有二硫键的金属依赖性的碱性丝氨酸蛋白酶。
[0010]
进一步地限定，所述蛋白酶最适ph为9，最适温度为60℃，2mm和5mm的ca
2+
和fe
2+
对所述蛋白酶活性具有显著提高作用、mg
2+
对所述蛋白酶活性无显著影响、cu
2+
对所述蛋白酶活性具有显著抑制作用；所述蛋白酶在110-130℃热处理温度的d值为195.13-677.23s，t
1/2
为58.74-203.87s。
[0011]
本发明的有益效果：
[0012]
本发明通过筛选产蛋白酶的蜡样芽孢杆菌，利用沉淀和层析方法对c58菌株所产的耐热性蛋白酶进行纯化，并通过sds-page和质谱对c58菌株所产的蛋白酶进行鉴定，发现该蛋白酶名称为protease hhoa，具有丝氨酸内肽酶的活性，并对c58菌株所产的蛋白酶进行酶学特性的研究。
[0013]
本发明提供的蜡样芽孢杆菌c58菌株所分泌的耐热性蛋白酶会对原料乳品质产生危害。蛋白酶存在于乳中常会引起液态乳发生胶凝、变苦等不良现象，这缩短了液态乳的货架期，造成了严重的经济损失。
附图说明
[0014]
图1为具体实施方式一的蜡样芽孢杆菌菌株产生的蛋白酶的水解圈图；
[0015]
图2为具体实施方式一的蜡样芽孢杆菌菌株产蛋白酶能力的菌株数量及其水解指数分布散点图；
[0016]
图3为具体实施方式一的蜡样芽孢杆菌菌株所产的蛋白酶的酶活力柱形图；
[0017]
图4为具体实施方式一的蜡样芽孢杆菌菌株所产的蛋白酶在70℃30min热处理条件下的相对酶活力柱形图；
[0018]
图5为具体实施方式一的蜡样芽孢杆菌菌株所产的蛋白酶在100℃10min热处理条件下的相对酶活力柱形图；
[0019]
图6为具体实施方式二的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的deae sepharose f. f离子交换层析图谱；
[0020]
图7为具体实施方式二的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的sephadex g-100凝胶过滤层析图谱；
[0021]
图8为具体实施方式二的纯化后蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的sds-page 鉴定结果图；
[0022]
图9为具体实施方式三ph对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响变化图；
[0023]
图10为具体实施方式三温度对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响变化图；
[0024]
图11为具体实施方式三金属离子对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响柱状图；
[0025]
图12为具体实施方式三酶抑制剂对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响柱状图；
[0026]
图13为具体实施方式三蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的热失活动力学曲线变化图；
[0027]
图14为具体实施方式三蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的失活活化能变化图；
[0028]
图15为具体实施方式四蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶在28℃水解的液态乳样品图；
[0029]
图16为具体实施方式四蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶在10℃水解的液态乳样品图；
[0030]
图17为具体实施方式四在28℃蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶对液态乳的水解作用图；
[0031]
图18为具体实施方式四在10℃蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶对液态乳的水解作用图。
具体实施方式
[0032]
具体实施方式一：
[0033]
本实施方式中的55株蜡样芽孢杆菌是从黑龙江地区原料乳中分离得出的。
[0034]
本实施方式所述的产蛋白酶的蜡样芽孢杆菌的筛选过程为：
[0035]
蜡样芽孢杆菌纯化后接种于lb培养基(脱脂乳粉添加比例为8％(w/v)，琼脂粉添加比例为1.5％(w/v))，37℃摇床培养12h，转速2
×
g。按2％的接种量接入50ml的lb培养基中，将培养12h的菌悬液稀释至106cfu/ml，接种至已制备好的蛋白酶和脂肪酶琼脂培养基中，37℃培养箱培养24h。通过牛津杯法评估55株蜡样芽孢杆菌的蛋白酶活力，以游标卡尺测量水解圈直径的大小，以水解圈直径与菌落直径的差值和菌落直径的比值作为水解指数。
[0036]
结果：得到如图1所示的产生的蛋白酶的水解圈图和如图2所示的产蛋白酶能力的蜡样芽胞杆菌菌株数量及其水解指数分布散点图，从图1和图2可以看出，具有产蛋白酶和脂肪酶能力的菌株数量为25株且产蛋白酶的菌株的水解指数分布集中在2.00-2.50。
[0037]
对本实施方式蜡样芽孢杆菌产蛋白酶的酶活力进行研究，具体过程如下：
[0038]
将具有产蛋白酶能力的菌株活化后按照2％的接种量接种至全脂灭菌乳中，分别在 37℃培养24h，转速为1
×
g培养结束后，将样品在4℃低温条件下，15000
×
g离心20min，并使用0.45μm滤膜过滤上清液，取上清液测定其蛋白酶活力。
[0039]
反应体系：1.5％的偶氮酪蛋白溶液(50mm ph为7.2的pbs溶液溶解，溶液需充分混匀并静置2-3天)，20％的tca溶液。
[0040]
反应条件：100μl上清液+500μl的pbs缓冲液+100μl偶氮酪蛋白底物溶液
→
40℃反应60min
→
加入500μl的tca终止反应，室温静置30min
→
10000
×
g离心5min
→
取上清液200μl
→
酶标仪测定od
366
nm的吸光度值。蛋白酶活力的定义：在366nm下，每毫升蛋白酶溶液每小时吸光度值变化0.01为一个酶活力单位(1u)。
[0041]
结果：得到如图3所示的产蛋白酶的酶活力柱形图，从图3可以看出，有12株蜡样芽孢杆菌的产蛋白酶活力大于20u/ml，10株蜡样芽孢杆菌产蛋白酶活力在10～20u/ml 之间，3株蜡样芽孢杆菌的产蛋白酶活力小于10u/ml，l76菌株产蛋白酶能力最强，达到29.20u/ml，其次为c57菌株，蛋白酶活力为27.6u/ml，产蛋白酶活力最弱的菌株为 k36菌株，蛋白酶活力为2.4u/ml。
[0042]
对本实施方式的蜡样芽孢杆菌蛋白酶的耐热性进行研究，具体过程如下：
[0043]
将产酶活力较强的菌株按照2％的比例接种至灭菌乳中，28℃培养48h，在4℃的低温条件下，15000
×
g离心20min，并使用0.45μm滤膜过滤上清液，取上清液5ml置于无菌试管中测定其蛋白酶活力。
[0044]
将装有5ml上清液的无菌试管在70℃的热处理条件下加热30min和100℃的热处理条件下加热10min，处理完毕后立即在冰水中冷却至室温，测定蛋白酶的残留活性。以未经加热处理的蛋白酶作为对照，相对酶活力(ra)以热处理后残留的酶活力(ct)和对照组酶活力(c0)的百分比表示。
[0045]
结果：得到如图4所示的在70℃，30min热处理条件下的相对酶活力柱状图和如图 5所示的在100℃，10min热处理条件下的相对酶活力柱形图，从图4和图5可以看出，在70℃，30min的热处理条件下，23株蜡样芽孢杆菌产生的蛋白酶具有热稳定性，c58 菌株产生的蛋
白酶具有最高的热稳定性，其相对酶活力达到81.97％，l76菌株产生的蛋白酶的耐热性最弱，其相对酶活力为9.59％。在100℃，10min的热处理条件下，20株蜡样芽孢杆菌产生的蛋白酶具有耐热性，c58菌株产生的蛋白酶耐热性最强，为40.98％， k57菌株产生的蛋白酶耐热性最弱，相对酶活力为4.00％。
[0046]
具体实施方式二：
[0047]
本实施方式的蜡样芽孢杆菌c58菌株是从55株蜡样芽孢杆菌中多重筛选得到的。
[0048]
本实施方式对所述的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的耐热蛋白酶的提纯及质谱鉴定进行研究，具体过程如下：
[0049]
硫酸铵沉淀：将活化好的蜡样芽孢杆菌按照2％的比例接种至1l的bhi培养基中， 37℃培养48h。将培养物分装于50ml离心管中，在4℃的低温条件下，以10000
×
g离心20min，通过0.45μm滤膜将上清液过滤除菌。加入硫酸铵至80％的饱和度，冰水浴条件缓慢搅拌直至硫酸铵完全溶解。在4℃，10000
×
g离心20min分离沉淀物，取50ml 无菌0.01m pbs缓冲液洗涤离心管，混匀后测定蛋白酶活力及蛋白质含量，采用规格为 8000的透析袋，在4℃条件下透析48h，每隔6h更换一次透析液，用bacl2溶液检测so4
2-是否存在，直至去离子水中不出现沉淀透析后将蛋白酶液冷冻干燥，-20℃储存备用。
[0050]
离子交换层析：将蛋白冻干粉末用10mm ph 7.3的pbs溶液完全溶解后过离子交换层析柱deae-sepharose f.f(1.5
×
12cm)。平衡缓冲液为含有4mm cacl2和50μm zncl2的 50mm tris-hcl溶液(ph 7.4)，且平衡缓冲液需过0.22μm滤膜除菌，在上样前用100ml 平衡缓冲液冲洗离子交换层析柱以除去未吸附的蛋白质，在洗脱步骤中用线性梯度的 nacl(0-0.8m)洗脱液洗脱以获得蛋白酶，流速为12ml/h，每管分装3ml，检测收集的蛋白酶溶液在od
280nm
的吸光度值机蛋白酶活力，以离子交换层析前溶液中的蛋白酶活力为对照，计算蛋白酶的相对酶活力，将检测后具有活性的组分冷冻干燥，-20℃储存备用。
[0051]
凝胶过滤层析：将初步提纯的蛋白酶粉末复溶于10mm ph 7.3的pbs溶液中，过 sephadex g-100(1.6
×
60cm)凝胶过滤层析柱，并以0.3ml/min的流速进行色谱分离，平衡缓冲液流速为11ml/h，每管收集3ml，检测蛋白酶溶液在od
280nm
的吸光度值及蛋白酶活力，以凝胶过滤层析前溶液中的蛋白酶活力为对照，计算蛋白酶的相对酶活力，将具有酶活性的部分冷冻干燥后，-20℃储存备用。
[0052]
sds-page电泳方法鉴定酶的纯度及分子量：将冷藏样品取出，复溶于10mm ph 7.3 的pbs溶液，将样品与蛋白电泳上样缓冲液混合均匀后，沸水浴加热5min，4℃12000r/min 离心5min后上样。蛋白酶的上样量为20μl，分离胶浓度12％，浓缩胶浓度5％，初始电压80v，待溴酚蓝指示线进入分离胶后，调节电压至120v。电泳结束后在考马斯亮蓝r250 染色液中染色2h，然后用脱色液(甲醇:乙酸:水＝4:1:5)在摇床上脱色至背景清晰，使用 image quant tl凝胶成像系统拍照。
[0053]
蛋白酶的酶解及鉴定：向蛋白酶粉末中加入100mm tris-hcl溶液(ph8.0)，漩涡震荡以充分溶解蛋白。12000
×
g离心15min，取上清，加入二硫苏糖醇(dtt)至终浓度为 10mm，37℃孵育1h进行还原反应以打开二硫键，随后，加入碘乙酰胺(iaa)至终浓度为40mm，于室温、暗处进行烷基化反应以封闭巯基。加入适量100mm tris-hcl溶液(ph8.0)，加入胰蛋白酶，37℃孵育振24h后加入三氟乙酸终止酶切，调节溶液ph值至 6.0，12000
×
g离心15min，使用c18柱除盐。除盐后的肽段溶液经浓缩仪抽干后，于-20℃冻存，等待上机检测。
[0054]
质谱分析：肽段样品通过自动进样器吸入后结合至c18捕获柱，接着洗脱至分析柱进行分离。液相的流速设置为300ml/min。质谱ida模式分析时，每个扫描循环中包含一个ms全扫描(m/z范围是350-1500，离子累积时间250ms)，以及随后跟着的40个 ms/ms扫描(m/z范围是100-1500，离子累积时间50ms)。ms/ms采集的条件设置为母离子信号大于120cps，电荷数为+2～+5。离子重复采集的排除时间设置为18s。
[0055]
结果：得到如图6所示的deae sepharose f.f离子交换层析图谱和如图7所示的 sephadex g-100凝胶过滤层析图谱。从图6、图7、图8、表1和表2可以看出，经纯化鉴定得到了2.74mg蛋白酶，其纯化倍数为78.81、蛋白酶产率为11.63％，鉴定表明该蛋白酶名称为protease hhoa，分子量为43.907kda且具有丝氨酸内肽酶活性。
[0056]
表1蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的纯化结果表
[0057][0058]
表2蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的质谱鉴定结果表
[0059][0060]
具体实施方式三：
[0061]
本实施方式的蜡样芽孢杆菌c58菌株分泌的蛋白酶是经过纯化鉴定得到的。
[0062]
对本实施方式的蜡样芽孢杆菌c58菌株分泌蛋白酶的酶学性质进行研究，具体过程如下：
[0063]
ph对c58菌株所产蛋白酶活力的影响：将经ph为5、6、7、8、9、10的缓冲液溶解后的蛋白酶孵育1h测定蛋白酶活力，不同ph的缓冲液分别为乙酸钠缓冲液(ph4.0-5.0)，磷酸钾缓冲液(ph6.0)，tris-hcl缓冲液(ph7.0-9.0)和甘氨酸-naoh缓冲液(ph10.0)，以蛋白酶在ph为8时的蛋白酶活力为对照，计算相对酶活力。
[0064]
温度对c58菌株所产蛋白酶活力的影响：通过将蛋白酶溶液放于10℃～70℃的不同温度的反应体系下，孵育1h测定蛋白酶活力来确定最佳温度，以蛋白酶在40℃时的蛋白酶活力为对照，计算相对酶活力。
[0065]
金属离子对c58菌株所产蛋白酶活力的影响：将蛋白酶添加至含有5mm和10mm 的mgcl2、cacl2、feso4、cucl2的50mm pbs(ph7.3)缓冲液中，2℃下孵育30min，检测蛋白酶活力，以蛋白酶在不添加金属离子的50mm pbs(ph7.3)溶液的蛋白酶活力为对照，计算蛋白酶
的相对酶活力。
[0066]
蛋白酶抑制剂对c58菌株所产蛋白酶活力的影响：分别将蛋白酶添加至含有5mm和 10mm的苯基甲基磺酰氟(pmsf)，二硫代双硝基苯甲酸(dtnb)和乙二胺四乙酸(edta) 以及巯基乙醇(dtt)的50mm pbs(ph 7.3)溶液中，孵育条件为20℃30min，以不添加蛋白酶抑制剂的反应体系的蛋白酶活力为对照，计算相对酶活力。
[0067]
c58菌株所产蛋白酶热失活动力学：取5ml蛋白酶溶液于试管中，分别于110℃、 120℃、130℃的恒温油浴中热处理2min，每隔20s取试样，冰水浴中冷却后测定蛋白酶活力，计算热处理后剩余酶活力的百分比，若蛋白酶的热失活符合一阶动力学模型，则采用第二个公式，并计算t
1/2
值和d值。
[0068][0069]
lnc
t
＝-kt+lnc0ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0070]
式中，ra为残留酶活力；ct是蛋白酶溶液在第t秒的酶活力；c0是蛋白酶溶液的初始酶活力；k是热失活速率常数。
[0071][0072][0073]
结果：得到如图9所示的ph对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响变化图，从图9可以看出该蛋白酶在ph4～9之间呈上升趋势，ph大于9时，蛋白酶的酶活力呈下降趋势，以ph为8时的蛋白酶活力为对照，当ph为9时，蛋白酶的相对酶活力显著增加至(105.30
±
4.10)％(p《0.05)。因此，该蛋白酶为碱性蛋白酶。
[0074]
得到如图10所示的温度对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响变化图，从图10可以看出蛋白酶的相对酶活力在温度为10～60℃之间呈上升趋势，在温度大于 60℃时呈下降趋势，以40℃时的蛋白酶活力为对照，在60℃时钙蛋白酶具有最高的相对酶活力(126.56
±
0.58％)。在10℃时，蛋白酶仍然具有(41.25
±
6.32％)的相对酶活力，这说明蛋白酶在低温下仍旧能够催化化学反应的发生，而在80℃时，蛋白酶的相对酶活力下降至(75.63
±
0.98％)，这也说明了该蛋白酶具有耐热性。
[0075]
得到如图11所示的金属离子对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响柱状图，从图11可以看出当金属离子浓度分别为2mm和5mm时，mg
2+
对蛋白酶的活力无显著影响，ca
2+
和fe
2+
显著增高了蛋白酶的酶活力、蛋白酶的相对酶活力分别为111.11％和105.21％、126.35％和119.52％。而cu
2+
显著抑制了蛋白酶的相对酶活力，蛋白酶的相对酶活力分别显著下降至92.06％和85.71％。
[0076]
得到如图12所示的酶抑制剂对蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶活力的影响柱状图，从图12可以看出dtnb对蛋白酶活力无显著抑制作用，而dtt、edta和pmsf随着浓度的增加显著抑制了蛋白酶的酶活力。当抑制剂的浓度为2mm和5mm时，添加 dtt的蛋白酶溶液的相对酶活力分别为35.26％和0，添加edta的蛋白酶溶液相对酶活力分别为82.54％和42.86％，添加pmsf的蛋白酶溶液相对酶活力分别为6.34％和0。dtnb 为巯基反应物，dtt能
够破坏二硫键，因此该蛋白酶含有二硫键。又由于pmsf作用于丝氨酸蛋白酶，edta为金属离子螯合剂，能够螯合酶活性中心的金属离子类辅助因子，因此该蛋白酶为含有金属离子以及二硫键的丝氨酸蛋白酶。
[0077]
得到如图13所示的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的热失活动力学曲线变化图、如图14所示的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的失活活化能变化图和如表3所示的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的热力学参数表，从图13、图14和表3可以计算出在110～130℃热处理温度下的其d值在195.13～677.23s，t
1/2
为58.74～203.87s。
[0078]
表3蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶的热力学参数表
[0079][0080]
具体实施方式四：
[0081]
本实施方式中的蜡样芽孢杆菌c58菌株分泌的蛋白酶是经过纯化鉴定得到的。
[0082]
对本实施方式的蜡样芽孢杆菌c58菌株分泌的蛋白酶对液态乳蛋白质的水解作用进行研究，具体过程如下：
[0083]
将蛋白酶固体粉末添加至液态乳中，使液态乳中蛋白酶浓度为0.1mg/ml，同时以0.02％的比例添加叠氮化钠，防止细菌的滋生。28℃储存的样品，每隔4h取样，10℃储存的样品每隔24h取样，待储藏期结束后采用sds-page分析蛋白酶对uht乳蛋白的水解作用。
[0084]
结果：得到如图15所示的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶在28℃水解的液态乳样品图、如图16所示的蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶在10℃水解的液态乳样品图、如图17所示的在28℃蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶对液态乳的水解作用图和如图 18所示的在10℃蜡样芽孢杆菌c58菌株所产的蛋白酶对液态乳的水解作用图，从图15 和图16可以看出在28℃的第16h开始观察到蛋白沉淀现象，在24h时能够观察到明显的乳清析出，而在10℃的第6d观察到有少量乳清析出现象。从图17和图18可以看出蜡样芽孢杆菌c58菌株产生的蛋白酶首先水解液态乳中的κ-cn，当在28℃水解8h时κ-cn 被部分水解，当水解12h时几乎被完全水解，同时β-cn的条带逐渐变弱，在水解20h时，β-cn和α
s-cn被大量水解。10℃发生时，第3d开始，可以观察到蛋白酶逐渐水解κ-cn、在第5d和第6d水解β-cn和α
s-cn，而蛋白酶对β-lg和α-la几乎无水解作用。蜡样芽孢杆菌c58菌株产生的蛋白酶对酪蛋白的水解顺序为κ-cn》β-cn》α
s-cn。
[0085]
这意味着即使蜡样芽孢杆菌的菌体死亡，蛋白酶还会具有活性，一旦液态乳中存在耐热的蜡样芽孢杆菌及其蛋白酶，将难以保证液态乳货架期内的品质安全。

技术特征：
1.一株产耐高温蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株为蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)c58。2.一种耐高温蛋白酶的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的菌株接种于一级lb种子培养基中，37℃摇床培养12h，转速2
×
g，再按2％的接种量接种于50ml的二级lb种子培养基中，将培养12h后的菌悬液稀释至106cfu/ml，然后接种至蛋白酶和脂肪酶琼脂培养基中，37℃培养箱培养24h，获得含有蛋白酶的菌悬液，离心取上清液，经纯化后获得所述耐高温蛋白酶。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述lb种子培养基的组成为按重量分数计，脱脂乳粉8％，琼脂粉1.5％，余量为水。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤依次为硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述耐高温蛋白酶为含有二硫键的金属依赖性的碱性丝氨酸蛋白酶。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶最适ph为9，最适温度为60℃。

技术总结
一株产耐高温蛋白酶的菌株及其蛋白酶的制备方法，属于乳品加工技术领域。本发明为了获得一株分泌耐热蛋白酶的蜡样芽孢杆菌，对实验室现有的50株分离自原料乳的蜡样芽胞杆菌进行筛选，结果发现蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)C58可产生耐高温蛋白酶，该菌株产蛋白酶的活力约为24.6U/mL，在70℃30min和100℃10min耐热性实验中相对酶活力分别为81.97％和40.98％。经过纯化鉴定后表明该蛋白酶为ProteaseHhoA。本发明所述蜡样芽胞杆菌具备原料乳中芽孢杆菌的重要特征，且该菌株的来源为原料乳，可以用于蜡样芽孢杆菌对乳及乳制品的危害及控制办法的研究。乳制品的危害及控制办法的研究。乳制品的危害及控制办法的研究。


技术研发人员：姜毓君 满朝新 宋丹靓敏 梁雅琪 李誉
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2021.12.30
技术公布日：2023/7/13