一种通用型CAR-T细胞的制备技术及其应用的制作方法

一种通用型car-t细胞的制备技术及其应用
技术领域：
：1.本发明属于细胞生物学、分子生物学以及药物研发
技术领域：
：，具体涉及一种通用型car-t细胞的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.cd44基因编码的蛋白质是一种细胞表面糖蛋白，参与细胞间相互作用、细胞粘附和迁移。它是透明质酸(ha)的受体，还可以与其他配体相互作用，例如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(mmp)。这种蛋白质参与多种细胞功能，包括淋巴细胞活化、再循环和归巢、造血和肿瘤转移。目前对于cd44的研究主要集中在其在肿瘤干细胞中扮演的角色以及其不同变体在细胞粘附中的作用，也有极少的研究将cd44作为car-t细胞治疗的靶点，而将其直接应用于car-t治疗的研究尚未有相关报道。3.car-t免疫疗法通过基因工程改造患者自体t淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体，能够有效克服肿瘤细胞通过下调mhc分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，使得肿瘤细胞无处逃逸。目前，两种国内获批的带有嵌合抗原受体(car)的t细胞产品均来自自体t细胞，这些被批准用于临床的自体car-t细胞必须在定制的基础上产生。但由于昂贵的生产费用和漫长的生产过程，这种自体t细胞生产平台仍然是大规模临床应用的重要限制因素，此外还存在生产失败等风险。同时，个性化、定制的自体car-t细胞生产过程也限制了在不同肿瘤类型上的广泛应用。因此，需要通用型同种异体t细胞来制备通用型car-t细胞，这些细胞可以作为“现成的”即用型治疗剂，用于大规模临床应用。通用型car-t细胞能够显著缩短治疗周期同时降低成本，移植物排斥相关反应与疗效问题通过基因编辑技术与干细胞移植供体来源t细胞等策略亦能逐步解决，因此未来的市场竞争也更有优势。4.通用型car-t细胞是以健康供者的外周血中提取的t细胞为起始样品，利用基因编辑技术解决同种异体之间的免疫排斥问题，并同时在t细胞上装上特异靶向癌症靶点的car结构，最终可用于回输到同种异体癌症患者体内特异性靶向肿瘤细胞的一种异体移植活细胞药剂。5.目前行业内均面临的一大困境生产的通用型car-t细胞体内存续较差，即使加大回输剂量或增加回输次数也很难达到理想的治疗效果，而自体car-t细胞回输剂量相对低一些，且缓解率更高。但通用型car-t细胞可以实现的即用型、现货类、治疗成本低等优势是自体car-t细胞无法实现的。因此，制备体内存续时间长的通用型car-t很有必要。技术实现要素：6.本发明的目的之一，在于提供一种体内存续时间长的t细胞，该细胞可用于进一步制备car-t细胞。7.为实现上述目的，本发明的技术方案为：8.t细胞，所述t细胞表达cd44。9.进一步，所述的t细胞中，所述cd44的氨基酸序列如seqidno:12所示。10.进一步，所述的t细胞中，所述t细胞的cd4基因和/或cd8基因被敲除和/或失活。所述的cd44基因的氨基酸序列如seqidno.12所示；所述的cd4基因和cd8基因部分靶点序列如seqidno.1-11展示，该序列不仅限于此处展示的序列，且包含人体12号染色体上cd4基因:6,789,528-6,820,799forwardstrand中,人体2号染色体上cd8a基因:86,784,610-86,808,396reversestrand中以及人体2号染色体cd8b基因:86,815,339-86,861,924reversestrand中；基因编辑靶点所在位置表1展示包含的任一区域内可对基因本身造成缺失的靶点序列。11.进一步，所述的t细胞中，所述t细胞经过基因编辑获得。12.进一步，所述的t细胞中，所述t细胞经过天然分离获得。13.进一步，所述的t细胞中，所述的t细胞的β2-微球蛋白、和/或hla-i类分子共同亚基、和/或ciita的基因失去功能或缺失。14.进一步，所述的t细胞中，所述t细胞为同种异体t细胞。15.进一步，所述的t细胞中，所述的t细胞还表达hla-e和/或hla-g和/或hla-f。16.table1[0017][0018]table2[0019][0020]进一步，作为一种优化，所述t细胞还表达cd62l基因。[0021]进一步，所述的t细胞中的cd62l基因的氨基酸序列如seqidno.13-17所示。[0022]本发明的目的之二在于提供上述t细胞的制备方法，该方法为提供一种持续性长的细胞提供了制备思路[0023]为实现上述目的，本发明的技术方案为：[0024]所述的t细胞的制备方法，选用以下两种任一方法获得目的细胞：(1)活化t细胞后,感染包含cd44的病毒，对感染cd44后的t细胞进行rnp电转，获得目的细胞；(2)活化t细胞后再进行rnp电转,感染包含cd44的病毒，获得目的细胞[0025]进一步，所述t细胞为活化的和/或非活化的t淋巴细胞。[0026]进一步，所述的t细胞中的cd4基因和/或cd8基因的敲除或失活时机为：在t细胞扩增之后，或在t细胞扩增之前。[0027]进一步，所述的基因编辑技术是通过电转的方式或非电转的方式改造t细胞。[0028]进一步，所述基因编辑技术包括crispr/(cas9或cpf1)、zfn、talen。[0029]目的之二方法下获得的t细胞。[0030]本发明的目的之三在于提供一种长期存续能力高的car-t细胞，及其制备方法。上述细胞可商业化应用，该方法操作重现性好。[0031]为实现上述目的，本发明的技术方案为：[0032]由所述的t细胞制备的car-t细胞。[0033]进一步，car-t细胞中的car包含有胞外域、跨膜域和胞内信号域。[0034]进一步，所述car-t细胞为同种异体car-t细胞。[0035]进一步，所述car-t细胞还表达膜结合的il15。[0036]进一步，所述car-t细胞还表达分泌细胞因子，所述细胞因子包括il2、il7、il12、il21、il15。[0037]进一步，所述car-t细胞还表达且可识别肿瘤微环境中分子的融合蛋白，所述融合蛋白的胞外结构识别pd1、pdl1、sirpγ、sirpδ、tigit。[0038]进一步，所述car结构可被调控活化或失活，所述调控活化或失活的结构包括peptideneo-epitope(pne)、fluorescein(fitc)、10aminoacids(5b9tag)、fitc-hm-3bifunctionalmolecule(fhbm)andscfv、leucinezipfvlinkedtoantibody、streptavidin2(msa2)biotin-bindingdomain。[0039]进一步，所述car-t细胞可以识别实体瘤、血液系统肿瘤细胞/组织；所述car-t细胞的抗原识别区可以识别包含抗原：cd19、cd20、cd22、cd33、cll-1(clec12a)、cd7、cd5、cd70、cd123、ceacam5、ceacam6、ceacam7、mesothelin、muc1、cldn18.2、cdh17、trop2、bcma、nkg2d、pdl1、egfr、egfrviii、psca、psma、muc16、cd133、gd2、il13r2、b7h3、her2、cd30、slamf7、cd38、gpc3、wt1或tag-72。[0040]所述的car-t细胞的制备方法，选用以下两种任一方法获得目的细胞：[0041](1)收集获得t细胞，感染包含cd44和car结构的病毒，对感染car结构后的t细胞进行rnp电转，获得目的细胞；或[0042](2)收集获得t细胞，电转rnp该t细胞后，再感染包含cd44和car结构的病毒，获得目的细胞。[0043]进一步，基于car-t细胞的制备方法，包括以下步骤：1)构建含有目的基因片段(包含由不同启动子启动的针对特定肿瘤靶点的car结构序列和cd44基因片段)的病毒载体；2)将病毒载体感染t细胞，获得目的细胞。[0044]进一步，所述的制备方法中，活化敲除或失活cd4和/或cd8基因时采用crispr/cas9基因编辑技术改造t细胞；所述crispr/cas9基因编辑技术中涉及的rnp复合物具体为含有cd4sgrna和cd8sgrna以及cas9蛋白的rnp复合物。[0045]进一步，所述的制备方法，所述cas9蛋白和sgrna的摩尔比为1:2。[0046]本发明的目的之四在于提供一种能制备长存续能力car-t细胞的重组载体。[0047]为实现上述目的，本发明的技术方案为：[0048]感染所述的car-t细胞的重组载体，所述重组载体包含cd44和car结构。[0049]进一步，所述重组载体中选用表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体、rna载体、质粒中的任一种。[0050]本发明的目的之五在于提供细胞组合物，该细胞组合物有治疗作用。[0051]为实现上述目的，本发明的技术方案为：[0052]含有所述的t细胞和/或所述的car-t细胞的细胞组合物。[0053]进一步，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于不低于90％，80％，70％或60％。[0054]进一步，细胞组合物，所述的细胞组合物可以是经过活化诱导的cik细胞或nkt细胞。[0055]本发明的目的之六在于提供几组应用，该应用为临床提供好的治疗思路。[0056]为实现上述目的，本发明的技术方案为：[0057]所述的t细胞和或所述的car-t细胞和或所述的重组载体和或所述的细胞组合物在制备细胞治疗药物中的应用。[0058]进一步，所述的应用中，所述的t细胞和/或所述的car-t细胞和/或所述的重组载体和/或所述的细胞组合物在制备治疗急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和/或皮肤癌的药物中的应用。[0059]cd44用于制备car-t细胞的活力提升剂中的应用。[0060]cd44联合cd62l用于制备car-t细胞的活力提升剂中的应用。[0061]cd44用于制备car-t细胞分泌的pd-1和lag-3因子的抑制剂。[0062]在制备car-t细胞时，cd44基因作为肿瘤细胞杀伤的促进剂中的应用，所述car-t细胞为常规car-t细胞、不表达cd4和/或cd8基因的car-t细胞或通用型car-t细胞。[0063]本发明所述car结构可以是常规的第一代、第二代、第三代car结构，也可以是改进的双car、可调控car结构(如frb/fkbp12调控)等新型car结构。[0064]本发明所述car结构包含天然杀伤细胞受体(nkr)的一种或多种组分，因而形成nkr-car。nkr组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，例如kir2dl1、kir2dl2/l3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、dir2ds5、kir3dl1/s1、kir3dl2、kir3dl3、kir2dp1和kir3dp1；天然细胞毒性受体(ncr)，例如，nkp30、nkp44、nkp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族，例如，cd48、cd229、2b4、cd84、ntb-a、cra、blame和cd2f-10；fc受体(fcr)，例如，cd16、和cd64；和ly49受体，例如，ly49a、ly49c。所述的nkr-car分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，dap12)相互作用。[0065]本发明所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedivirus，vmv)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。[0066]本发明中的car-t可以采用专利201710305078.8、201710613317.6、201710618293.3、201510304389.3、201510648252.x、201810207761.2、201810934637.6、201811125906.0、201910407001.0、202010257762.5、202010259458.4、202010260805.5、202010260849.8、202010559366.8、202110556147.9以及其他公开的car-t结构中。[0067]本发明中所述car-t结构中的铰链区序列可以来源于：igg、cd8、cd7、cd4。[0068]本发明中所述car-t结构中的跨膜区序列可以来源于：cd8、cd28、cd3ε、cd4、cd16、cd137、cd80以及cd86。[0069]本发明中所述car-t结构中的胞内信号区可来源于：cd3、cd137、cd28、cd27、ox40、icos、gitr、cd2、cd40、pd-1、pd1l、b7-h3、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、icam-1、cd7、nkg2c、cd83、cd86以及cd127。[0070]本发明所述抗原识别区可以为识别靶抗原的配体/受体；scfv可以是鼠源抗体或全人源抗体或人鼠嵌合抗体的scfv，也可以是鲨鱼、羊驼或骆驼抗体等单域抗体，也可以是双特异性抗体，也可以是人工设计的识别特定靶点的靶点特异性纤连蛋白iii型(fn3)结构域组合。[0071]本发明中的car-t可以采用专利201710305078.8、201710613317.6、201710618293.3、201510304389.3、201510648252.x、201810207761.2、201810934637.6、201811125906.0、201910407001.0、202010257762.5、202010259458.4、202010260805.5、202010260849.8、202010559366.8、202110556147.9以及其他公开的car-t结构中，此类双阴性通用型car-t细胞疗法的应用可适用于任意一种除cd44靶点以外的car应用，且不受car其他靶点、结构的限制[0072]本发明中的du-car-t指的是敲除或cd4和或cd8基因的通用型car-t细胞。[0073]本发明中的44-19car指的是采用自体免疫细胞制备的表达cd44的car-t细胞。[0074]本发明中所公开的制备方法中活化后的t细胞可以通过病毒感染car结构，也可以使用转座子系统。[0075]本发明中，采用同种异体细胞制备的表达cd44的传统的通用型car-t为：cu-44-car-t；采用同种异体细胞制备的表达cd44的通用型car-t为：du-44-car-t。[0076]本发明的有益效果在于：[0077]1)本发明提供的双阴性通用型car-t细胞，不仅可以有效地表达于t淋巴细胞，而且能够加强car-t细胞的活性，增强car-t有效性，并且使car-t细胞有更优的表型，更低的衰竭表达，提高car-t细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗。[0078]2)本发明提供了一种可选择的通用型car-t细胞候选细胞，不仅可以在体内、外有效杀伤肿瘤靶细胞，用于肿瘤的靶向治疗，并且有高于传统自体car-t细胞和传统通用型car-t细胞的抗肿瘤效果。[0079]3)本发明提供的通用型car-t细胞，与传统通用型car-t细胞一样，在体外仅发生较低的gvh反应，可以用于制备同种异体car-t治疗，对car-t的临床应用以及肿瘤联合治疗新策略的开发具有重要的指导意义。[0080]4)本发明提供的方法制备的du-car-t可实现传统通用型car-t细胞同样较低程度的gvh反应，同时发明的44-car及通用型du-car在各方面均优于或不差于自体car细胞。附图说明[0081]图1为敲除率检测结果；[0082]图2为car阳性率检测结果；[0083]图3为体外药效学检测结果；[0084]图4为表型检测结果；[0085]图5为衰竭标志物检测结果；[0086]图6为活力监测结果；[0087]图7为gvh强度检测结果；[0088]图819car、du-19car与cu-19car的体内抗肿瘤检测结果比较；[0089]图919car和44-19car的体内抗肿瘤检测结果比较；[0090]图10du-44-19car和19car的体内抗肿瘤检测结果比较具体实施方式[0091]本实施例中的磁珠分选采用生物素标记的cd4和cd8抗体，并偶联抗生物素的microbeads，或采用cd4和cd8阳性磁珠，过柱分选，此外，采用流式分选仪器或其他可获得需要部分的方式进行分选均可，最后选择需要部分即可。流式检测敲除效率和分选纯度所用抗体：cd3：pe-cy7、cd4：fitc、cd8：bv510。本发明中所述双阴性car-t细胞制备方法：1、获取cd4和/或cd8单阳性t细胞，活化数小时后感染包含cd44和car结构的病毒，培养数小时后对感染car结构后的t细胞进行rnp电转，继续培养并分选出目的细胞；2、获取cd4和/或cd8单阳性t细胞，活化数小时后电转rnp该t细胞后，培养数小时后感染包含cd44和car结构的病毒，继续培养并分选出目的细胞。[0092]本专利中所使用的car的结构：胞外识别区(抗cd19scfv)-cd8来源铰链ꢀ‑cd8来源跨膜-胞内信号(cd137-cd3)，缩写序列为：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdiskylnwyqqkpgkaprlliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpytfgggtrleikgstsgsgkpgsgegstkgqvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgvslpdygvswirqppgkalewlgviwgsettyynsslktrltiskdnsknqvvltmtnmdpvdtatyycakhyyyggsyamdywgqgssvtvssletttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。[0093]实施例1.表达cd44的t细胞和44-19car(嵌合抗原受体t细胞)细胞制备[0094]cd44分子可与任意靶点和结构的嵌合抗原受体(car)组合获得本发明所公开的技术效果，这里以靶向cd19的嵌合抗原受体为例进行具体应用说明。同样，所述载体可以是慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体、rna载体、质粒中的任一种，这里以慢病毒载体为例进行说明：[0095]1)cd44表达载体构建[0096]如seqidno.12所示的cd44氨基酸序列所对应的基因片段，将上述目的片段和载体片段通过t4连接酶(购自promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，质粒抽提试剂盒(invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。所述载体可以是慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体、rna载体、质粒中的任一种。为阐述具体的制备方案，这里以慢病毒载体为例进行说明：[0097]将获得的编码cd44分子的基因序列用限制性内切酶nhei和xhoi(购自thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶nhei和xhoi酶切慢病毒表达载体prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre质粒(http://www.addgene.org/12252/),利用限制性内切酶nhei和xhoi酶同时酶切prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre质粒，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶dna片段回收试剂盒进行dna片段回收，然后将合成的带有nhei和xhoi酶切位点的cd44序列片段用限制性内切酶nhei和xhoi酶同时酶切后，与上述回收得到的dna片段进行连接，即可获得表达cd44的载体。[0098]2)表达cd44和特异性识别肿瘤的car基因的载体构建[0099]合成包含抗人cd19抗原的单链抗体scfv，铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌合抗原受体序列。[0100]然后以嵌合抗原受体序列和cd44分子分别为模板进行pcr扩增，反应体系按kodfxneodna聚合酶(购自toyobo公司)说明书加样，pcr反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环。将扩增产物用1％琼脂糖(w/v)凝胶进行鉴定。然后用回收试剂盒(promega公司)进行dna片段回收，具体方法见说明书，回收获得嵌合抗原受体和cd44分子片段，将dna回收片段送测序。[0101](2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：靶向cd19car-连接肽(多顺反子结构)-cd44[0102]将克隆获得的编码嵌合抗原受体和cd44的基因序列用限制性内切酶nhei和xhoi(购自thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶nhei和xhoi酶切慢病毒表达载体prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre质粒(http://www.addgene.org/12252/),利用限制性内切酶nhei和xhoi酶同时酶切prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre质粒，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶dna片段回收试剂盒进行dna片段回收，然后将合成的带有nhei和xhoi酶切位点的嵌合抗原受体和cd44序列片段用限制性内切酶nhei和xhoi酶同时酶切后，与上述回收得到的dna片段进行连接，即可获得同时装载有嵌合抗原受体和cd44分子的载体。[0103]上述car分子与cd44分子使用多顺反子结构连接，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点ires，所述自剪切多肽为t2a、p2a、e2a或f2a。这里以p2a为例，获得靶向cd19car-p2a-cd44的表达载体。[0104]酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶dna片段回收试剂盒进行dna片段回收，然后将目的片段和载体片段通过t4连接酶(购自promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体和cd44分子的慢病毒载体。将慢病毒载体取5μl转化大肠杆菌top10，30℃培养16h后挑取单克隆，挑取的单克隆在30℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。抽提的质粒经限制性内切酶hindiii酶切电泳鉴定。[0105]3)步骤2)和3)获得载体进行慢病毒制备[0106](1)慢病毒的包装[0107]本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：用含10％fbs(w/v)的dmem培养基培养293t细胞至较佳状态；然后将293t细胞以1×105/cm2的密度传至1个75cm2的培养瓶中培养22h，保证转染时细胞汇合度为70-80％；再用预热的含2％fbs(w/v)的dmem培养基换液，培养2h备用；将680μlddh2o、20μg慢病毒载体(步骤1)和2)所述的载体)、100μl2.5mmcacl2加入15ml离心管中，混合均匀，混匀后用移液器向混合液中逐滴加入2×hbs，同时用10ml移液器吹打混匀，混匀后室温静置15min，然后将混合液逐滴加入上述制备的细胞中，继续培养12-16h后，用含10％fbs(w/v)的dmem培养基更换培液。细胞在培养48h、72h后分别收集细胞上清用于病毒纯化。[0108](2)慢病毒的纯化[0109]将病毒上清收集在50ml离心管中，3000r/min离心10min然后用0.45μm滤膜过滤，滤液3000r/min离心10min后转移至新的50ml离心管；根据病毒上清量，分别加入50％peg6000(w/v)、4mnacl，再用医用盐水定容到总体积35ml(peg6000终浓度为8.5％、nacl终浓度为0.3m)，4℃冰箱静置90min，30min/次颠倒混匀；样品于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200μl含10％fbs的dmem培养基重悬病毒，1.5mlep管分装，每管40μl，-80℃保存备用。[0110](3)慢病毒滴度测定[0111]a、病毒感染293t细胞[0112]提前12h将293t细胞铺板至含10％fbs(w/v)dmem培养液的24孔板中，确保感染病毒前细胞汇合度在40％-70％之间，且细胞状态佳。向每个孔中加入1μl的6g/mlpolybrene溶液，而后取已纯化的慢病毒载体1μl，用医用生理盐水稀释10倍制成工作液分别加入对应孔中，24h后用含10％fbs(w/v)的dmem培养基换液，感染72h后1000r/min离心5min以收集细胞，抽提基因组。[0113]b、抽提基因组[0114]将收集的细胞用pbs重悬，1000r/min离心5min，弃尽上清，重复1次；再用200μlpbs重悬细胞，并加入20μl蛋白酶k，200μlal裂解液，吹打混匀，56℃孵育10min；然后加入200μl预冷的乙醇，上下颠倒混匀，将溶液转移至过滤柱中，室温静置1min，8000r/min离心1min，弃尽上清；接着加入700μlaw1溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清；再加入500μlaw2溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清，并将过滤柱转移至新的1.5mlep管中，开盖静置1min以挥发乙醇；加入50μl灭菌ddh2o(60℃预热)，静置2min，12000r/min离心1min。(基因组抽提试剂盒为qiaampdnabloodminikit购于qiagen公司)。[0115]c、qrt-pcr测定病毒滴度[0116]反应体系如下：premixextaqtmii(2×)10μl，上游引物(gagup)1μl，下游引物(gagdn)1μl，抽提的基因组1μl，rnase-freedh2o7μl，每个样品、标准品至少3个重复孔。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，结果用tu/ml表示。[0117]4)慢病毒感染t细胞[0118](1)人外周血单核细胞的分离[0119]用加有抗凝剂的采血管采集正常人外周血约60ml，分装于两个50ml离心管，每管各30ml，分别加入7.5ml羟乙基淀粉稀释。离心管室温静置自然沉降约30min，收集上层血浆，而后1400r/min离心15min后用生理盐水重悬沉淀。将细胞悬液以体积比1:1的比例小心加载到淋巴细胞分离液上，400g梯度离心15min，离心机降速dec设置为5。离心后，离心管由上至下分为四层，即血浆层、环状乳白色外周血淋巴细胞(pbmc)层、透明分离液层和红细胞层。小心吸取第二层的pbmc至新离心管并用生理盐水洗涤2次，第一次400g离心10min，第二次1100r/min离心5min，而后以生理盐水重悬细胞，移液器吸取pbmc细胞悬液并转移至培养瓶中，以含有10％fbs(w/v)的rpmi1640完全培养基培养。[0120](2)慢病毒载体感染t淋巴细胞[0121]用含10％fbs的rpmi1640完全培养基培养新制备的单个核细胞pbmc，第1天加入抗cd3单克隆抗体活化；前3天进行慢病毒感染；分别加入2感染复数(moi)的1)和2)所述的慢病毒载体，未感染的外周血淋巴细胞(pbmc)作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500iu/ml重组人il-2的rpmi1640完全培养基，继续培养10-20天。[0122]在有些实施例中，共表达cd44和car的t细胞还可以采用如下方案制备：[0123]a、采用上述步骤1)的方案制备表达cd44的t细胞，获得表达cd44的t细胞后进一步，在cd44的t细胞上转导car基因，获得同时表达cd44和car的t细胞。[0124]b、采用与上述步骤2)类似的步骤获得表达car的t细胞(car-t细胞)，不同之处在于表达car的载体不包含cd44的基因，进一步在获得的car-t细胞基础上再转导cd44基因，获得同时表达cd44和car的t细胞(44-19car)。[0125]cd44和car的表达如图2所示，cd44和car均可在t细胞正常表达。[0126]实施例2.du-44-19car制备[0127]1、基因敲除实验[0128]采用lonza电转仪器或neon等其他电转仪器，选择适合电转t细胞电转程序。cas9蛋白：sgrna摩尔比例为1:2或其他适合比例均可，rnp需体外孵育数分钟，并与电转buffer重悬的适量t细胞混合均匀转入电转杯，进行电转；完成电转并转入含适量培养基的培养瓶中继续培养。电转后72h即可孵育带可检测荧光标记的cd4或cd8流式抗体并进行流式检测敲除效率。图1为展示的所用靶点中，敲除效率的展示，不同条件下其他靶点亦可能产生较好敲除效果或更好的敲除效果。[0129]发明中部分所用靶点序列如seqidno.1-11展示，该序列不仅限于此处展示的序列，任何敲除cd4和cd8的基因区域内的可对基因本身造成缺失的靶点序列都可以，且包含人体12号染色体上cd4基因:6,789,528-6,820,799forwardstrand中,人体2号染色体上cd8a基因:86,784,610-86,808,396reversestrand中以及人体2号染色体cd8b基因:86,815,339-86,861,924reversestrand中；基因编辑靶点所在位置表1展示及表3-表5的任一区域内可对基因本身造成缺失的靶点序列。[0130]table1[0131]序列id序列名称序列seoidno.1sg4-1tgaaccggggagtcccttttseoidno.2sg4-2cccttttaggcacttgcttcseoidno.3sg4-3agtggtgctgggcaaaaaagseoidno.4sg4-4tctggttggagtttttccagseoidno.5sg4-5tcagggaaagaaagtggtgcseoidno.6sg4-6ctcctcccagcagccactcaseoidno.7sg8-1gaccgccttgctcctgccgcseoidno.8sg8-2ggcaggagcaaggcggtcacseoidno.9sg8-3tcacggagcagcaaggccagseoidno.10sg8-4ggccagcggcaggagcaaggseoidno.11sg8-5caaggccagcggcaggagca[0132]table2[0133][0134]table3[0135][0136][0137]table4[0138][0139]table5[0140][0141][0142]2、du-44-19car的获取方法:[0143]起始样品为健康人外周血。用磁珠或流式分选cd4/cd8单阳性t细胞，用包含cd3、cd28的抗体的dynabeads进行持续刺激，感染含car的慢病毒，电转靶向cd4和cd8的sgrna和cas9蛋白的rnp混合物，电转进行流式或磁珠分选出du-car-t细胞，培养液加适量因子，或其他任意适合培养t细胞的培养基和细胞因子组合即可。[0144]du-44-19car的获取方法(以下两种方法都可以)：1、获取cd4和/或cd8单阳性t细胞，活化数小时后感染包含cd44和car结构的病毒，培养数小时后对感染后的t细胞进行rnp电转，继续培养并分选出目的细胞；2、获取cd4和/或cd8单阳性t细胞，活化数小时后电转rnp到该t细胞后，培养数小时后感染包含cd44和car结构的病毒，继续培养并分选出目的细胞。[0145]44-19car的获取方式制备顺序：获取cd4和/或cd8单阳性t细胞，活化数小时后感染包含cd44和car结构的病毒，继续培养即可。[0146]实施例3.dn-44-19car以及44-19car的评价[0147]1、car的表达[0148]对44-19car细胞上的cd4和cd8进行基因编辑，用磁珠分选出高纯度双阴性car-t细胞，并且这种操作不影响car结构在t细胞上的表达。由图2可见，44-19car及du-44-19car细胞上car表达量均在55％以上。du-19car分选后双阴性car-t比例高达99％以上。[0149]2、体外杀伤[0150]采用固定效靶比铺板：e:t＝car-t:肿瘤细胞，在1640完全培养基中培养固定时间，采用荧光素酶裂解法检测靶细胞存活比例，并算出细胞毒性效率。干扰素-γ因子分泌水平检测用可用于检测该因子水平的试剂盒即可，详细操作参考各厂家生产的试剂盒说明书。[0151]如图3显示，体外药效学评价结果，44-19car体外药效与自体19car相当，在效靶比为1:4，杀伤时间为24h时，其杀伤效率可达到90％以上，同样du-44-19car与19car相比，杀伤能力亦相当；因子分泌结果，44-19car和du-44-19car均低于19car。这说明同等杀伤能力的情况下，我们发明的44-19car和du-44-19car可分泌更少量的因子，但并未影响其杀伤能力，这降低细胞因子风暴的风险，从而提高了car-t治疗的安全性。其中对于ifn-γ，ifn-γ是th1类分子，是目前car-t细胞发挥特异性功能的一个体现，但另一方面过高的ifn-γ分泌又与car-t治疗产生的副作用细胞因子“风暴”(也称之为crs)相关，因此ifn-γ分泌高有利也有弊。[0152]3、表型结果以及衰竭标志物[0153]流式细胞仪检测；抗体：ccr7：apc、cd45ra：bv421、cd45ro：percp5.5；表型分类标准：t记忆干细胞：tscm(cd45ra+cd45r0-ccr7+)、类t记忆干细胞：tscm-like(cd45ra+cd45r0+ccr7+)、效应记忆t：tem(cd45ra‑ꢀcd45r0+ccr7-)、中央记忆t：tcm(cd45ra-cd45r0+ccr7+)、效应t：te(cd45ra+cd45r0-ccr7-)、其他(100％-tscm-tscm-like-tem-tcm-te)。衰竭标志物检测方法：流式细胞仪检测；抗体：pd-1：apc、lag-3：bv421、tim-3：percp5.5。[0154]如图4显示，表型检测结果，与自体19car相比，44-19car和通用型du-44-19car各组分型分布比较接近，tscm略高，但te略低，但从杀伤结果比较并不影响其杀伤肿瘤细胞能力；此外，从图5中可以看出，在衰竭标志物检测表达量数据结果中可以看出，3组car均不表达tim-3，但相较于自体19car，我们发明的44-19car和通用型du-44-19car上pd-1和lag-3表达均更低，这也提示了，我们发明的通用型44-19car和du-44-19car具有更持久的持续性，从而有利于提高抗肿瘤能力。[0155]4、活力检测：电转rnp后需要通过分选的方式对目的细胞进行纯化，该时间点一般在活化后5-7天进行，分选当天开始监测细胞活力，主要实施方式是通过细胞计数仪计数的方式获得固定时间点的细胞活力。为了保持实验一致性，19car和44-19car虽然不需要分选，均与du-44-19car同一时间节点进行监测。[0156]活力监测结果，如图6表明，我们发明的44-19car和通用型du-44-19car在分选后前几天，活力与19car相当。但7天后，我们发明的car-t细胞活力依然维持在80％以上，而自体19car组下降幅度明显。[0157]5、gvh强度检测[0158]采用微球绝对计数的方法测定混合淋巴反应(mlr)，配置固定比例：供体细胞(car-t)：受体细胞(与供体细胞不同hla分型的健康人pbmc)混合体系，用1640基础培养基进行培养8天，分别于0天和8天流式检测细胞绝对计数，根据细胞数目变化算出gvh相对强度。[0159]gvh强度检测结果图7及表6示，我们发明的通用型du-44-19car在第八天可引起的gvh反应强度与传统通用型car-t细胞cu-44-19car相当，均明显弱于对照组自体19car、44-19car和ct组。这一结果说明，我们的发明方法制备的du-44-19car与传统通用型car-t细胞一样，可用于同种异体car-t免疫治疗。[0160]table6[0161]分组gvh反应程度(％)ct80.5344-19car73.18du-44-19car54.9cu-44-19car48.93[0162]6、体内药效实验1(19car、du-19car与cu-19car的比较)[0163]于11day引进小鼠，对小数进行检疫等系列检测操作，完成并许可入组；于-3day进行5e5nalm6-luc-gfp靶细胞尾静脉注射；于day0进行随机分组后按照car-t有效细胞数量为2e6回输car-t细胞；之后每隔7天进行活体成像观察小鼠体内肿瘤清除情况。[0164]体内药效结果如图10显示，19car和du-19car组及cu-19car组与controlt组相比体内有明显的肿瘤抑制作用。du-19car组和cu-19car组从荧光值曲线数据分析表明du-19car组相比cu-19car组体内药效明显更优，而我们发明的du-19car体内药效略优于自体组19car，这说明我们发明的新型通用型car-t细胞体内抗肿瘤效果不仅远优于传统通用型car-t细胞。[0165]7、体内药效实验2(19car和44-19car、du-44-19car和19car的对比)[0166]于-11day引进小鼠，对小数进行检疫等系列检测操作，完成并许可入组；于-3day进行5e5nalm6-luc-gfp靶细胞尾静脉注射；于day0进行随机分组后按照car-t有效细胞数量为2e6回输car-t细胞；之后每隔7天进行活体成像观察小鼠体内肿瘤清除情况。[0167]如图8显示，体内药效结果，19car组和44-19car组与controlt组相比体内有明显的肿瘤抑制作用；体内抗肿瘤效果数据显示19car组与44-19car组相当。但car-t存续结果表明，44-19car存续更多，这也从侧面说明了我们发明的44-19car可提高car-t细胞体内存续，从而持续性杀伤肿瘤。[0168]du-44-19car组与19car组从荧光值曲线数据分析，如图9和图10表明，dn-44-19car抗肿瘤效果明显优于19car组。这说明我们的通用型car-t细胞du-44-19car不仅实现了通用，并且比传统自体car-t细胞具有更好的药效。[0169]综上所述，本发明设计的du-44-19car-t进行体外药效学评价、gvh强度检测以及体内抗肿瘤检测等结果表明，不论是在降低细胞因子风暴的风险方面，还是提高体内存续以及抗肿瘤效果方面均优于传统car-t。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.t细胞，其特征在于，所述t细胞表达cd44。2.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述cd44的氨基酸序列如seq id no:12所示。3.根据权利要求1或2所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞的cd4基因和/或cd8基因被敲除和/或失活。4.根据权利要求3所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞经过基因编辑获得。5.根据权利要求1-4任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞经过天然分离获得。6.根据权利要求1-5任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述的t细胞的β2-微球蛋白、和/或hla-i类分子共同亚基、和/或ciita的基因失去功能或缺失。7.根据权利要求1-6任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞为同种异体t细胞。8.根据权利要求1-7任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述的t细胞还表达hla-e和/或hla-g和/或hla-f。9.权1-8任意一项所述的t细胞的制备方法，其特征在于，选用以下两种任一方法获得目的细胞: （1）获得t细胞后，采用基因编辑的方法进行cd4和/或cd8基因的敲除和/或失活，感染包含cd44的病毒，获得目的细胞;（2）获得t细胞后，感染包含cd44的病毒，采用基因编辑的方法进行cd4和/或cd8基因的敲除和/或失活，获得目的细胞。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述t细胞为活化的和/或非活化的t淋巴细胞。11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的t细胞中的cd4基因和/或cd8基因的敲除或失活时机为：在t细胞扩增之后，或在t细胞扩增之前。12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的基因编辑技术是通过电转的方式或非电转的方式改造t细胞。13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括crispr、zfn、talen。14.权利要求9-13任意一项所述的制备方法所得的t细胞。15.由权利要求1-8任意一项或14所述的t细胞制备的car-t细胞。16.根据权利要求15所述的car-t细胞，其特征在于，car-t细胞中的car包含有胞外域、跨膜域和胞内信号域。17.根据权利要求15所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞为同种异体car-t细胞。18.根据权利要求15所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞还表达膜结合的il15。19.根据权利要求15所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞还表达分泌细胞因子，所述细胞因子包括il2、il7、il12、il21、il15。20.根据权利要求15所述的car-t细胞，其特征在于：所述car-t细胞还表达且可识别肿瘤微环境中分子的融合蛋白，所述融合蛋白的胞外结构识别pd1、pdl1、sirpγ、sirpδ、tigit。21.根据权利要求15项所述的car-t细胞，其特征在于：所述car结构可被调控活化或失
活，所述调控活化或失活的结构包括peptide neo-epitope (pne)、fluorescein (fitc)、10 amino acids (5b9 tag)、fitc-hm-3 bifunctional molecule (fhbm) and scfv、 leucine zipfv linked to antibody、streptavidin 2 (msa2) biotin-binding domain。22.根据权利要求15-21任意一项述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞可以识别实体瘤、血液系统肿瘤细胞/组织；所述car-t细胞的抗原识别区可以识别包含抗原：cd19、cd20、cd22、cd33、cll-1(clec12a)、cd7、cd5、cd70、cd123、ceacam5、ceacam6、ceacam7、mesothelin、muc1、cldn18.2、cdh17、trop2、bcma、nkg2d、pdl1、egfr、egfrviii、psca、psma、muc16、cd133、gd2、il13r2、b7h3、her2、cd30、slamf7、cd38、gpc3、wt1或tag-72。23.权利要求15所述的car-t细胞的制备方法，其特征在于，选用以下两种任一方法获得目的细胞：(1) 收集获得t细胞，感染包含cd44和car结构的病毒，对感染car结构后的t细胞进行rnp电转，获得目的细胞；或(2) 收集获得t细胞，电转rnp该t细胞后，再感染包含cd44和car结构的病毒，获得目的细胞。24.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，rnp电转过程中， rnp复合物具体为含有cd4sgrna和cd8sgrna以及cas9蛋白的rnp复合物。25.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述cas9蛋白和sgrna的摩尔比为1:2。26.感染权利要求15所述的car-t细胞的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含cd44和car结构。27.根据权利要求25所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体中选用表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体、rna载体、质粒中的任一种。28.含有权利要求1-8任意一项所述的t细胞和/或权利要求15-22任意一项所述的car-t细胞的细胞组合物。29.根据权利要求27所述的细胞组合物，其特征在于，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于不低于90%，80%，70%或60%。30.根据权利要求27所述的细胞组合物，其特征在于，所述的细胞组合物可以是经过活化诱导的cik细胞或nkt细胞。31.权利要求1-8任意一项所述的t细胞和或权利要求15-22任意一项所述的car-t细胞和或权利要求25或26所述的重组载体和或权利要求27-29任意一项所述的细胞组合物在制备细胞治疗药物中的应用。32.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，权利要求1-8任意一项所述的t细胞和或权利要求15-22任意一项所述的car-t细胞和或权利要求25或26所述的重组载体和或权利要求27-29任意一项所述的细胞组合物在制备治疗急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和/或皮肤癌的药物中的应用。33.cd44用于制备car-t细胞的活力提升剂中的应用。
34.cd44联合cd62l用于制备car-t细胞的活力提升剂中的应用。35.cd44用于制备car-t细胞分泌的pd-1和lag-3因子的抑制剂。36.在制备car-t细胞或时，cd44基因作为肿瘤细胞杀伤的促进剂中的应用，所述car-t细胞为常规car-t细胞、不表达cd4和/或cd8基因的car-t细胞或通用型car-t细胞。

技术总结
本发明属于细胞生物学、分子生物学以及药物研发技术领域，具体涉及一种通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用。本发明提供的CAR-T细胞表达CD44，CD44分子能够加强CAR-T细胞的活性，增强CAR-T有效性，并且使CAR-T细胞有更优的表型，更低的衰竭表达，提高CAR-T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗。能够用于肿瘤的靶向治疗。能够用于肿瘤的靶向治疗。


技术研发人员：李戊玲 徐艳敏 沈俊杰 杨智
受保护的技术使用者：重庆精准生物产业技术研究院有限公司
技术研发日：2021.12.30
技术公布日：2023/7/13