可逆性永生化细胞的制备方法

1.本发明涉及可逆性永生化细胞的制备方法，更详细而言，涉及使用携带预定的永生化基因的染色体非整合型rna病毒载体的可逆性永生化细胞的制备方法。


背景技术：

2.作为用于再生医疗和细胞治疗的细胞源，间充质干细胞(msc)等成体干细胞、es细胞和ips细胞等多能性干细胞占据着主位。在干细胞中，间充质干细胞(msc)是在身体中原始存在的细胞，因此排异反应和癌变风险小，在安全性方面优异，但由于其细胞分裂次数有限，因此难以保证有足够的所需细胞数量提供给医疗现场。
3.所以，人们正在尝试将永生化基因导入细胞，使其无限增殖。作为永生化基因，已知有端粒酶反转录酶(tert)基因、调节端粒酶的表达或活性的基因(例如myc基因、ras基因等)，病毒基因(sv40t、hpv e6-e7、ebv等)。一般使用质粒dna和慢病毒载体、反转录病毒载体、腺病毒载体等载体将这些永生化基因导入细胞(专利文献1、专利文献2、专利文献3等)。由于只需要将重组病毒载体产生细胞的培养上清液过滤并添加到目标细胞中，便可以高效地将基因导入，因此优选使用病毒载体。上述载体中，质粒dna、腺病毒载体的载体基因组是dna，会被整合到宿主的染色体中。慢病毒载体、反转录病毒载体的载体基因组虽然是rna，但在细胞内会因为反转录酶而获得dna的形态，被导入到宿主的染色体中，从而使携带基因表达。永生化中通常使用的此类载体，由于外源dna被整合到宿主细胞的染色体中，因此会损伤宿主细胞的基因，有时会存在癌变风险，所以在再生医疗的安全性方面存在较大问题。另一方面，仙台病毒载体(sev载体)是不采用dna形态的染色体非整合型rna病毒载体。sev载体可以将基因导入到种类宽泛的细胞中，易于使蛋白质高表达，因此广泛用于ips细胞的诱导等(专利文献4)。但是，人们认为，如果细胞像间充质干细胞(msc)那样分裂次数有限，且在2个月以上时分裂停止，则sev载体难以使导入的基因长时间表达，因此sev载体的用途只限于暂时性高表达，一直未被用于将永生化基因导入细胞。
4.另一方面，人们也在研究导入永生化基因使细胞永生化，在增殖后能够使用位点特异性重组酶将该永生化基因切出的可逆性(条件性)永生化细胞(非专利文献1等)。但是，即使用位点特异性重组酶将永生化基因切出，得到的细胞也是进行了基因操作的细胞，这种细胞有可能对宿主造成形成肿瘤等恶劣影响，安全性没有保障。
5.另外，从人体组织中获得的干细胞是年轻细胞和衰老细胞混在一起的群体，性质多种多样，不断分裂后会共同衰老，因此无法将细胞维持在固定质量。因此，也存在难以制订自动化和机械化所需的要素即质量标准的问题。
6.人们也开始探讨尝试从这些不同的细胞群体中分离出具有目标性质的细胞。ips细胞质量的评价方法已知有mirna分析、检测表面标记、细胞形态的图像分析、表观基因组分析。有人提议将这些技术也用于msc，但与ips细胞不同，msc既不会无限增殖，也无法克隆，因此尚未达到实用化。
7.另外，在分离不会反复分裂而传代数少的msc时，需要大量的包含msc的组织，也难
以保证所需的细胞数量，从而导致制备成本居高不下。因此，难以进行需要大量细胞数的治疗，只能以利用自体细胞的治疗为中心，很难利用异体细胞实施廉价的再生医疗。
8.现有技术文献
9.专利文献
10.专利文献1：日本专利第3953399号公报
11.专利文献2：wo2017/078176号
12.专利文献3：日本特开2017-221219号公报
13.专利文献4：日本专利第5763340号公报
14.非专利文献
15.非专利文献1：fang-ying meng,et al.,reversible immortalizationof human hepatocytes mediated by retroviral transfer and site-specific recombination.world journal of gastroenterology,01sep 2014,20(36)：13119-13126


技术实现要素：

16.发明所要解决的问题
17.本发明的目的在于提供能够使导入有永生化基因的细胞长时间增殖而不会损伤该细胞的染色体、且能够除去永生化基因的可逆性永生化细胞的制备方法，以及大量获得能够克隆且质量稳定的可逆性永生化细胞的方法。
18.用于解决问题的技术方案
19.本发明人为了解决上述问题而进行了潜心研究，结果发现，将选自由bmi-1基因、tert基因和sv40t基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因携带在此前从未在体细胞的永生化中使用过的染色体非整合型rna载体即仙台病毒载体中并导入到间充质干细胞(msc)中，惊奇地发现，经过了80天以上，细胞并未停止分裂，从而可以实现细胞的无限增殖(永生化)，并且在导入基因后的早期阶段细胞增殖速度会提升。另外确认到，制作的永生化细胞不存在染色体异常，具有多分化能力，通过温度控制能够容易地除去永生化基因。此外还确认到，从得到的永生化细胞群体成功地实现了永生化细胞的克隆化，关于克隆化的永生化细胞，在10个克隆中有8个克隆表现出正常核型，具有多分化能力；另外，从年轻细胞到停止分裂的衰老细胞为止的各个阶段的细胞均可进行永生化诱导，在永生化之后可以克隆。本发明通过该见解而完成。
20.即，本发明包含如下内容。
21.[1]一种可逆性永生化细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤(1)和步骤(2)：
[0022]
步骤(1)，将携带永生化基因的染色体非整合型rna病毒载体导入到哺乳动物的细胞中，在该细胞中使永生化基因表达；
[0023]
步骤(2)，对步骤(1)中得到的细胞进行培养，使其增殖。
[0024]
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述永生化基因为选自由以下基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因：bmi-1基因、tert基因和sv40t基因。
[0025]
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述永生化基因为以下(a)～(d)中的任一种：
[0026]
(a)bmi-1基因、tert基因和sv40t基因的组合；
[0027]
(b)bmi-1基因和tert基因的组合；
[0028]
(c)tert基因和sv40t基因的组合；
[0029]
(d)tert基因。
[0030]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述细胞为体细胞。
[0031]
[5]根据[4]所述的方法，其中，所述体细胞为成体干细胞。
[0032]
[6]根据[5]所述的方法，其中，所述成体干细胞为间充质干细胞。
[0033]
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述染色体非整合型rna病毒载体为负链rna病毒载体。
[0034]
[8]根据[7]所述的方法，其中，所述负链rna病毒载体为副黏病毒载体。
[0035]
[9]根据[8]所述的方法，其中，所述副黏病毒载体为仙台病毒载体。
[0036]
[10]根据[9]所述的方法，其中，所述仙台病毒载体为温度敏感性仙台病毒载体。
[0037]
[11]根据[1]所述的方法，所述方法还包括以下步骤：所述染色体非整合型rna病毒载体为仙台病毒载体，在所述步骤(2)的培养后，除去该仙台病毒载体。
[0038]
[12]根据[11]所述的方法，其中，所述仙台病毒载体是通过将培养温度从35℃变更为37℃来除去的。
[0039]
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在所述步骤(2)的培养后，对永生化细胞进行克隆。
[0040]
[14]一种永生化细胞，其是通过[1]～[13]中任一项所述的方法获得的。
[0041]
[15]一种永生化细胞，其包含处于能够除去的状态的携带选自由以下基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因的仙台病毒载体：bmi-1基因、tert基因和sv40t基因。
[0042]
[16]一种再生医疗产品，其包含[14]或[15]所述的永生化细胞。
[0043]
[17]一种温度敏感性仙台病毒载体，其携带选自由以下基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因：bmi-1基因、tert基因和sv40t基因。
[0044]
[18]一种用于制作可逆性永生化细胞的试剂盒，其包含[17]所述的温度敏感性仙台病毒载体。
[0045]
本技术主张2020年11月6日提出的日本国专利申请2020-186146号的优先权，包含该专利申请的说明书所记载的内容。
[0046]
发明效果
[0047]
本发明使用染色体非整合型rna载体将永生化基因导入细胞，由此能够使难以大量培养的细胞，例如用于再生医疗的间充质干细胞(msc)永生化(无限增殖)，而不会损伤其染色体。无论永生化对象细胞的分裂次数和永生化时的细胞分裂次数是多少，均可以进行该永生化。另外，使用温度敏感性仙台病毒载体(sev载体)作为染色体非整合型rna载体，无需进行繁杂的除去操作，只需改变培养温度，就能够容易地将该载体从细胞中除去。因此，能够大量提供安全性优异的细胞。另外，由于本发明得到的永生化细胞不存在染色体异常，具有与导入基因前相同的多分化能力，因此能够用于再生医疗。另外，由于未永生化的细胞是寿命和性质不同的细胞群体，因此难以克隆，但是本发明制作的永生化细胞容易克隆，能够稳定地获得高质量细胞，因此通过细胞制备的机械化容易进行质量管理，能够大幅降低产业化所面临的制备成本问题，从而为细胞医疗和再生医疗的发展做出贡献。
附图说明
[0048]
图1表示携带永生化因子基因的sev载体的基因组结构[a.sev(18+)bmi1(hnl)ofp/ts15dδf、b.sev(pm)htert(hnl)egfp/ts15δf、c.sev(18+)sv40t/ts15δf、d.sev(hnl)e6-e7,bfp/ts15δf]。
[0049]
图2表示单独感染bmi-1的细胞(moi：1、5、20)的透射光图像和荧光(ofp)图像、单独感染htert的细胞(moi：1、5、20)的透射光图像和荧光(gfp)图像。
[0050]
图3表示同时感染2种因子(bmi-1/htert)的细胞(moi：1、5、20)的透射光图像和荧光(ofp、gfp)图像。
[0051]
图4表示同时感染3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的细胞(moi：1、5、20)的透射光图像和荧光(ofp、gfp)图像。
[0052]
图5表示导入永生化因子(no.1～no.16)59天后的细胞的形态和细胞的状态判定。
[0053]
图6表示导入永生化因子(no.1、no.2、no.4、no.12、no.16)的细胞的细胞增殖曲线[向上箭头：形态(透射光)图像和荧光图像点(图5)；*：端粒分析点(图11a、11b)；
▽
：染色体分析点]。
[0054]
图7表示导入3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的细胞的细胞增殖曲线[nc：未导入永生化基因；向上箭头：形态(透射光)图像和荧光图像点(图8)；双向箭头：形态(透射光)图像点(图9)、*：端粒分析点(图11b)、
▽
：染色体分析点(图10)]。
[0055]
图8表示导入3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的细胞的透射光图像和荧光(ofp、gfp)图像。
[0056]
图9表示导入3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的细胞的形态(透射光)图像(保持在35℃，温度从35℃变为37℃)。
[0057]
图10表示对导入3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的细胞进行传代培养90天后的染色体分析结果(正常核型)[图7的染色体分析点(
▽
)]。
[0058]
图11表示导入永生化因子(no.1、no.2、no.4、no.12、no.16)的细胞的长期培养样本中的端粒定量分析结果{a、永生化因子的组合对端粒的影响[第0天、第40天：图6的端粒分析点(*)]；b、导入3种因子(bmi-1/htert/sv40t)后，未除去/除去因子时的端粒量的变化[第0天、第40天：图6的端粒分析点(*)；第85天、第98天：图7的端粒分析点(*)]}。
[0059]
图12表示从培养初期的msc和永生化msc分化的脂肪细胞的照片。
[0060]
图13表示从培养初期的msc和永生化msc分化的成骨细胞的照片。
[0061]
图14表示从培养初期的msc和永生化msc分化的神经细胞的照片。
[0062]
图15表示从培养初期的msc和永生化msc分化的软骨细胞的照片。
[0063]
图16表示永生化细胞群体(导入永生化基因后2周)的克隆试验结果1(孔内的数字：形成的克隆数)。
[0064]
图17表示永生化细胞群体(导入永生化基因后4个月)的克隆试验结果2(孔内的数字：形成的克隆数)。
[0065]
图18表示克隆的永生化细胞(克隆a10)的细胞增殖曲线(
▽
：染色体分析点)。
[0066]
图19表示克隆的永生化细胞(克隆a10)的染色体分析结果[第80天：图18的染色体分析点(
▽
)]。
[0067]
图20表示克隆的永生化细胞的分化能力(分化为脂肪细胞、分化为神经细胞、分化
为成骨细胞)。
[0068]
图21表示单细胞克隆试验使用的msc的冷冻保存点(初期msc：第9天；中期msc：第24天；后期msc：第49天)以及感染sev载体引起的永生化诱导点(初期msc：第21天；中期msc：第36天；后期msc：第61天)。
[0069]
图22表示感染sev载体的细胞(初期msc、中期msc、后期msc)和未感染sev载体的msc(对照)在单细胞克隆之前(向96孔板接种之前)的照片。
[0070]
图23-1表示未感染sev载体的msc(对照)和感染sev载体的细胞(初期msc)的细胞群体的单细胞克隆试验结果(孔内的数字：形成的克隆数；培养天数：2周)。
[0071]
图23-2表示感染sev载体的细胞(中期msc、后期msc)的细胞群体的单细胞克隆试验结果(孔内的数字：形成的克隆数；培养天数：2周)。
[0072]
图24表示针对细胞分裂停止的细胞(第90天)的sev载体感染试验结果[感染sev载体之前的细胞、未感染sev载体的细胞(对照细胞)、感染sev的细胞(从感染日起2周后)的各照片]。
[0073]
图25表示通过感染sev载体而开始再次增殖的分裂停止细胞(第90天)的单细胞克隆试验结果(孔内的数字：形成的克隆数；培养天数：2周)。
[0074]
图26表示无血清培养中的脂肪组织来源的人msc(未感染的细胞株、感染sev载体的细胞株)的细胞增殖曲线。
[0075]
图27表示无血清培养中的骨髓来源的人msc(未感染的细胞株、感染sev载体的细胞株)的细胞增殖曲线。
[0076]
图28表示经过了无血清培养的脂肪组织来源的人msc(hmsc-at)的感染sev载体的细胞株，以及骨髓来源的人msc(hmsc-bm)的感染sev载体的细胞株的透射光图像和荧光(ofp、gfp)图像(hmsc-at：自感染日起第16天、第58天；hmsc-bm：自感染日起第24天、第50天)。
[0077]
图29表示大鼠msc(未感染的细胞株、感染sev载体的细胞株#1、#2)的细胞增殖曲线。
[0078]
图30表示永生化大鼠msc的感染sev载体的细胞株的透射光图像和荧光(ofp、gfp)图像(自感染日起第2天、第9天、第58天)。
[0079]
图31表示hfl1(未感染的细胞株#1、#2；35℃培养的感染sev载体的细胞株#1、#2；37℃培养的感染sev载体的细胞株#1、#2)的细胞增殖曲线。
[0080]
图32表示永生化hfl1[35℃培养(自感染日起10天、34、255天)、35℃培养+37℃培养(自感染日起34天+221天)]的透射光图像和荧光(ofp,gfp)图像。
[0081]
图33表示huvec(未感染的细胞株#1；35℃培养的感染sev载体的细胞株#1、#2；37℃培养的感染sev载体的细胞株#1、#2)的细胞增殖曲线。
[0082]
图34表示永生化huvec[35℃培养(自感染日起7天、36、72天)、35℃培养+37℃培养(自感染日起35天+37天)]的透射光图像和荧光(ofp、gfp)图像。
[0083]
图35是通过导入插入多种生长因子的人类人工染色体载体而形成的永生化msc的fish分析结果的照片(右下方框内：箭头所指细胞的dapi染色图像)。
[0084]
图36表示通过移植永生化msc治愈肠炎模型的效果试验结果。
具体实施方式
[0085]
1.可逆性永生化细胞的制备方法
[0086]
本发明是可逆性永生化细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)，将携带永生化基因的染色体非整合型rna病毒载体导入到哺乳动物的细胞中，在该细胞中使永生化基因表达；步骤(2)，对步骤(1)中得到的细胞进行培养，使其增殖。
[0087]
(细胞)
[0088]
本发明中，“细胞”是指生殖细胞系(卵子和精子、卵母细胞、es细胞等)和分化全能性细胞(ips细胞)以外的所有体细胞。另外，“体细胞”可以是原代培养细胞、传代培养细胞和细胞系中的任一种。此外，体细胞既可以是天然来源的细胞，也可以是由ips细胞等分化而成的人造细胞。作为体细胞，具体可举出：形成组织的细胞(脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞、皮肤细胞、血液细胞、肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、胰腺细胞、肾细胞、心肌细胞、脑细胞、肺细胞、脾细胞、肾上腺细胞、牙龈细胞、牙周膜细胞)等分化的细胞，或者它们的前体细胞等；免疫类的细胞(b细胞、t细胞、单核细胞类的细胞等)；成体干细胞[间充质干细胞(脂肪来源干细胞、骨髓来源干细胞、脐带血来源干细胞、胎盘来源干细胞)、造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、肠上皮干细胞、牙髓干细胞、牙周膜干细胞等]等。只要细胞的来源是哺乳动物就没有特别限制，例如可举出：人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马等。
[0089]
(可逆性永生化细胞)
[0090]“永生化细胞”是指与原代培养细胞和在普通的培养条件下培养的细胞不同，即使细胞反复分裂也不会停止增殖的细胞，即具有无限增殖能力的细胞。本发明中的“永生化细胞”是指通过导入预定的永生化基因而能够无限增殖，并且即使反复传代培养其无限增殖能力也不会下降的细胞。本发明涉及的“永生化细胞”虽然根据细胞的来源或培养条件，其增殖速度和增殖期间有所不同，但传代培养的结果，在相同的培养条件下，即使在无处理的细胞增殖降低或停止的时期以后，也能够将指数增殖持续20天以上，优选60天以上，更优选80天以上。另外，本发明的永生化细胞也包含上述能够无限增殖的细胞群体，以及由该细胞群体克隆的永生化细胞株中的任一种。另外，“可逆性永生化”是指将永生化基因导入细胞，使该细胞进入能够无限增殖的状态后，再除去该永生化基因，从而使细胞增殖停止或减弱。
[0091]“永生化”是指将初期细胞的细胞分裂数的界限和细胞衰老解除，赋予持续的细胞分裂能力和增殖能力。具体是指，在标准的细胞培养条件下，通常能够传代5代以上，优选7代以上、8代以上、9代以上、10代以上、12代以上、15代以上、20代以上的状态。对于汇合的传代次数为0的细胞，可以通过本领域技术人员公知的方法进行传代操作，从而进行扩增培养。通过1次传代操作而得到的细胞称为“传代次数1(或第2代)”的细胞；与传代操作数相对应地，可以表示为“传代次数2、3、4、
……
n(n为传代次数，且n为整数)(第n+1代)”。另外，在各传代操作之间，也可以包含对细胞进行冷冻处理的步骤。
[0092]
(永生化基因)
[0093]
本发明的永生化细胞是通过使用染色体非整合型rna病毒载体将预定的永生化基因导入到细胞中而制作的。这里，“永生化基因”是指使细胞永生化并获得无限增殖能力，并且不会诱导细胞死亡的基因。另外，永生化基因是外源性基因，意为从细胞外新导入的永生化基因。另外，永生化基因也可以是人以外的物种来源的永生化基因，还可以是修饰成可在
靶细胞内表达的形态的永生化基因。在本发明中，作为永生化基因，可以使用选自由bmi-1基因、tert基因和sv40t基因组成的组的一种或两种以上的基因，优选使用2种基因的组合，更优选使用3种基因的组合。当使用1种基因时，优选为tert基因；当组合使用2种以上的基因时，作为优选的组合示例，可举出bmi-1基因和tert基因的组合、tert基因和sv40t基因的组合。
[0094]
在本发明中，如无特别说明，“基因”不仅包含限定蛋白质一级结构的结构基因，还包含启动子、操纵子等具有控制功能的核酸上的区域。因此，在本发明中，如无特别说明，“基因”不会区分调节区、编码区、外显子和内含子而表示。
[0095]“bmi-1(b lymphoma mo-mlv insertion region 1homolog，b淋巴瘤mo-mlv插入区1同源物)基因”是具有两个核定位信号，并且编码作为位于细胞质或核的多梳抑制复合体1(polycomb repressive complex 1：prc1)之一发挥功能的蛋白质的基因。bmi-1作为prc1之一，通过染色质重塑和组蛋白修饰的控制，参与包含hox基因在内的各种基因的表达控制。关于bmi-1，已知其具有通过抑制与细胞周期相关的p16和p19arf的表达来控制细胞增殖的作用，以及通过参与造血干细胞和神经干细胞的细胞分裂而在维持自我复制方面发挥重要作用。
[0096]“tert(telomerase reverse transcriptase，端粒酶反转录酶)基因”是编码端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase：tert)的基因。端粒酶反转录酶(tert)由端粒酶rna组分(telomerase rna：tr or telomerase rna component：terc)与其他控制子单元，构成使真核生物的染色体末端(端粒)的特异性重复序列延长的酶即端粒酶。已知在细胞中存在端粒长度的监控机构，细胞衰老是由端粒缩短引起的，而tert具有维持端粒长度的作用。
[0097]“sv40t(simian virus 40large t antigen，猿猴病毒40大t抗原)基因”是编码猿猴病毒40大t抗原的基因。sv40(simian vacuolating virus 40，猿猴空泡病毒40)的基因组分为在感染后立即表达的早期区(early region)、在感染后病毒基因组复制时表达的晚期区(late region)，以及包含转录控制和复制起点等的调控区(regulatory region)。早期区(early region)编码与病毒基因组复制开始和癌抑制基因产物p53和prb的失活相关的大t抗原，以及与蛋白质去磷酸化酶pp2a结合并进行抑制的小t抗原。
[0098]
作为本发明中使用的bmi-1基因的具体示例，可举出小鼠bmi1基因(seq id no:1)；作为tert基因的具体示例，可举出人tert基因(seq id no:2)；作为sv40t基因的具体示例，可举出sv40大t抗原基因(seq id no:3)。bmi-1基因、tert基因和sv40t基因也可以是它们的转录变体、剪接变体和它们的直系同源。
[0099]
上述bmi-1基因、tert基因和sv40t基因，只要具有与它们同等的功能和活性，则也可以是由相对于seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的各碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的序列一致性的碱基序列组成的基因，以及在seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的各碱基序列中取代、插入、添加和/或缺失数个(例如1～30个、优选1～20、更优选1～10个、进一步优选1～5个、特别优选1～3个)碱基而成的基因。这种同源基因也包含在本发明中所说的永生化基因中。另外，bmi-1基因、tert基因和sv40t基因，只要具有同等的功能和活性，则也可以是人为添加修饰，以使该基因的产物作为与其他蛋白质和肽的融合蛋白质进行表达的基因。
[0100]
(染色体非整合型rna病毒载体)
[0101]
在本发明中，作为用于将上述永生化基因导入细胞使其表达的载体，使用“染色体非整合型rna病毒载体”。在本发明中，病毒载体是指具有该病毒来源的基因组核酸，通过将导入基因导入到该核酸中，能够使该基因进行表达的载体。另外，“染色体非整合型rna病毒载体”是病毒来源的且能够将基因导入到靶细胞中的病毒载体，是指不存在将被导入的基因整合到宿主的染色体(核来源的染色体)中的危险性的载体。
[0102]
作为本发明中使用的染色体非整合型rna病毒载体，可举出负链rna病毒载体。“负链rna病毒载体”是由含有负链(与编码病毒蛋白的有义链互补的反义链)的rna作为基因组的病毒组成的载体，负链rna也被称为反链rna。作为本发明中使用的负链rna病毒，特别优选单链负链rna病毒[也称为非分节段(non-segmented)负链rna病毒]。“单链反链rna病毒”是指在基因组中具有单链反链(负链)rna的病毒，例如包括：属于副黏病毒科(paramyxoviridae，包括副黏病毒属、麻疹病毒属、腮腺炎病毒属和肺病毒属等)、弹状病毒科(rhabdoviridae，包括水泡病毒属、狂犬病毒属和暂时热病毒属等)、丝状病毒科(filoviridae)等科的病毒。
[0103]
作为本发明中能够使用的负链rna病毒的示例，可举出：副黏病毒科(paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(sendai virus)、新城疫病毒(newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distemper virus)、猿猴副流感病毒(sv5)、人副流感病毒i型ii型iii型、正黏病毒科(orthomyxoviridae)的流感病毒(influenza virus)、弹状病毒科(rhabdoviridae)的水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、狂犬病毒(rabies virus)等，优选为仙台病毒(sendai virus)。
[0104]
(仙台病毒载体：sev载体)
[0105]
在本发明的优选方式中，作为染色体非整合型rna载体，使用仙台病毒(sendai virus，sev)载体。上述bmi-1基因、tert基因和sv40t基因的各永生化因子基因可以单独插入到sev载体中，也可以一起插入到单个sev载体中。
[0106]
仙台病毒(sendai virus)是副黏病毒科呼吸道病毒属的一种病毒，包含1条负链(与编码病毒蛋白的有义链相对的反义链)的rna作为基因组。
[0107]
sev载体具有以下(i)～(v)等特征：(i)向包括人类在内的各种哺乳动物的细胞中导入基因的效率和表达效率极高；(ii)由于其为染色体非整合型病毒载体，载体在细胞质中表达，因此导入基因不会被整合到宿主的染色体中，不存在染色体结构发生变化的危险性；(iii)其不是人类的病原病毒；(iv)通过改变向载体插入的位置，可以调整基因表达量和进行多个基因的同时表达；(v)达到目的后，可以从导入细胞中将载体除去。
[0108]
仙台病毒的基因组从3’端到5’端依次包含：np(核衣壳)基因、p(磷蛋白)基因、m(基质蛋白)基因、f(融合蛋白)基因、hn(血细胞凝集素/神经氨酸酶)基因和l(大蛋白)基因。其中，仙台病毒只要含有np基因、p基因和l基因，就能够作为载体充分发挥功能，可以在细胞中复制基因组，使携带的基因表达。需要说明的是，由于仙台病毒在基因组中具有负链rna，因此与通常情况相反，基因组的3’侧相当于上游，5’侧相当于下游。
[0109]
在本发明中，sev载体可以使用天然株、野生株、突变株、市售品中的任一种。该病
毒只要能实现目标功能，则既可以是具有与从天然病毒中分离出的病毒相同的结构的病毒，也可以是通过基因重组人为修饰的病毒。例如，可以是野生型病毒所具有的任意基因发生突变或缺失的病毒。具体地，从基因组中缺失f基因、未形成来自基因导入细胞的感染性颗粒的非传播型载体(δf)，以及，缺失f基因、再缺失m和/或nh基因，或者m和/或nh基因进一步发生突变(例如温度敏感性突变)的载体，在本发明中优选使用。另外，例如，缺失f基因、再缺失m或nh基因、剩下的m和/或nh基因进一步发生突变(例如温度敏感性突变)的载体，也在本发明中优选使用(参考日本专利第5763340号公报等)。
[0110]
另外，本发明的方法所使用的sev载体优选为温度敏感性。“温度敏感性”是指与低温(例如30℃～36℃)相比，在通常的细胞培养温度(例如37℃～38℃)活性显著下降。例如，仙台病毒的ts7(l蛋白的y942h/l1361c/l1558i突变)、ts12(p蛋白的d433a/r434a/k437a突变、ts13(p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1558i突变)、ts14(p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1361c)、ts15(p蛋白的d433a/r434a/k437a突变和l蛋白的l1361c/l1558i)等突变就是温度敏感性突变，可以在本发明中适当使用。这些突变优选进一步导入到上述f基因缺失型sev载体中。关于这些sev载体，可以参考日本专利第5763340号公报、wo2015/046229号公报等。
[0111]
本发明中的sev载体除了包含感染性病毒颗粒以外，还包含病毒核心、病毒基因组与病毒蛋白的复合体，或者由非感染性病毒颗粒等组成、且具有通过导入到细胞中而表达携带的基因的能力的复合体。例如，由仙台病毒基因组和与之结合的仙台病毒蛋白(np、p和l蛋白)组成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)，可以通过导入到细胞中而在该细胞内表达导入基因。向细胞中的导入可以使用适当的转染试剂等进行。因此，这种核糖核蛋白(rnp)也包含在本发明中的sev载体中。
[0112]
(携带永生化基因的sev载体的构建)
[0113]
永生化基因(bmi-1基因、tert基因和sv40t基因)的导入位置没有特别限制，在将各永生化基因分别插入到独立的多个载体中的情况下，优选将bmi-1基因插入到np基因的上游，将tert基因插入到p基因与m基因之间，将sv40t基因插入到np基因的上游。另外，也可以将2个以上(bmi-1与tert、tert与sv40t，或者bmi-1、tert和sv40t)的基因插入到单个载体中。
[0114]
另外，上述携带永生化基因的sev载体可以制成试剂盒，该试剂盒中例如可以包含用于培养细胞的培养基和容器、记载有试剂盒使用方法的说明书等。
[0115]
(向细胞中导入永生化基因)
[0116]
携带有如上得到的永生化基因的sev载体，可以通过将该载体(仙台病毒颗粒)添加到体细胞的培养基中使该细胞感染病毒，来导入到该细胞内。载体的用量根据细胞种类和细胞密度、培养基的量而异，因此可以事先检查所使用的每个细胞的感染效率接近100％的moi而确定。
[0117]
或者，当sev载体为rnp的形态时，例如可以通过电穿孔法、脂质体转染法、微注射法等方法导入到细胞内。
[0118]
(永生化基因导入细胞的培养)
[0119]
在本发明中，导入了永生化基因的细胞的培养方法可以按照普通的哺乳动物体细胞的培养方法和条件来进行。用于培养的培养基没有特别限制，为了细胞的维持培养或扩
大培养，可以使用通常所使用的、适合病毒感染的培养基，可以是市售的培养基、自制的培养基的任一种。例如可举出含有细胞的生存和增殖所必需的成分(无机盐、碳水化合物、激素、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素、脂肪酸)的基础培养基，具体可举出：dulbecco’s modified eagle’s medium(d-mem)培养基、dulbecco’s modified eagle’s medium：nutient mixture f-12(d-mem/f-12)培养基、glasgow mem(g-mem)培养基、basal medium eagle(bme)培养基、minimum essential medium(mem)培养基、eagle’s minimal essential medium(emem)培养基、iscove’s modified dulbecco’s medium(imdm)培养基、rpmi 1640培养基、medium199培养基、αmem培养基、ham培养基、fischer培养基，以及它们的混合培养基等。另外，在培养基中可以根据需要含有生长因子(fgf、egf等)、白细胞介素类、胰岛素、转铁蛋白、肝素、硫酸乙酰肝素、胶原蛋白、纤连蛋白、黄体酮、透明石膏、b27补充剂、n2补充剂、抗生素(青霉素、链霉素等)等。另外，培养基既可以是含血清培养基，也可以是无血清培养基。从防止混入异种动物来源成分的观点考虑，优选不含血清，或者使用与培养的细胞种类相同的动物来源的血清。另外，也可以使用白蛋白等血清替代物。
[0120]
培养方法没有限制，可举出：非黏附性条件下的三维培养，例如悬浮培养(例如分散培养、凝集悬浮培养等)；或者黏附性条件下的二维培养，例如平板培养；或者三维培养和二维培养的组合培养。用于细胞培养的培养器只要能够培养细胞就没有特别限制，例如可举出烧瓶、培养皿、培养盘、孔板、腔式载玻片、试管、培养托盘、培养袋、滚瓶等。培养器既可以是细胞非黏附性的，也可以是黏附性的，可根据目的适当选择。细胞黏附性的培养器可以将提高与细胞的黏附性为目的，使用通过由细胞外基质等制成的细胞支持用基底等处理的培养器。作为细胞支持用基底，例如可举出胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、层黏连蛋白、纤连蛋白等。
[0121]
培养温度为30℃～36℃，优选为32℃～35℃，更优选为33℃～35℃。培养在含co2空气的氛围下，例如在2％～5％的co2浓度进行。另外，用于除去永生化基因的培养温度为37℃～38℃，优选为37℃～37.5℃。
[0122]
2.分化诱导
[0123]
本发明可以通过将如上制作的永生化细胞在分化诱导培养基中培养，来将其分化诱导为特定的组织细胞。例如，当永生化细胞为间充质干细胞时，可以使其分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、软骨细胞等。
[0124]
用于将本发明涉及的永生化细胞分化诱导为目的细胞的培养基的组分、分化诱导因子、培养方法、传代方法等，可以通过公知和惯用的技术适当设定。
[0125]
分化诱导培养基可以根据作为分化诱导目的的细胞的种类而适宜选择。将细胞分化诱导为各种组织的培养基(至少添加有1种与作为分化诱导的目的的细胞相应的分化诱导或促进因子的培养基)在市面有售，可以使用这些市售培养基。例如，关于用于将本发明涉及的永生化细胞分化诱导为脂肪细胞的培养基，可以使用市售的脂肪细胞诱导培养基，或者在市售的动物细胞的培养基中含有胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、曲格列酮、生物素等的培养基。作为市售培养基，例如可举出间充质干细胞-脂肪细胞分化培养基2(promocell公司生产)、人间充质干细胞-脂肪细胞分化培养基bulletkit8(lonza公司生产)等。关于用于将本发明涉及的所述细胞分化诱导为成骨细胞的培养基，可以使用市售的成骨细胞诱导培养基，或者在市售的动物细胞的培养基中含有地塞米松、抗
坏血酸、β-甘油磷酸、皮质醇、bmp4、bmp2等的培养基。作为市售培养基，例如可举出间充质干细胞-成骨细胞分化培养基(promocell公司生产)、人间充质干细胞-成骨细胞分化培养基bulletkit(lonza公司生产)等。关于用于将本发明涉及的永生化细胞分化诱导为神经细胞的培养基，可以使用市售的神经细胞培养基或神经分化培养基[例如间充质干细胞-神经细胞分化培养基(promocell公司生产)等]。另外，神经细胞培养基或神经分化诱导培养基优选含有神经细胞诱导因子[例如，脑源性神经营养因子(bdnf)、成纤维细胞生长因子(fgf)]。另外，关于用于将本发明涉及的永生化细胞分化诱导为软骨细胞的培养基，可以使用市售的软骨细胞诱导培养基，或者在市售的动物细胞的培养基中含有地塞米松、抗坏血酸、tgf-β3的培养基。作为市售培养基，例如可举出间充质干细胞-软骨细胞分化培养基(promocell公司生产)、人间充质干细胞-软骨细胞分化培养基bulletkit(lonza公司生产)等。
[0126]
用于分化诱导的培养条件与培养普通干细胞时的培养条件相同。用于分化诱导的培养时间没有特别限制，一般为5～20天，优选为7～18天。
[0127]
干细胞是否分化诱导成了目标细胞，可以通过考察对各分化细胞具有特异性的标记的表达来确认。例如，向脂肪细胞的分化可以通过油红o染色来确认；向成骨细胞的分化可以通过碱性磷酸酶染色来确认；向神经细胞的分化可以通过neurofluor neuo染色来确认；向软骨细胞的分化可以通过阿尔新蓝染色来确认。
[0128]
由本发明得到的永生化细胞、永生化(干)细胞分化诱导而成的组织细胞例如可以通过将细胞移植到疾病或损伤部位等来使用，可以作为再生医疗用制品提供。作为再生医疗用制品，例如可举出培养皮肤、培养软骨、培养角膜上皮、各种细胞膜片(例如，表皮细胞膜片、成纤维细胞膜片、角膜内皮细胞膜片、心肌细胞膜片、成骨细胞膜片、成肌细胞膜片、神经细胞膜片、软骨细胞膜片、肝细胞膜片、胰岛细胞膜片、牙周膜细胞膜片等)等。
[0129]
[实施例]
[0130]
下面基于实施例对本发明进行更加详细的说明，但本发明并不受这些实施例限制。
[0131]
在之后的实施例中，培养人间充质干细胞(msc：mesenchymal stem cell)的含血清培养基是使用d-mem(低葡萄糖)、20％ fbs、0.01mol/l hepes、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20ng/ml bfgf的组分制作的。bfgf的半衰期非常短，因此使用稳定性优异的gibco热稳定重组人bfgf(赛默飞世尔科技公司)。msc在上述培养基中，在5％ co2培养箱内进行培养。需要说明的是，实验使用的人msc的来源是骨髓、脂肪组织、脐带血和脐带基质中的任一种。
[0132]
(实施例1)携带永生化基因的sev载体的制作和感染条件的研究
[0133]
(1)携带永生化基因的sev载体的制作
[0134]
选择广泛用作永生化因子的bmi-1(b淋巴瘤mo-mlv插入区1同源物)、htert(人端粒酶反转录酶)、sv40t(猿猴病毒40大t抗原)、e6/e7(人乳头瘤病毒16e6蛋白和e7蛋白)，向染色体非整合型rna病毒载体即sev载体中分别导入bmi-1基因(seq id no:1)、htert基因(seq id no:2)、sv40t基因(seq id no:3)、e6/e7基因(seq id no:4)。在sev载体中携带永生化基因以及制作载体的工作，委托给株式会社id pharma(总公司：日本国筑波市)进行。另外，关于4种载体中的3种载体，也同时携带荧光色素基因orf(红色)、gfp(绿色)、bfp(蓝
色)，用显微镜能够容易确认到是否存在基因表达(载体基因组)。将各载体的结构示于图1。关于永生化基因在sev载体中的携带位置，由于高表达的基因最终会长期表达，而在sev载体中携带在载体基因组上游的基因会高表达，因此bmi-1、sv40t携带在基因组的最上游。关于htert和e6/e7，由于高表达会导致载体生产效率下降，因此将携带位置改为下游。
[0135]
sev载体使用通过将培养温度从35℃改为37℃来使病毒载体从细胞内消失的改良ts15δf型载体[efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells(ipscs)by temperature-sensitive sendai virus vectors.ban h,nishishita n,fusaki n,tabata t,saeki k,shikamura m,takada n,inoue m,hasegawa m,kawamata s,nishikawa s.proc natl acad sci u s a.2011aug 23；108(34)：14234-9.]。
[0136]
(2)sev载体感染条件的研究
[0137]
在用sev载体导入基因时，细胞类型的不同会使感染效率发生较大变化。另外，如果过度感染，则根据细胞的种类可能发生损害。因此，为了在使用的细胞种类中事先确定感染moi[multiplicity of infection(感染复数)：相对于1个细胞的载体颗粒数量]，首先研究了msc中的感染moi。
[0138]
将市售的骨髓来源的间充质干细胞[产品名称：超高纯度人间充质干细胞(rec)，purec株式会社]以5
×
104个/孔(70％-80％汇合)的量接种到添加了200μl/孔的培养基的48孔板(falcon 353230)上，使该细胞单独感染或同时感染多个携带4种永生化因子基因的sev载体，孵育过夜，以使各载体的moi达到1、5、20。第二天更换为新鲜培养基，之后每2天更换培养基，在感染载体后第5天扩大到12孔板(falcon 353043)，在感染9天后对细胞进行观察。
[0139]
将结果示于图2～4。在从感染sev载体开始9天后，在所有孔中未确认到细胞受损，另外，在moi：20(作为sev载体本身为moi：80)也未确认到异常。通过荧光色素的表达，用倒置荧光显微镜(尼康)观察了sev载体的感染效率，结果在感染单独载体的情况中，在moi：20在几乎所有细胞中确认到了荧光色素的表达(图2)。在同时感染bmi-1和htert这两种因子的情况中，也得到了同样的结果(图3)。在同时感染bmi-1、htert、sv40t这三种因子的情况中，也得到了同样的结果(图4)。由此可以认为，如果在moi：20使细胞感染，则几乎100％的细胞中都可以导入基因。因此，将之后sev载体对msc的感染的moi确定为20。
[0140]
另外，在研究的sev载体的组合中，相比包括未感染的对照的其他组合，关于bmi-1、htert、sv40t这三种载体的同时感染，在高感染比例moi：20中确认到了细胞数量明显增加(图4)。moi：20的旺盛分裂的细胞，其大小比moi：1的未确认到荧光的细胞小，并且orf和gfp的荧光同时为阳性。也就是说，推断bmi-1、htert和sv40t这三种永生化因子的作用可以促进该细胞增殖。
[0141]
(实施例2)永生化因子的选定
[0142]
让单独携带4种永生化因子(bmi-1、htert、sv40t、e6/e7)基因的sev载体感染msc，进行长期培养，由此选定msc永生化所需的因子。
[0143]
该研究使用脐带血来源的msc[产品名称：脐带间充质干细胞；正常，人类(atcc pcs-500-010)]，让1种携带永生化因子基因的sev载体或2种以上的该载体的组合(共15组)感染上述msc(48孔板，3
×
104个/孔，moi：20)。将未感染sev载体的msc作为阴性对照。随着
msc的增殖，扩大培养为48孔
→
12孔
→
6孔，之后如果汇合(孔板的黏附面细胞汇合率100％)，则测定细胞数并进行传代，由此测定共计16种细胞的增殖速度，同时用显微镜观察细胞的形态。
[0144]
细胞的增殖速度从永生化基因导入(导入时的细胞数为3
×
104个)开始测定80天。在第80天将细胞数由多到少排列，将排列结果(no.1～no.16)与其细胞数一同示于下述的表1。
[0145]
[表1]
[0146][0147]
在阴性对照的细胞增殖停止约2个月(第59天)时观察细胞状态，以2个阶段判定细胞大小的均匀性和从培养孔板上剥离下的死细胞的程度(图5)。在表1中一并表示该判定结果(细胞大小均匀，细胞的剥离量少：〇；细胞大小不均匀，细胞的剥离量多：
×
；是否存在永生化因子用+或-表示)。
[0148]
如表1和图5所示，在所有没有htert因子的组合(包含阴性对照)中确认到细胞的形态异常，由此可以认为，在使用sev载体的细胞永生化中htert是必需的。另外，将细胞数与永生化因子的组合进行对比，结果几乎未确认到4种永生化因子中e6/e7的细胞增殖效果。
[0149]
根据以上结果，从表1中提取适合于使用sev载体进行永生化的永生化因子的组合，并总结在表2中(no.16作为阴性对照记录在内，以进行对比)。
[0150]
[表2]
[0151][0152]
将细胞的增殖曲线示于图6。阴性对照(no.16)在大约2个月(66天)后增殖停止，而永生化因子导入细胞(no.1、2、4、12)的增殖延长了。htert基因单独导入细胞(no.12)的增殖虽然延长，但在2个月以后增殖速度逐渐下降，无法期待更高的增殖。与此相对，导入了bmi-1与htert、htert与sv40t、bmi-1与htert与sv40t的组合的细胞(no.1、2、4)即使在第80天，其增殖速度也并未下降，观察到了稳定的增殖。其中，bmi-1与htert与sv40t这三种因子的组合的增殖速度最快。
[0153]
使用人脐带基质来源的间充质干细胞[产品名称：脐带基质来源的人间充质干细胞(hmsc-uc)，promo cell公司，产品编码c-12971]代替上述脐带血来源的msc，对永生化因子的组合进行了研究，结果表明，同样通过bmi-1、htert和sv40t的组合进行了永生化的细胞，其增殖最好，用显微镜观察到细胞均匀且状态最佳。
[0154]
(实施例3)通过携带3种因子(bmi-1/htert/sv40t)基因的sev载体进行永生化的培养细胞的分析
[0155]
(1)3种因子(bmi-1/htert/sv40t)导入细胞的制作
[0156]
在3种不同组织来源的msc的研究中，判断出携带3种因子(bmi-1/htert/sv40t)基因的sev载体最适合永生化，对利用该载体进行了永生化的msc进行了详细的性状分析。细胞使用了在永生化因子的选定中使用的脐带血来源的msc[产品名称：脐带间充质干细胞；正常，人类(atcc pcs-500-010)]，但该细胞的培养时间比选定时更长(不到1个月)。通过携带3种因子(bmi-1/htert/sv40t)基因的sev载体，与实施例2同样地在moi：20的条件下导入了基因。将未通过sev载体导入基因的msc作为阴性对照同时培养。
[0157]
(2)通过改变培养温度对比增殖速度
[0158]
使用6cm培养皿，在35℃的co2培养箱内对导入了3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的永生化细胞株进行培养，在增殖到孔板的黏附面细胞汇合率达到80％左右时，将1/5传代到新的6cm培养皿中，通过以上方法持续培养75天。
[0159]
携带永生化基因的sev载体是温度敏感性载体，通过将培养温度从35℃提升到37℃，可以使细胞内的sev载体基因组快速消失[efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells(ipscs)by temperature-sensitive sendai virus vectors.ban h,nishishita n,fusaki n,tabata t,saeki k,shikamura m,takada n,inoue m,hasegawa m,kawamata s,nishikawa s.proc natl acad sci u s a.2011aug 23；108(34)：14234-9]。因此，为了确认在msc中是否也能除去sev载体基因组，在培养上述导入了3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的永生化细胞时改变温度，考察了细胞数量的变化。
[0160]
在通过改变温度除去sev载体的研究中，使用了未处理的msc的增殖能力下降时期
的永生化细胞(第75天)。在第78天的细胞传代时，制作接种了相同细胞数量的2个培养皿，一个保持在35℃不变，另一个将培养温度提升到37℃，将二者的增殖图案进行对比。结果示于图7。在37℃培养的细胞，sev载体被除去(荧光消失)，增殖快速下降；而在35℃培养的细胞没有特别变化，导入基因后即使超过了130天，也在持续旺盛增殖(图7)。
[0161]
(3)通过改变培养温度对比荧光蛋白表达和细胞形态
[0162]
从温度变化开始10天后，用荧光显微镜确认了荧光蛋白的表达，结果，ofp(同时携带bmi-1)和gfp(同时携带htert)的荧光在培养温度保持在35℃的细胞中得到了确认，而在提升到37℃的细胞中却几乎无法确认到其表达(图8)。
[0163]
从传代培养开始的2周后(培养开始后第92天)确认了细胞形态，结果，在35℃分裂旺盛，未确认到细胞形态的变化，而在37℃细胞的分裂速度肉眼可见地下降，细胞的大小出现了不一，观察到与35℃的均匀性有较大不同(图9)。
[0164]
根据以上结果，温度从35℃变为37℃，使得在ips细胞中已经明确显现出的sev载体的温度敏感性效果在msc中也得到了确认，同时，通过除去3种永生化因子，细胞的永生化也会失效，从而恢复为有限增殖的细胞。
[0165]
(4)染色体分析
[0166]
通过奎纳吖啶-赫斯特(
キナクリン
·
ヘキスト
)差异染色法，以图7的
▽
点进行了细胞的染色体分析。关于奎纳吖啶-赫斯特差异染色法，首先在50ml的mcilvaine溶液(将280ml的0.1m柠檬酸溶液与220ml的0.2m磷酸氢二钠溶液混合，用高压釜处理)中浸渍染色体切片，再在50ml的mcilvaine溶液中溶解hoechst 33258(cat：b-2883-25mg，sigma公司)以达到10ng/ml而成的溶液中浸渍30分钟。用水流较弱的自来水从染色体切片的背面冲洗，洗涤后，再在mcilvaine溶液中浸渍5分钟，然后使用mcilvaine封闭液(mcilvaine与甘油按1：1混合)，覆盖盖玻片进行封闭。使用染色体分析显微镜(型号：axioimager z2,zeiss)和染色体分析软件(型号：ikaros v5.7.4cm/v5.4.12,metasystems)进行分析，结果表明，永生化细胞株在所有点上与亲本株同样为正常核型(图10)。
[0167]
(5)端粒长度的评价
[0168]
端粒长度的评价通过图6和图7的＊点进行。端粒长度的评价是以基因组dna为模板实施实时pcr，通过端粒序列的相对定量来进行的。使用gentra(注册商标)puregene(注册商标)试剂盒(qiagen)，参考厂商的步骤，从细胞中提取基因组dna。关于实时pcr，引物使用人端粒长度相对定量qpcr分析试剂盒(sciencell研究实验室)附带的端粒引物组和单拷贝参考引物组，pcr试剂使用faststart essential dna green master(罗氏公司)。pcr反应条件遵从厂商推荐的条件。使用steponeplus(life technologies japan)进行pcr反应和获取数据，通过stepone软件v2.3进行数据分析。
[0169]
将结果示于图11。在bmi-1、htert、sv40t这3种因子的组合，以及bmi-1与htert这2种因子的组合中确认到了端粒的延长，而在单独的htert中未观察到延长(图11a)。另外，在除去永生化因子之后的长期培养中，观察到了端粒的显著缩短(图11b)。即使未除去永生化因子(35℃)，也观察到了缩短，但是在最终取样中，端粒的长度与初始的hmsc程度相同。根据以上结果可以认为，增殖能力的对比表明，永生化需要htert，但htert并非充分条件。
[0170]
(实施例4)永生化群体细胞的分化能力
[0171]
关于实施例3制作的导入了3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的永生化细胞(msc)，考
察了其分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、软骨细胞的分化能力。分化试验使用了通过bmi-1、htert、sv40t这3种因子进行永生化并长期培养(从导入基因开始培养了4个月)的脐带血来源的msc(atcc pcs-500-010)。对未进行永生化的普通msc而言，4个月是培养困难的时间。
[0172]
msc的分化使用了市售(promo cell公司)的分化试剂盒。脂肪细胞分化使用间充质干细胞-脂肪细胞分化培养基2(产品编码：c-28016)，成骨细胞分化使用间充质干细胞-成骨细胞分化培养基(产品编码：c-28013)，神经细胞分化使用间充质干细胞-神经细胞分化培养基(产品编码：c-28015)，软骨细胞分化使用间充质干细胞-软骨细胞分化培养基(产品编码：c-28012)，操作方法按照附带的步骤说明实施。
[0173]
脂肪细胞分化的确认使用将作为脂肪细胞分化的指标的脂肪滴特异性染色的荧光色素lipi-green(同人化学，产品编码：ld02)进行。成骨细胞分化通过碱性磷酸酶染色进行确认。神经细胞分化的确认使用将神经细胞特异性染色的荧光色素neurofluor neuo(veritas，产品编码：st-01801)进行。软骨细胞分化通过阿尔新蓝染色进行确认。
[0174]
在从购买开始培养了2周左右的初期细胞中，将保持着分化能力、处于对数増殖期的未导入基因的msc作为阳性对照，与经过了4个月的永生化msc的分化能力进行对比，结果在脂肪细胞分化中，对于二者都观察到了作为分化指标的脂肪滴。永生化msc与阳性对照相比，分化程度低(图12)。在成骨细胞分化中，在永生化msc和阳性对照中均确认到碱性磷酸酶的染色，分化成了成骨细胞(图13)。永生化msc与阳性对照相比，分化率高。在神经细胞分化中，在永生化msc和阳性对照中均观察到了大致所有细胞中的荧光，说明正在分化成神经细胞(图14)。在软骨细胞分化中，永生化msc和阳性对照的分化程度无法对比，但是与阴性对照没有分化诱导相比，分化诱导的msc明显被阿尔新蓝染成深色，确认到了向软骨细胞的分化(图15)。根据以上结果可以确认，关于导入了3种因子(bmi-1/htert/sv40t)的永生化细胞(msc)，永生化后经过了4个月的msc也与阳性对照的msc同样地维持着多分化能力。
[0175]
(实施例5)永生化msc的克隆试验
[0176]
关于实施例3制作的导入了3种因子(bmi-1/tert/sv40t)的永生化细胞(msc)进行了试验，以确认是否能够克隆，或者未进行永生化的msc的克隆难度为何种程度。
[0177]
在从购买开始培养了2周左右的初期细胞中，使用保持着分化能力且处于对数增殖期的未导入基因的脐带血来源的msc(atcc pcs-500-010)、导入基因没多久(经过了2周)的永生化msc，以及在导入基因后进行了长期培养(经过了4个月)的永生化msc这3种msc，进行了克隆。
[0178]
对于培养并维持的3种msc，将其一次性打散成完全凌乱的单个细胞，测定细胞数量，然后接种到分成4个分区、每个分区24孔的96孔板上，使各分区的每个孔的细胞数按照4个细胞/100μl、8个细胞/100μl、16个细胞/100μl、32个细胞/100μl的方式变化，在35℃、5％ co2培养箱中进行培养，直到单个细胞形成集落。关于培养基的更换，在不打乱集落形成的前提下每3天更换一半量。
[0179]
培养10天进行显微镜观察，结果单个细胞增殖到了足够大的集落。于是，测定每个孔中形成的集落数量，将其样态示意性地总结在图中(图16、图17)。图中96孔内的数字表示形成的集落数。
[0180]
根据该结果，可以一眼判断出集落形成的容易性。未永生化的增殖初期msc属于普
通的msc，在32个细胞/孔的分区中，只有2个孔形成了集落。另一方面，通过sev载体导入了永生化基因的msc，在导入后没多久的2周内，即使在4个细胞/孔的低密度下，也以9孔/24孔的高频率形成了集落(图16)。经过了4个月的msc即使在4个细胞/孔的低密度下，也以16孔/24孔和半数以上的孔形成了集落(图17)。
[0181]
根据以上结果可以判明，即使是难以克隆的msc，当通过sev载体导入3种永生化基因时，无论之后经过了多少时间，都能容易地进行克隆。无论在哪个时期都能克隆，这在再生医疗的质量管理的观点上，是非常有用的。
[0182]
(实施例6)克隆永生化msc的各种分析
[0183]
(1)克隆细胞的增殖能力
[0184]
关于感染sev载体2周后作为单个细胞克隆的5个克隆的msc，在培养60天后，分成35℃和37℃进行培养。5个克隆中的3个克隆在37℃除去sev载体的同时增殖下降。关于其中的克隆a10，绘制了增殖曲线(图18)。
[0185]
(2)确认通过改变温度除去sev载体
[0186]
在35℃，与群体培养实验一样，通过荧光观察能够确认到sev载体的存在，但37℃的组则无法确认到sev载体的存在。
[0187]
(3)克隆细胞的染色体分析
[0188]
对克隆的10个克隆进行染色体分析，结果表明8个克隆为正常核型。其中，关于图18所示的显现出细胞增殖的克隆a10，给出核型分析结果(图19)。
[0189]
(4)克隆永生化msc的分化能力
[0190]
通过与实施例4相同的方法，对克隆的永生化msc中的5个克隆考察了向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞的分化能力。结果，与观察到克隆引起的形态不同一样，在分化程度方面也有不同。但是，在任意克隆中都确认到了向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞的分化，多分化能力得到了维持(图20)。通过克隆，也产生了分化状态比克隆前的细胞更好的细胞，在神经分化中，不仅观察到神经标记的表达，还观察到了神经突起正在形成扩展成网眼状的神经网络的样子。
[0191]
(实施例7)细胞年龄(衰老程度)不同的msc的永生化和单个细胞克隆
[0192]
由1个msc增殖而成的细胞群体，其遗传性质相同，因此质量稳定，容易进行质量管理。在这一点上，单个细胞克隆在再生医疗中具有重要意义。另外，当从外部导入基因时，在只选择目标细胞这一点上，单个细胞克隆也是不可或缺的。
[0193]
从人体内分离出的msc混入有从年轻细胞到衰老细胞的各种时期的细胞。其比例因个人而异，很难只提取出特定时期(年轻程度)的细胞使其增殖。反言之，如果从年轻细胞到衰老细胞，哪个时期的msc都能永生化，进而还能克隆的话，那么在再生医疗中其应用范围会大幅扩大。
[0194]
因此，将从年轻细胞到衰老细胞，或者其中间时期的3种细胞永生化，进而对能否进行单个细胞克隆进行了考察。
[0195]
细胞使用了脐带血来源的msc[产品名称：脐带间充质干细胞；正常，人类(atcc pcs-500-010)]。在37℃对购买的细胞进行大约80天的长期培养，直到增殖停止。其间，每隔大约1周进行传代，将细胞的一部分冷冻保存(图21)。
[0196]
在冷冻保存的这些细胞中，将初期、中期和后期(第9、24、49天)这3种细胞同时融
解，为了抑制冻融的影响，进行11天培养，接种到24孔板上(24孔，1
×
105个/孔)，然后在第二天用携带3种因子(bmi-1/htert/sv40t)基因的sev载体以moi：20将细胞感染，进行永生化(第21、36、61天)。
[0197]
进行永生化诱导后，将细胞从37℃转移到35℃的co2培养箱，进行8天扩大培养(24孔
→
6孔)。之后，将进行了永生化诱导的细胞接种到96孔板，使每个孔的细胞为1个、2个、4个，未进行永生化诱导的对照细胞则以每个孔5个、10个、15个、20个的形式接种，大约培养2周，直到1个细胞分裂增殖并出现细胞群体(集落)，通过显微镜观察来统计产生的集落数量。
[0198]
在接种到96孔板之前(感染sev载体8天后)，对3种细胞年龄(初期、中期、后期)不同的msc中感染了sev载体的细胞和未感染sev载体的细胞的形态进行了观察，在外观上也明显出现了不同(图22)。
[0199]
从图22可以看出，细胞越年轻，反映细胞数量的细胞密度越高，细胞增殖旺盛。是否感染sev载体所引起的细胞数量的不同并未明显出现，但在后期的细胞中观察到了感染sev载体的细胞的细胞数量明显增加。特别是在细胞的形态和大小方面变化显著，在未感染sev载体的对照中，随着时间的经过，细胞发生巨大化，分裂速度下降；而在感染sev载体的细胞中，分裂变得活跃，细胞的大小程度相同，初期、中期和后期在大小方面已经无法区分。
[0200]
用96孔板进行的克隆结果，对于未感染sev载体的细胞，在每孔5个细胞中未出现集落，确认到克隆与实施例5同样困难。在感染sev载体的细胞中，在按照每孔1个的比例接种的单个细胞克隆的孔板上，也观察到了众多集落(图23-1、图23-2)。
[0201]
在初期的细胞中，在96孔中的30孔观察到集落；在中期，在47孔观察到集落；在后期，在27孔观察到集落。该结果表明，通过sev载体进行了永生化诱导的msc，与其衰老程度无关，能够容易获得1个细胞来源的细胞群体。
[0202]
(实施例8)确认针对停止增殖的msc的效果
[0203]
确认了携带永生化基因的sev载体对细胞分裂完全停止的msc的效果。
[0204]
将冷冻保存的细胞增殖大致停止状态的细胞(第72天)冻融，接种到24孔板上，在抑制冻融的影响的同时，让确认到未发生细胞增殖的细胞(第90天)感染sev载体(24孔，1
×
105个/孔，moi：20)。之后，用显微镜观察了细胞的变化。
[0205]
在未感染sev载体的细胞(对照细胞)中，观察到完全没有较大变化，全部细胞蜷缩死亡的样子。另一方面，在感染sev载体的细胞中，几天内未看到变化，但认为在1周后多数细胞会蜷缩变化而直接死亡，然而从其中观察到黏附性小的细胞，2周后变成了与永生化细胞同样旺盛增殖的细胞群体(图24)。
[0206]
对于开始再次增殖的细胞，与实施例7同样地进行了单个细胞克隆。结果，上述单个细胞的比例虽然低于图23-1、图23-2的结果，但在96孔中的17孔中确认到增殖的细胞群体，在分裂完全停止的细胞中也确认到通过感染sev载体而再次开始分裂，从而能够进行单个细胞克隆(图25)。
[0207]
该变化与伴随细胞永生化的细胞增殖不同，而是正在除去细胞增殖所不需要的细胞质。虽然详细的机理还不清楚，但使因衰老导致增殖完全停止的细胞再次增殖，在这种情况下，与其说是“永生化”，不如说更符合“细胞返老还童”的表述。
[0208]
(实施例9)无血清培养基中的人间充质干细胞的细胞增殖的研究
[0209]
实验中使用了脂肪组织来源的人间充质干细胞hmsc-at(promocell；c-12977)和骨髓来源的人间充质干细胞hmsc-bm(promocell；c-12974)。将对hmsc-at和hmsc-bm实施sev载体感染的日期作为“感染日”，则用添加有血清的培养基，将hmsc-at的未感染细胞和感染细胞分别培养至从感染日起第13天和第11天，将hmsc-bm的未感染细胞和感染细胞分别培养至从感染日起第11天和第17天。添加有血清的培养基使用d-mem(低葡萄糖)、20％ fbs、0.01mol/l hepes、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20ng/ml bfgf的组分的培养基。之后，更换成无血清培养基，继续进行培养。无血清培养基使用适合间充质干细胞的干细胞(ajinomoto；a3)培养基。培养皿使用通过imatrix-511silk(matrixome；892 091)包覆的6cm培养皿(康宁；353004)。
[0210]
关于sev载体的感染，在moi：40的条件下使2
×
105个细胞的hmsc-at细胞或hmsc-bm细胞感染sev载体。非感染条件和感染条件分别实施1次。在感染24小时后更换培养基，继续维持培养。细胞培养是在35℃、5％co2培养箱内进行。
[0211]
hmsc-at细胞的实验中，未感染的细胞株确认到细胞数量的减少，因此在从感染日起第52天结束培养。另一方面，感染sev载体的细胞株在第52天之后也在持续增殖(图26)。
[0212]
在hmsc-bm细胞的实验中，未感染的细胞株在从感染日起第40天以后细胞增殖停止，不再增殖，在第72天测定了细胞数量。结果，细胞数量在检测限以下，因此在该时间点结束细胞培养。另一方面，感染sev载体的细胞株在第40天也在持续增殖(图27)。
[0213]
由以上结果可以确认，通过感染sev载体，脂肪组织来源的msc细胞和骨髓来源的msc细胞也能够和脐带血来源的msc细胞一样延长细胞分裂能力，另外，和添加有血清的培养基一样，感染的细胞也能在无血清培养基中持续增殖。
[0214]
感染sev载体后，进行gfp(htert)和ofp(bmi-1)的荧光观察。将hmsc-at细胞和hmsc-bm细胞在无血清培养基中的培养初期的时间点(从感染日起第16天、第24天)与在无血清培养中继续培养的时间点(从感染日起第58天、第50天)进行对比，确认到gfp和ofp的表达得到维持(图28)。由该结果可以确认，与在添加有血清的培养基中培养一样，在无血清培养基中持续培养，也能维持sev。
[0215]
(实施例10)永生化大鼠msc细胞增殖的研究
[0216]
使用大鼠皮下脂肪来源的间充质干细胞增殖培养基(科斯莫生物技术有限公司，msa-gm)，培养大鼠皮下脂肪来源的间充质干细胞rmsc细胞(科斯莫生物技术有限公司，msa01c)。
[0217]
关于sev载体的感染，在moi：40的条件下使2
×
105个细胞的rmsc细胞感染sev载体。非感染条件实施1次，感染细胞株实施2次。在感染24小时后更换培养基，继续维持培养。培养皿使用胶原蛋白包覆培养皿(iwaki,4810-010)，保持在35℃、5％ co2培养箱内。
[0218]
实施了长期培养后，原本传代几次增殖能力就会下降的rmsc细胞株中，在未感染的细胞中确认到持续增殖的现象(图29)。这是因为rmsc细胞株偶然发生了永生化。但是，进行了75天的培养后，确认到与未感染的细胞相比，感染细胞的增殖速度要快2倍以上。
[0219]
感染sev载体后，进行gfp(htert)和ofp(bmi-1)的荧光观察。荧光照片使用all-in-one显微镜(基恩士，bz-x800)拍摄。照片是在20倍的倍率、gfp和ofp的曝光时间分别为1/5秒和1/20秒的条件下拍摄的。荧光观察的结果，即使在感染后培养了58天，在35℃的条件下，也确认到了ofp(bmi-1)和gfp(htert)的表达(图30)。
[0220]
(实施例11)永生化hfl1细胞增殖的研究
[0221]
在ham’s f12培养基(nakalai；17458-65)中加入15％(v/v)灭活的胎牛血清(nichirei；175012)和100u/ml的青霉素-链霉素溶液(富士胶片和光纯药株式会社，168-23191)，在该培养基中培养人成纤维细胞(hfl1细胞，理研：rcb0521)。
[0222]
关于sev载体的感染，在moi：40的条件下使2
×
105个细胞的hfl1细胞感染sev载体。非感染条件和感染条件分别实施2次。在感染24小时后更换培养基，继续维持培养。感染细胞在感染后第34天分成两组，一组是在35℃培养的条件，另一组是在37℃培养的条件(图31，箭头)。细胞培养是在各温度、5％ co2培养箱内进行。
[0223]
未感染的细胞确认到细胞数量的减少，因此在从感染日起第148天结束培养。另一方面，在感染的细胞株中，在37℃培养的细胞不再增殖，因此在从感染日起第259天或第273天结束培养(图31)。这表明，通过感染sev载体，在hfl1细胞中也能够延长细胞分裂能力。
[0224]
通过计算，考察了培养开始后细胞增殖了多少。结果，未感染的细胞在细胞数量为17个数量级时停止增殖，而感染sev载体且在37℃培养时则在31个数量级停止增殖。感染sev载体且在35℃培养时，在培养期间内增殖也没有停止，而是增殖到了43个数量级附近，在260天里与未感染sev载体的细胞进行对比，结果出现了26个数量级的差。由以上结果可以确认，在人成纤维细胞hfl1中，通过感染sev载体，可以使细胞更多地增殖。
[0225]
感染sev载体后，进行gfp(htert)和ofp(bmi-1)的荧光观察。将结果示于图32。在从感染日起第34天的时间点，显示出了与从感染日起第10天的细胞相同的gfp和ofp的荧光信号。在35℃和37℃的各个条件下进一步培养221天。在35℃持续培养的细胞，在第255天的细胞与第34天相比，gfp的表达显著减少，而ofp保持在与第10天和第34天同样的水平。另一方面，在37℃培养的细胞，与第10天和第34天的细胞相比，gfp和ofp的阳性率均显著减少。由这些结果可以确认，sev被温度敏感性地除去了。
[0226]
另外，一般发生衰老的细胞，有时会显现出细胞大小变大，形状平坦、形成空胞等特征。在35℃培养的感染细胞与在37℃培养的感染细胞相比，未显现出细胞衰老的特征。由该结果可以确认，在35℃持续培养的细胞在细胞形态方面没有发生细胞衰老。
[0227]
(实施例12)永生化huvec细胞增殖的研究
[0228]
在内皮细胞培养基(sciencell；1001)中培养人脐静脉内皮细胞(huvec细胞，promocell公司，c-12205)。
[0229]
关于sev载体的感染，在moi：40的条件下使2
×
105个细胞的huvec细胞感染sev载体。非感染条件实施1次，感染条件实施2次。在感染24小时后更换培养基，继续维持培养。感染细胞在感染后第35天分成两组，一组是在35℃培养的条件，另一组是在37℃培养的条件(图33，箭头)。细胞培养是在各温度、5％ co2培养箱内进行。
[0230]
未感染的细胞确认到细胞数量的减少，因此在从感染日起第39天结束培养。另一方面，感染的细胞在从感染日起第74天也在持续增殖(图33)。由此可以确认，通过感染sev载体，在huvec细胞中也能够延长细胞增殖。
[0231]
通过计算，考察了培养开始后细胞增殖了多少。结果，未感染的细胞在细胞数量为8个数量级附近时停止增殖，而感染sev载体且在37℃培养时则增殖到了18个数量级。感染sev载体且在35℃培养时，细胞持续增殖，增殖到了21个数量级附近，在74天里与未感染sev载体的细胞的细胞数量出现了13个数量级的差。由以上结果可以确认，在人脐静脉内皮细
胞huvec细胞中，通过感染sev载体，可以使细胞更多地增殖。
[0232]
感染sev载体后，进行gfp(htert)和ofp(bmi-1)的荧光观察。将结果示于图34。在从感染日起第36天的时间点，在35℃持续培养的细胞显示出了与从感染日起第7天的细胞相同的gfp和ofp的荧光信号。之后，在35℃和37℃的各个条件下进一步培养37天，结果，在35℃持续培养的细胞与从感染日起第7天和第36天的细胞相比，荧光阳性细胞的比例减少，但在很多的细胞中确认到了荧光信号。另一方面，在37℃培养的细胞，与第7天和第36天的细胞相比，荧光阳性细胞的比例显著减少。由此可以确认，sev被温度敏感性地除去了。
[0233]
(实施例13)插入多种生长因子的人类人工染色体载体向永生化msc细胞的导入与长期培养后的稳定性和分化诱导
[0234]
(1)通过微核细胞融合的染色体转移与抗药性克隆的分离
[0235]
作为染色体供体细胞，使用watanabe at al.(mol ther nucleic acids.2015)记载的携带hgf(hgf)、gdnf(gdnf)、igf-1(igf-1)和萤光素酶(e-luc)的携带21hac2的cho细胞；作为染色体受体细胞，使用实施例1记载的永生化msc细胞即hmsc-uc no.3细胞，通过katoh et al.(bmc biotechnology,2010,10：37)记载的方法进行微核细胞融合和培养。在bs选择培养下培养1周，结果出现了抗性集落，将通过4次融合获得的共计9个集落分离并使其增殖，进行了之后的分析。
[0236]
(2)确认转移的染色体
[0237]
(2-1)荧光显微镜观察
[0238]
将克隆的9个集落在荧光显微镜下观察，结果在全部克隆中观察到了gfp阳性细胞，其阳性率为50％～100％。
[0239]
(2-2)fish分析
[0240]
将携带hgf(hgf)、gdnf(gdnf)、igf-1(igf-1)和萤光素酶(e-luc)的pac作为探针，对通过pcr分析确认的4个克隆(克隆名称：hmsc-uc no.3#1-01、#1-02、#2-01、#3-01)进行fish分析，结果没有发生核型异常，确认到携带人类人工染色体的克隆有2个克隆(图35，hmsc-uc no.3、#3-01)。
[0241]
(3)体外分化诱导
[0242]
关于通过pcr分析确认的上述4个克隆，可以按照okamoto等(bbrc,295：354,2002)的方法，诱导其分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，确认是否保持与亲本株同等的分化能力。
[0243]
由以上(1)～(3)的分析结果可以确认，通过微核细胞融合携带插入多种生长因子的人类人工染色体载体的永生化msc获得了2个克隆。
[0244]
(实施例14)炎性肠病模型中永生化msc的肠炎治愈效果的验证
[0245]
(1)cd4阳性cd45rb高阳性cd25阴性(cd4
+
cd45rb
high+
cd25-)t细胞的分离
[0246]
将30只雌性8周龄的balb/cajcl(日本clea公司)驯化1周后，在麻醉状态下通过心脏抽血进行除血，采集脾脏和肠系膜淋巴结。使用macs系统(美天旎生物科技公司)将脾脏组织分散后进行溶血处理。使用1ml注射器柱塞将肠系膜淋巴结捣碎，用40μm细胞筛网进行过滤。将脾脏和肠系膜淋巴结一并通过cd4微珠(美天旎生物科技公司)处理分离cd4阳性细胞后，为了分离出cd4+cd45rbhigh+cd25-t细胞，用抗体[apc-h7大鼠抗小鼠cd4抗体(bd)、fitc大鼠抗小鼠cd45rb抗体(bd)、pe/cy7抗小鼠cd25抗体(biolegend)]进行标记，利用流
式细胞仪(moflo xdp,beckman)进行分离。
[0247]
(2)cd4
+
cd45rb
high+
cd25-t细胞转移
[0248]
对9周龄的雌性scid(c.b-17/lcr-scid/scidjcl：日本clea公司)，通过尾静脉注射以每只4.0
×
105个的量移植cd4+cd45rbhigh+cd25-t细胞[细胞移植组：1组8只
×
5组；未处理组(施用pbs)：1组
×
7只]。移植后，每周实施3次体重测量和毛色与粪便状态的观察。从给予细胞起21天后，根据体重的变化，利用统计分析软件jmp的“通过多变量分配区块”系统进行随机分配，将细胞移植组分组。此时，将相对体重平均值
±
2sd范围外的个体排除在外。
[0249]
(3)移植细胞培养
[0250]
为了获得用于移植的细胞，通过各细胞培养条件对hmsc-uc(亲本msc)和永生化msc进行了培养。
[0251]
(4)给予msc(移植用于治疗的细胞)
[0252]
在移植cd4+cd45rb high+
cd25-t细胞之后的第21天、第28天、第35天，通过尾静脉注射，以每只小鼠1.0
×
106个的量给予亲本msc和永生化msc。作为阳性对照，从第21天开始，皮下给药14天地塞米松[sigma公司：dex(1mg/kg、100μl/只)]。dex溶液根据第21天和第28天的组平均体重随用随制。
[0253]
(5)材料采集
[0254]
从实验开始起第42天，全部采血，制备血清(-80℃保存)。然后采集幽门环到肛门(结肠～直肠)之间的消化道，评价其状态并测量重量和长度，然后用10％福尔马林固定。
[0255]
将结果示于图36。对于使用了scid小鼠的过继免疫移植ibd模型，观察了msc移植对肠炎的治疗效果，结果在dex给药组、亲本msc给予组、永生化msc给予组中发现，与非处理组相比，临床评分值(体重减少评分、肥厚评分、粪便评分、毛色评分的各分值)大幅减少。特别是在亲本msc给予组中减少了近1/2，可以期待对改善肠炎的高效果。永生化msc给予组与亲本msc给予组没有显著差异，与dex给药组相当，因此可知，即使在永生化和通过永生化的长期培养后，msc亲本株的肠炎治愈效果也会维持。关于用于移植的细胞的培养，与培养初期的亲本细胞相比，永生化细胞的增殖明显良好，细胞的制备不费工夫。
[0256]
工业实用性
[0257]
本发明能够用于细胞医疗和再生医疗的领域。本发明的细胞永生化技术不仅可以用于细胞增殖慢的正常细胞，也可以用于癌细胞等细胞，在基础研究领域也可利用。另外，也可以进行在基因导入和染色体转移中所必需的单个细胞克隆化。而且，通过本发明得到的细胞不会衰老而会持续增殖，因此能够使质量管理更加容易，促进培养的机械化，大幅降低细胞的制备成本，处理大量的细胞数。因此，本发明可以扩大细胞医疗和再生医疗中的适用疾病的范围，有助于日本国内外的医疗相关产业的活跃。
[0258]
本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

技术特征：
1.一种可逆性永生化细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤(1)和步骤(2)：步骤(1)，将携带永生化基因的染色体非整合型rna病毒载体导入到哺乳动物的细胞中，在该细胞中使永生化基因表达；步骤(2)，对步骤(1)中得到的细胞进行培养，使其增殖。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述永生化基因为选自由以下基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因：bmi-1基因、tert基因和sv40t基因。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述永生化基因为以下(a)～(d)中的任一种：(a)bmi-1基因、tert基因和sv40t基因的组合；(b)bmi-1基因和tert基因的组合；(c)tert基因和sv40t基因的组合；(d)tert基因。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述细胞为体细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述体细胞为成体干细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述成体干细胞为间充质干细胞。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述染色体非整合型rna病毒载体为负链rna病毒载体。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述负链rna病毒载体为副黏病毒载体。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述副黏病毒载体为仙台病毒载体。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述仙台病毒载体为温度敏感性仙台病毒载体。11.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：所述染色体非整合型rna病毒载体为仙台病毒载体，在所述步骤(2)的培养后，除去该仙台病毒载体。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述仙台病毒载体是通过将培养温度从35℃变更为37℃来除去的。13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在所述步骤(2)的培养后，对永生化细胞进行克隆。14.一种永生化细胞，其是通过权利要求1～13中任一项所述的方法获得的。15.一种永生化细胞，其包含处于能够除去的状态的携带选自由以下基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因的仙台病毒载体：bmi-1基因、tert基因和sv40t基因。16.一种再生医疗产品，其包含权利要求14或15所述的永生化细胞。17.一种温度敏感性仙台病毒载体，其携带选自由以下基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因：bmi-1基因、tert基因和sv40t基因。18.一种用于制作可逆性永生化细胞的试剂盒，其包含权利要求17所述的温度敏感性仙台病毒载体。

技术总结
本发明的目的在于提供能够长时间使导入有永生化基因的细胞增殖而不会损伤该细胞的染色体、且能够除去永生化基因的可逆性永生化细胞的制备方法，以及大量获得能够克隆且质量稳定的可逆性永生化细胞的方法。本发明提供包括以下步骤的可逆性永生化细胞的制备方法：将携带选自由Bmi-1基因、TERT基因和SV40T基因组成的组的一种或两种以上的永生化基因的染色体非整合型RNA病毒载体导入到哺乳动物的细胞中，在该细胞中使永生化基因表达；对得到的细胞进行培养，使其增殖。使其增殖。使其增殖。


技术研发人员：押村光雄 田畑寿晃 香月康宏 宇野爱海
受保护的技术使用者：国立大学法人鸟取大学
技术研发日：2021.11.05
技术公布日：2023/7/12