GLP-1/GIP双重激动剂、其长效缀合物，以及包括其的药物组合物的制作方法

glp-1/gip双重激动剂、其长效缀合物，以及包括其的药物组合物
技术领域
1.本公开涉及一种glp-1/gip双重激动剂、其长效缀合物，以及包括其的用于预防或治疗糖尿病的药物组合物。


背景技术：

2.胰高血糖素样肽-1(glp-1；glucagon-like peptide-1)是小肠响应于饮食摄取而分泌的肠促胰岛素(incretin hormone)，根据血糖浓度血糖浓度促进胰腺的胰岛素分泌并抑制胰高血糖素的分泌来贡献降低血浆浓度的作用。并且，还用作饱感因子来推延胃肠的消化作用，并推迟饮食消化产物通过胃肠的时间来减少饮食摄取量。还有，据报告，将其施用于小鼠时有抑制食物摄取和降低体重的效果，并且确认这种效果在正常和肥胖症状态都出现，由此显示出作为肥胖症治疗剂的可能性。
3.胰高血糖素样肽-1(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,gip)是由胃肠道分泌的代表性的肠道激素之一种也是一种神经激素，与glp-1相同，响应于食物摄取刺激而分泌。gip是一种由从小肠的k细胞分泌的42个氨基酸组成的激素，其具有通过根据血糖浓度调节从胰脏的胰岛素或胰高血糖素的分泌来维持血糖的体内稳态，并且，已有报告其与glp-1相同具有通过中枢神经和迷走神经抑制食物摄取的功能。
4.对于glp-1而言，由于通过根据血糖的胰岛素分泌的血糖降低和通过食物抑制的体重降低效果，作为糖尿病和肥胖症治疗剂，已用于糖尿病患者和肥胖症患者至少10年，并且，目前积极地进行对功效更佳且耐久性更强的各种改良药物的开发。然而，仅使用glp-1系统的药物，糖化血红蛋白(hba1c)的预期降低功效无法超过2％，因此，具有超过9％的糖化血红蛋白的糖尿病患者可能需要组合使用胰岛素系统药物。实际上，glp-1和胰岛素的复合剂已被承认并使用。然而，由于使用胰岛素，所述复合剂仍然伴随引起低血糖的风险。因此，能够调节血糖且引起低血糖的风险较低的gip已被知晓为glp-1系统药物的新搭档。
5.若开发能够同时激活glp-1受体和gip受体的双重激动剂，可以预期对glp-1受体和gip受体各自具有更佳的血糖和体重调节效果，而没有对低血糖的忧虑。因此，有期待一种能够高度激活glp-1受体和gip受体的新型物质可能作为能够替代glp-1系统药物的下一代的糖尿病和肥胖症治疗剂。


技术实现要素：

6.技术问题
7.提供一种新型的glp-1/gip双重激动剂。
8.提供一种多核苷酸，其编码所述glp-1/gip双重激动剂。
9.提供一种载体，其包括所述多核苷酸。
10.提供一种宿主细胞，其包括所述多核苷酸或载体。
11.提供一种缀合物，其中所述glp-1/gip双重激动剂与增加体内半衰期的生物相容
性物质互相结合。
12.提供一种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接收的盐、其溶剂合物，或所述缀合物。
13.提供一种预防或治疗糖尿病的方法，其包括将有效量的所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物，或所述缀合物，或所述药物组合物施用于需要其的个体。
14.提供所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物，或其缀合物在制备用于预防或治疗糖尿病的药剂中的用途。
15.技术方案
16.在整个说明书中，对自然存在的氨基酸使用常用的单字母代码和三字母代码，还对诸如氨基异丁酸(aib；α-aminoisobutyric acid)、正亮氨酸(norleucine，2-aminohexanoic acid)等其他氨基酸也使用通常接受的三字母代码。并且，在本说明书中，用略语提及的氨基酸是根据国际生物化学联合会(iupac-iub)命名法记载的。
17.丙氨酸ala，a
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
精氨酸arg，r
18.天冬酰胺asn，n
ꢀꢀꢀꢀꢀ
天冬氨酸asp，d
19.半胱氨酸cys，c
ꢀꢀꢀꢀꢀ
谷氨酸glu，e
20.谷氨酰胺gln，q
ꢀꢀꢀꢀꢀ
甘氨酸gly，g
21.组氨酸his，h
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
异亮氨酸ile，i
22.亮氨酸leu，l
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
赖氨酸lys，k
23.蛋氨酸met，m
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
苯丙氨酸phe，f
24.脯氨酸pro，p
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
丝氨酸ser，s
25.苏氨酸thr，t
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
色氨酸trp，w
26.酪氨酸tyr，y
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
缬氨酸val，v
27.一方面提供一种glp-1/gip双重激动剂。
[0028]“胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，glp-1)”是小肠的l细胞响应于饮食摄取而分泌的一种激素，其根据血糖浓度促进从胰脏的胰岛素分泌并抑制胰高血糖素的分泌以协助降低血糖浓度的作用。
[0029]
根据最初报告，“葡萄糖依赖性胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide或gastric inhibitory polypeptide，gip)”是小肠的l细胞响应于饮食摄取而分泌的一种激素，且被首次报告为参与血糖浓度调节的物质。
[0030]
所述“glp-1/gip双重激动剂(glp-1/gip dual agonist)”可以与“glp-1/gip受体双重激动剂”、“glp-1受体和gip受体双重激动剂”、“glp-1r/gipr双重激动剂”、“双重激动剂”，或“对glp-1受体和gip受体具有活性的肽”互换使用。
[0031]
所述glp-1/gip双重激动剂可以是对glp-1受体和gip受体中的一个或更多具有活性的肽，具体地，可以是对glp-1受体和gip受体具有活性的肽。所述“对glp-1受体和gip受体具有活性的肽”可以是指对所述glp-1受体和gip受体具有显著水平的活性，具体地，可以是指其体外(in vitro)活性与天然型配体(天然型glp-1或天然型gip)相比对glp-1受体和gip受体分别为约0.1％或更高、1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高、5％或更高、6％或更高、7％或更高、8％或更高、9％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％
或更高、50％或更高、60％更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、100％或更高、100％至500％，或100％至200％。关于对所述glp-1受体和gip受体具有活性的肽的体外活性的方法，可以参照本技术说明书中的实施例2，但所述方法不限于此，只要是本领域公知的方法，可以适当使用该方法来测定体外活性。
[0032]
所述glp-1/gip双重激动剂可以对glp-1和gip表现出平衡的活性。对glp-1和gip具有平衡的活性是指，在体外结合试验中肽对glp-1受体和gip受体的亲和度接近1：1的摩尔比，具体地，1：100至100：1的摩尔比，更具体地1：10至10：1的摩尔比，更加具体地1：2至2：1的摩尔比。
[0033]“约”是包括
±
0.5、
±
0.4、
±
0.3、
±
0.2、
±
0.1等的范围，且包括等同或类似于记载于术语“约”后面的所有数值，但不限于此。
[0034]
根据一个实施方式，所述glp-1/gip双重激动剂可以是指一种天然或未突变的蛋白质(例如，glp-1或gip)，其中在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多氨基酸被保守性取代，但不限于此。
[0035]“保守性取代(conservative substitution)”是指一个氨基酸被具有类似的结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代。所述双重激动剂可以仍然保持天然型或未突变的glp-1或gip蛋白的生物活性的同时具有例如一个或更多保守性取代。这种氨基酸取代通常可以起因于在残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性(amphipathic nature)方面的类似性。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。并且，氨基酸可以分为具有带电的(electrically charged)侧链的氨基酸和不带电的(uncharged)侧链的氨基酸。具有带电的侧链的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，具有不带电的侧链的氨基酸可以进一步分为非极性(nonpolar)氨基酸和极性(polar)氨基酸。非极性氨基酸可以包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸；极性氨基酸可以包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。可以预期，用具有与上述相似性质的氨基酸的保守性取代会表现出相同或类似的活性。
[0036]
所述glp-1/gip双重激动剂可以是非自然产生(non-naturally occurring)的。
[0037]
所述glp-1/gip双重激动剂可以是经分离的肽。
[0038]
在一个实施方式中，所述glp-1/gip双重激动剂是包括由以下通式1表示的氨基酸序列的肽：
[0039]
r1-xaa1-aib(氨基异丁酸)-glu-gly-thr-phe-xaa7-ser-asp-tyr-ser-xaa12-xaa13-xaa14-xaa15-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20-xaa21-phe-xaa23-xaa24-trp-leu-xaa27-xaa28-xaa29-xaa30-xaa31-xaa32-xaa33-xaa34-xaa35-xaa36-xaa37-xaa38-xaa39-xaa40-xaa41-xaa42-xaa43(通式1)
[0040]
在所述通式1中，
[0041]
r1为咪唑-4-乙酸(4-imidazoleacetic acid，ca)或不存在，
[0042]
xaa1为酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、3-(4-羟基苯基)丙酸(3-4-(hydroxyphenyl)propanoic acid，hp)，或2-(4-羟基苯基)乙酸(2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid，ha)，
[0043]
xaa7为苏氨酸(thr，t)或异亮氨酸(ile，i)，
[0044]
xaa12为谷氨酸(glu，e)、异亮氨酸(ile，i)、赖氨酸(lys，k)，或精氨酸(arg，r)，
[0045]
xaa13为丙氨酸(ala，a)、aib、酪氨酸(tyr，y)，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0046]
xaa14为蛋氨酸(met，m)或亮氨酸(leu，l)，
[0047]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0048]
xaa16为赖氨酸(lys，k)、谷氨酸(glu，e)、丙氨酸(ala，a)，或正亮氨酸(norleucine，nle)，
[0049]
xaa17为谷氨酸(glu，e)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0050]
xaa18为丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)，或组氨酸(his，h)，
[0051]
xaa19为缬氨酸(val，v)、丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、丝氨酸(ser，s)，或半胱氨酸(cys，c)，
[0052]
xaa20为精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)、aib，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0053]
xaa21为谷氨酸(glu，e)、天冬氨酸(asp，d)、丙氨酸(ala，a)、亮氨酸(leu，l)，或aib，
[0054]
xaa23为异亮氨酸(ile，i)或缬氨酸(val，v)，
[0055]
xaa24为丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、丝氨酸(ser，s)，或天冬酰胺(asn，n)，
[0056]
xaa27为缬氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)，或异亮氨酸(ile，i)，
[0057]
xaa28为赖氨酸(lys，k)、天冬氨酸(asp，d)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、丙氨酸(ala，a)，或aib，
[0058]
xaa29为甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、或谷氨酰胺(gln，q)，
[0059]
xaa30为甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、赖氨酸(lys，k)，或精氨酸(arg，r)，
[0060]
xaa31为脯氨酸(pro，p)或甘氨酸(gly，g)，
[0061]
xaa32为丝氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)，
[0062]
xaa33为丝氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)，
[0063]
xaa34为甘氨酸(gly，g)、天冬酰胺(asn，n)，或丝氨酸(ser，s)，
[0064]
xaa35为丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)，或天冬氨酸(asp，d)，
[0065]
xaa36为脯氨酸(pro，p)或色氨酸(trp，w)，
[0066]
xaa37为脯氨酸(pro，p)或赖氨酸(lys，k)，
[0067]
xaa38为脯氨酸(pro，p)或组氨酸(his，h)，
[0068]
xaa39为丝氨酸(ser，s)、半胱氨酸(cys，c)，或天冬酰胺(asn，n)，
[0069]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)、赖氨酸(lys，k)、酪氨酸(tyr，y)，或异亮氨酸(ile，i)，或不存在，
[0070]
xaa41为赖氨酸(lys，k)或苏氨酸(thr，t)，或不存在，
[0071]
xaa42为谷氨酰胺(gln，q)，或不存在，
[0072]
xaa43为半胱氨酸(cys，c)，或不存在。
[0073]
这些肽的示例性种类可以包括选自由序列号1至44组成的组中的任一个氨基酸序列。
[0074]
然而，在所述通式1中，若xaa40至xaa43中任一个氨基酸不存在，其后的氨基酸序
列可能不存在。作为一个例子，当xaa40不存在时，xaa41至xaa43可能也不存在。作为另一个例子，当xaa41不存在时，xaa42至xaa43可能不存在。
[0075]
根据另一个实施方式，所述肽可以包括由以下通式2表示的氨基酸序列：
[0076]
xaa1-aib(氨基异丁酸)-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-xaa12-xaa13-leu-xaa15-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20-xaa21-phe-val-xaa24-trp-leu-xaa27-xaa28-xaa29-xaa30-pro-ser-ser-gly-xaa35-pro-pro-pro-ser-xaa40-xaa41(通式2)
[0077]
在所述通式2中，
[0078]
xaa1为酪氨酸(tyr，y)或组氨酸(his，h)，
[0079]
xaa12为异亮氨酸(ile，i)或赖氨酸(lys，k)，
[0080]
xaa13为丙氨酸(ala，a)、aib、酪氨酸(tyr，y)，
[0081]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0082]
xaa16为赖氨酸(lys，k)或谷氨酸(glu，e)，
[0083]
xaa17为异亮氨酸(ile，i)、赖氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0084]
xaa18为丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)，
[0085]
xaa19为丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)，或半胱氨酸(cys，c)，
[0086]
xaa20为精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)、aib，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0087]
xaa21为谷氨酸(glu，e)、天冬氨酸(asp，d)、丙氨酸(ala，a)，或aib，
[0088]
xaa24为谷氨酰胺(gln，q)或天冬酰胺(asn，n)，
[0089]
xaa27为亮氨酸(leu，l)或异亮氨酸(ile，i)，
[0090]
xaa28为天冬氨酸(asp，d)、天冬酰胺(asn，n)，或丙氨酸(ala，a)，
[0091]
xaa29为甘氨酸(gly，g)或组氨酸(his，h)，
[0092]
xaa30为甘氨酸(gly，g)或组氨酸(his，h)
[0093]
xaa35为丙氨酸(ala，a)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0094]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)、赖氨酸(lys，k)，或酪氨酸(tyr，y)，
[0095]
xaa41为赖氨酸(lys，k)，或不存在。
[0096]
这种肽的示例性种类可以包括选自由序列号14、15、16、20、36、37、38和40组成的组中的任一个氨基酸序列。
[0097]
根据另一个实施方式，在所述通式2中，
[0098]
xaa1为酪氨酸(tyr，y)，
[0099]
xaa12为异亮氨酸(ile，i)，
[0100]
xaa13为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0101]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0102]
xaa16为赖氨酸(lys，k)，
[0103]
xaa17为谷氨酰胺(gln，q)，
[0104]
xaa18为丙氨酸(ala，a)，
[0105]
xaa19为丙氨酸(ala，a)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0106]
xaa20为精氨酸(arg，r)、aib，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0107]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)或丙氨酸(ala，a)，
[0108]
xaa24为谷氨酰胺(gln，q)或天冬酰胺(asn，n)，
[0109]
xaa27为亮氨酸(leu，l)或异亮氨酸(ile，i)，
[0110]
xaa28为丙氨酸(ala，a)，
[0111]
xaa29为甘氨酸(gly，g)，
[0112]
xaa30为甘氨酸(gly，g)，
[0113]
xaa35为丙氨酸(ala，a)，
[0114]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)，
[0115]
xaa41可能不存在。
[0116]
这种肽的示例性种类可以包括选自由序列号20、36和40组成的组的任一个氨基酸序列。根据另一个实施方式，在所述通式1中，
[0117]
r1可以不存在，
[0118]
xaa1为酪氨酸(tyr，y)，
[0119]
xaa7为苏氨酸(thr，t)，
[0120]
xaa12为异亮氨酸(ile，i)，
[0121]
xaa13为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0122]
xaa14为亮氨酸(leu，l)，
[0123]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0124]
xaa16为赖氨酸(lys，k)，
[0125]
xaa17为谷氨酰胺(gln，q)，
[0126]
xaa18为丙氨酸(ala，a)，
[0127]
xaa19为谷氨酰胺(gln，q)，
[0128]
xaa20为精氨酸(arg，r)，或谷氨酰胺(gln，q)，
[0129]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)或丙氨酸(ala，a)，
[0130]
xaa23为缬氨酸(val，v)，
[0131]
xaa24为谷氨酰胺(gln，q)或天冬酰胺(asn，n)，
[0132]
xaa27为亮氨酸(leu，l)或异亮氨酸(ile，i)，
[0133]
xaa28为丙氨酸(ala，a)，
[0134]
xaa29为甘氨酸(gly，g)，
[0135]
xaa30为甘氨酸(gly，g)，
[0136]
xaa31为脯氨酸(pro，p)，
[0137]
xaa32为丝氨酸(ser，s)，
[0138]
xaa33为丝氨酸(ser，s)，
[0139]
xaa34为甘氨酸(gly，g)，
[0140]
xaa35为丙氨酸(ala，a)，
[0141]
xaa36为脯氨酸(pro，p)，
[0142]
xaa37为脯氨酸(pro，p)，
[0143]
xaa38为脯氨酸(pro，p)，
[0144]
xaa39为丝氨酸(ser，s)，
[0145]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)，
[0146]
xaa41至xaa43可以不存在。
[0147]
根据另一个实施方式，所述肽可以包括选自由序列号1至44组成的组中的任一个氨基酸序列。并且，所述肽可以基本上由选自由序列号1至44组成的组的任一个氨基酸序列组成，或者可以由选自由序列号1至44组成的组的任一个氨基酸序列组成。
[0148]
根据另一个实施方式，所述肽可以包括选自由序列号14、15、16、20、36、37、38和40组成的组的任一个氨基酸序列。并且，所述肽可以基本上由选自由序列号14、15、16、20、36、37、38和40组成的组中的任一个氨基酸序列组成，或者可以由选自由序列号14、15、16、20、36、37、38和40组成的组的任一个氨基酸序列组成。
[0149]
根据另一个实施方式，所述肽可以包括选自由序列号20、36和40组成的组中的任一个氨基酸序列。并且，所述肽可以基本上由选自由序列号20、36和40组成的组中的任一个氨基酸序列组成，或者可以由选自由序列号20、36和40组成的组中的任一个氨基酸序列组成。
[0150]
即使本技术中记载“由特定序列号组成的肽”，只要具有与由该序列号的氨基酸序列组成的肽相同或相应的活性，并不排除在该序列号的氨基酸序列前后无意义的序列附加、可能自然发生的突变，或者其沉默突变(silent mutation)，反而，在具有这种序列附加或突变的情况下也显而易见地属于本发明的范围内。即，即使存在部分序列上的区别，只要表现出一定水平或更高的序列同一性且对glp-1受体和gip受体的活性，可以属于本发明的范围。例如，所述肽可以包括但不限于与序列号1至44的氨基酸序列具有40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％或更高的同一性的氨基酸序列。
[0151]“同源性(homology)”或“同一性(identity)”是指与两个所给的氨基酸序列或碱基序列相关的程度，可以使用百分比表示。任意的两个氨基酸序列是否具有同源性、类似性或同一性是可以由如“pasta”程序的公知计算机算法使用如pearson等(1988)[proc.natl.acad.sci.usa 85]：2444所述的沉默参数确定。或者，可以使用由如emboss软件包的尼德曼(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件,the european molecular biology open software suite,rice等，2000，trends genet.16：276至277)(版本5.0.0或其后续版本)执行的尼德曼-翁施(needleman-wunsch)算法(needleman and wunsch,1970，j.mol.biol.48：443-453)确定的(包括gcg程序软件包(devereux,j.,等，nucleic acids research 12：387(1984))，blastp，blastn，fasta(atschul，[s.][f.,][等，j molec bio 215]：403(1990)；guide to huge computers，martin j.bishop，[ed.,]academic press，圣地亚哥，1994，以及[carillo eta/.](1988)stam j applied math 48：1073)。例如，可以使用国立生物工学信息数据中心的blast或clustalw来确定同源性、类似性或同一性。
[0152]
肽的同源性、类似性或同一性是例如可以根据由smith and waterman,adv.appl.math(1981)2：482公知，例如使用诸如needleman等(1970)，j mol biol.48：443等gap计算机程序来对序列信息进行比较来确定的。总之，gap程序将肽的同源性、类似性或同一性定义为以两个序列中较短序列中的符号总数除以类似排列的符号(即，氨基酸)的数而获得的值。如(1)二进制比较矩阵(为了同一性包括1，为了非同一性包括0)以及schwartz and dayhoff,eds.,atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,pp.353-358(1979)所公开，用于gap程序的默认参数可以包括
gribskov等(1986)nucl.acids res.14:6745的加权的比较矩阵(或者ednafull(ncbi nuc 4.4的emboss版本)取代矩阵)；(2)用于各gap的3.0的害处和在各gap中用于各符号的附加的0.10害处(或gap开放害处10，gap拖延害处0.5)；以及(3)用于末端gap的无害处。因此，如本文中所述的，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性(relevance)。
[0153]
根据上述的实施方式中任一个的肽可以包括分子内桥(intramolecular bridge)，具体可以具有包括环的形式。所述分子内桥例如可以是共价键桥或非共价键桥。
[0154]
在根据上述的实施方式中任一个的肽中，肽序列中从n端起第十二个氨基酸与第十六个氨基酸或第十六个氨基酸与第二十个氨基酸可以互相成环，但不限于此。
[0155]
在根据上述的实施方式中任一个的肽中，xaa12与xaa16或xaa16与xaa20可以互相成环，但所述肽的结构不限于此。例如，由序列号1、12、以及13表示的肽可以具有xaa12与xaa16互相成环的形式。根据另一个例子，由序列号2至11、15，以及22至25表示的肽可以具有xaa16与xaa20互相成环的形式。
[0156]
所述环的非限制性例子可以包括内酰胺桥(或内酰胺环)。这种环可以形成于所述肽内的氨基酸侧链之间，例如可以包括赖氨酸的侧链与谷氨酸的侧链之间形成有内酰胺环的形式，但不限于此。
[0157]
根据一个实施方式，可以通过组合用于制备各种肽的各种方法来制备根据一方面的肽，其包括通式1的氨基酸序列。
[0158]
根据一方面的肽是可以根据其长度通过本领域公知的方法，例如自动肽合成器合成的，也是可以通过基因工程技术产生的。具体地，可以根据标准合成方法、重组表达系统，或属于本领域的任意其他方法来制备所述肽。因此，根据一方面的肽例如可以通过包括以下步骤的多个方法合成，但不限于此。
[0159]
(a)用固相或液相方法的手段逐渐地或通过片段组装合成对肽进行合成，并对最终肽产物进行分离和纯化的方法；或
[0160]
(b)在宿主细胞中表达用于编码肽的核酸构建体并从宿主细胞培养物中回收表达产物的方法；或
[0161]
(c)对编码肽的核酸构建体进行无细胞体外表达，并回收表达产物；或
[0162]
通过(a)、(b)和(c)的任意组合获得所述肽的片段，接着连接片段来获得肽，并回收所述肽。
[0163]
并且，制备所述肽包括：使用l-型或d-型氨基酸和/或非天然氨基酸的修饰；和/或对天然氨基酸的序列进行改性，例如，侧链官能团的修饰或通过分子内共价键的修饰，例如，侧链间成环、甲基化、酰化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化等。并且，所述修饰还包括使用非天然化合物的取代。
[0164]
对于用于所述修饰的被取代或附加的氨基酸而言，不但可以使用在人蛋白质中通常观察到的20个氨基酸，而且还可以使用非典型或非自然产生的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可以包括但不限于西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)、chempep和genzyme pharmaceuticals。例如，aib(氨基异丁酸，aminoisobutyric acid)可以通过在丙酮中的streker氨基酸合成来制备，但不限于此。这种包括非典型或非自然产生氨基酸的肽和典型的氨基酸序列可以通过商业化的肽合成商，例如美国的american peptide company或bachem，或韩国的anygen合成并购买，但不限于此。
yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate,tbtu)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺)-1,1,3,3,-四甲基脲四氟磷酸盐(2-(5-norbonane-2,3-dicarboxyimide)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate,tntu)、o-(n-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(o-(n-succimidyl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium tetrafluoroborate,tstu)，并且，碳二亚胺的例子包括n,n'-二环己基碳化二亚胺(n,n'-dicyclohexylcarbodiimide,dcc)、n,n'-二异丙基碳二亚胺(n,n'diisopropylcarbodiimide,dipcdi)、n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(n-ethyl-n'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,edci
·
hcl)等。为了使用这些三膦盐的缩合，优选添加外消旋抑制剂[例如，n-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酰亚胺(honb)、1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(hoobt)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(oxyma)等]。用于缩合的溶剂可以从有用于肽缩合反应的公知的溶剂中适当地选择。例如，可以使用无水含水的n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮等酰胺、二氯甲烷、氯仿等卤化烃、三氟乙醇、苯酚等醇类、二甲基亚砜等亚砜、吡啶等叔胺、二恶烷、四氢呋喃等醚类、诸如乙腈、丙腈等腈类、乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类，其适当的混合物等。反应温度可以从已知为可用于肽键反应的范围中适当地选择，通常可以从约-20℃至90℃的范围选择。激活的氨基酸衍生物的使用量通常可以超过1.5倍至6倍。在固相合成中，当使用茚三酮反应的试验表明缩合不充分时，可以通过重复缩合反应而不除去保护基来执行充分的缩合。当重复反应后缩合仍不充分时，可以使用酸酐、乙酰咪唑等对未反应的氨基酸进行乙酰化，从而可以避免对后续反应的影响。
[0174]
对起始氨基酸的氨基的保护基示例包括苄氧羰基(z)、叔丁氧羰基(boc)、叔戊氧基碳、异冰片氧羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-氯苄氧基羰基(cl-z)、2-溴苄氧基羰基(br-z)、金刚烷氧羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰、甲酰基、2-硝基苯硫基、二苯基硫代膦酰基、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、三苯甲基等。
[0175]
对起始氨基酸的羧基保护基的例子，除了在上文中提及的c
1-6
烷基、c
3-10
环烷基、c
7-14
芳烷基之外，还包括芳基、2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯酰基以及苄氧基羰基酰肼、叔丁氧基羰基酰肼、三苯甲酰肼等。
[0176]
丝氨酸或苏氨酸的羟基例如可以通过酯化或醚化来保护。适于酯化的基团的例子包括诸如乙酰基的低级(c2-4)烷酰基、诸如苯甲酰基的芳酰基，以及源自有机酸等的基团。另外，适于醚化的基团的例子包括苄基、四氢吡喃基、叔丁基(but)、三苯甲基(trt)等。
[0177]
对酪氨酸的酚羟基的保护基的例子包括bzl、2,6-二氯苄基、2-硝基苄基、br-z、叔丁基等。
[0178]
对组氨酸的咪唑的保护基的例子包括对家苯磺酰基(tos)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(mtr)、二硝基苯(dnp)、苄氧甲基(bom)、叔丁氧基甲基(bum)、boc、trt、fmoc等。
[0179]
对精氨酸的胍基的保护基的例子包括tos、z、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(mtr)、对甲氧基苯磺酰基(mbs)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(pmc)、均三甲苯-2-磺酰基(mts)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)、boc、z、no2等。
[0180]
对赖氨酸的侧链氨基酸的保护基的例子包括z、cl-z、三氟乙酰基、boc、fmoc、trt、mtr、4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基(dde)等。
[0181]
对色氨酸的吲哚基的保护基的例子包括甲酰基(for)、z、boc、mts、mtr等。
[0182]
对天冬酰胺和谷氨酰胺的保护基的例子包括trt、黄嘌呤(xan)、4,4'-二甲氧基二苯甲基(mbh)、2,4,6-三甲氧基苄基(tmob)等。
[0183]
在起始材料中的激活的羧基的例子包括相应的酸酐、叠氮化物、活性酯[带醇酯(例如，五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰甲醇、对硝基苯酚、honb、n-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat))]等。起始材料中活性氨基的例子包括相应的磷酰胺。
[0184]
除去保护基的方法的例子包括：在诸如钯黑(pd-black)或钯碳(pa-carbon)的催化剂存在下的氢流中的催化还原；使用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸(tfa)、三甲基甲硅烷及溴化物(tmsbr)、三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯、四氟硼酸、三(三氟)硼酸、三溴化硼，或使用其混合物溶液的酸处理；使用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的碱处理；以及在液氨中使用纳的还原等。通过上述的酸处理的除去反应通常在-20℃至40℃的温度下执行；酸处理通过苯甲醚、苯酚、硫代苯甲醚、间甲酚和对甲酚；二甲基硫醚、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷等等阴离子清除剂(cation scavenger)有效地执行。并且，用作组氨酸的咪唑的保护基的2,4-二硝基苯基通过苯硫酚除去；并且，用作色氨酸的吲哚的保护基的甲酰基不仅通过在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇等的存在下的酸处理的去保护基被除去，而且还通过使用稀释的氢氧化钠、稀释的氨等的碱处理的去保护基被除去。
[0185]
不该参与起始材料与保护基之间的反应的官能团的保护、除去保护基、参与反应的官能团的激活等可以从公知的保护基和公知的手段适当地选择。
[0186]
对于本说明书中提及的肽，根据常规的肽标记，左侧端部为n端(氨基端)，右侧端部为c端(羧基端)。肽的c端可以是胺(-conh2)、羧基(-cooh)、羧酸盐(-coo-)、烷基酰胺(-conhr'，在此，r'为烷基)，以及酯(-coor'，在此，r'为烷基或芳基)中的任一个。
[0187]
在制备肽的酰胺的方法中，其通过为了酰胺合成使用树脂的固相合成形成，或者，羧基端氨基酸的α-羧基被酰胺化，肽链向氨基侧延伸至所述的长度。然后，制备其中仅除去对肽链的n端α氨基酸的保护基的肽和其中仅对c端羧基的保护基被从肽链中除去的肽，所述两种肽在上述的混合溶剂中被缩合。对于缩合反应的细节，应用如上所述的内容。在通过缩合获得的所保护的肽被纯化后，所有保护基根据上述的方法删除，由此可以获得所需的肽。通过使用用于主要馏分和冻结干燥的各种公知的手段来纯化所述肽，能够制备所述肽的所需的酰胺。
[0188]
根据一个实施方式，所述肽可以具有其溶剂合物的形式。“溶剂合物”是指所述肽或其盐与溶剂分子形成复合物。
[0189]
另一方面提供多核苷酸，其编码所述glp-1/gip双重激动剂。
[0190]
所述glp-1/gip双重激动剂如上所述。
[0191]
所述多核苷酸可以是经分离的多核苷酸。
[0192]
所述多核苷酸包括编码靶蛋白的dna和rna。
[0193]
所述多核苷酸可以被修饰。所述修改包括核苷酸的附加、删除，或非保守性取代，或保守性取代。
[0194]
所述多核苷酸可以由与相应序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列组
成。
[0195]
另一方面提供载体，其包括所述多核苷酸。
[0196]
术语“载体(vector)”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段。例如，包括病毒载体，如质粒载体、粘粒载体、噬菌体(bacterioiphage)载体、腺病毒(adenovirus)载体、逆转录(retrovirus)载体以及腺病毒相关病毒载体。能够用作所述重组载体的载体可以是通过操作本领域常用的质体(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列、puc19以及p426gpd等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-charon、λδz1以及m13等)或病毒(例如，cmv、sv40等)来制备的，但不限于此。由于质体是目前最常用的载体形式，在本说明书中，“质体(plasmid)”和“载体(vector)”时而互换使用。
[0197]
在所述重组载体中，编码glp-1/gip双重激动剂的多核苷酸可以被可操作地连接至启动子。术语“可操作地连接”是指启动和介导用于编码靶蛋白的启动子的序列功能性连接至所述多核苷酸序列。
[0198]
所述重组载体通常可以被构建为用于克隆的载体或表达载体。作为所述表达载体，可以使用用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白质的本领域常规的载体。可以通过本领域公知的各种方法构建所述重组载体。
[0199]
可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主来构建所述重组载体。例如，在所使用的载体为表达载体且原核细胞作为宿主的情况下，通常使用能够执行转录的强力的启动子(例如，plλ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)，用于开始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译结束序列。在真核细胞作为细胞的情况下，在包括于载体中的真核细胞中作动的复制起点包括f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺的复制起点、aav复制起点、cmv复制起点和bbv复制起点等，但不限于此。并且，还可以使用衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子和hsv的tk启动子)，通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
[0200]
另一方面，提供宿主细胞，其包括所述多核苷酸或载体。
[0201]
所述宿主细胞可以是经分离的细胞。
[0202]
作为能够使用重组载体转化的宿主细胞，通常使用dna导入效率和所引入的dna表达效率高的宿主。例如，可以使用诸如大肠杆菌、假单胞菌属、杆菌、链霉菌、真菌、酵母的公知的真核宿主和原核宿主、诸如草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda,sf9)的昆虫细胞、以及诸如cho、cos1、cos7、bsc1、bsc40、bmt10的动物细胞，但不限于此。
[0203]
为了将多核苷酸或包括其的重组载体插入宿主细胞之内，可以使用本领域公知的方法。作为所述运载方法的例子，在宿主细胞为原核细胞的情况下，可以使用氯化钙(cacl2)或电穿孔法等，在宿主细胞为真核细胞的情况下，可以使用微量注射方法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染发以及基因轰击等，但不限于此。
[0204]
所述多核苷酸可以以为了表达盒(expression cassette)即包括为了自我表达所需的所有因素的基因构建体的形式引入宿主细胞。所述表达盒通常可以包括可操作地连接至所述多核苷酸的启动子(promotor)、转录终止信号、脂质体结合部位，以及翻译终止信号。所述表达盒可以具有能够执行自我复制的表达载体形式。并且，所述多核苷酸可以以其
固有的形式引入宿主细胞且可操作地连接至宿主细胞中的为了表达所需的序列，但不限于此。
[0205]
另一方面提供一种缀合物，其中所述glp-1/gip双重激动剂与增加体内半衰期的生物相容性物质互相结合。
[0206]
所述glp-1/gip双重激动剂如上所述。
[0207]
所述生物相容性物质可以与载体媒介物(carrier)互换使用。
[0208]
所述缀合物可以是经分离的缀合物。
[0209]
所述缀合物可以显示等于或高于天然配体(即，天然glp-1和天然gip)的活性，同时，与不结合有载体的天然型配体或其衍生物相比，可以表现增加的效力的持续性。因此，所述缀合物可以是长效缀合物。术语“长效缀合物”是指与未结合生物相容性物质的天然型gip或gip衍生物相比具有增加的效力持续性的缀合物。因此，所述缀合物可以与“长效glp-1/gip双重激动剂缀合物”、“长效glp-1/gip双重激动剂”、“长效glp-1/gip缀合物”、“双重激动剂的长效缀合物”、“双重激动剂缀合物”、“长效缀合物”、“缀合物”互换使用。这种缀合物不仅包括如上所述的形式，也包括装入生物降解性纳米粒中的形式等。
[0210]
所述缀合物可以是非自然产生(non-naturally occurring)的。
[0211]
所述生物相容材料可以与所述胰高血糖素/glp-1/gip双重激动剂通过共价化学键或非共价化学键互相结合的，也可以通过共价化学键、非共价化学键或其组合通过接头(linker，l)互相结合。glp-1/gip双重激动剂内的一个或更多氨基酸侧链可以接合至这种生物相容性物质以在体内增加可溶性和/或半衰期且/或增加生物实用性。这种修饰也可以降低治疗学蛋白和肽的消除(clearance)。所述生物相容性物质可以是水溶性(两亲性或亲水性)和/或无毒性和/或药学上可接受的。
[0212]
所述生物相容性物质可以选自由高分子聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白缀合物、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、fcrn结合物质、生物内结合组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白(transferrin)、糖类(saccharide)、肝素，以及弹性蛋白组成的组中，但不限于此。
[0213]
作为所述高分子聚合物的例子，可以例举聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多醇、聚乙烯醇、多糖类、聚乙烯乙基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸，寡核苷酸以及其组合组成的组的高分子聚合物，且可以包括葡聚糖作为所述多糖类，单不限于此。
[0214]
所述聚乙二醇是包括乙二醇均聚物、peg共聚物，或单甲基取代的peg聚合物(mpeg)的形式的术语，但不限于此。
[0215]
所述脂肪酸可以与体内的白蛋白具有结合力，但不限于此。
[0216]
所述生物相容性物质包括聚赖氨酸、聚天冬氨酸以及聚谷氨酸等氨基酸，但不限于此。
[0217]
对于所述弹性蛋白，可以使用作为水溶性前驱体的人元弹性蛋白(tropoelastin)，并且可以使用其中一些序列或一些重复单元的聚合物。例如，可以包括所有弹性蛋白样多肽，但不是特别限于此。
[0218]
根据一个实施方式，所述生物相容性物质可以是fcrn结合物质。具体地，所述fcrn结合物质可以是免疫球蛋白fc区域，更具体地可以是igg fc区域，更加具体地可以是非糖
基化的igg4 fc区域，但不限于此。
[0219]“免疫球蛋白fc区域”是指除外免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的部位，即包括重链恒定区(ch2)和/或重链恒定区3(ch3)部分的部位。所述免疫球蛋白fc区域可以是形成根据一方面的缀合物的一部分的构成。
[0220]
所述免疫球蛋白fc区域可以在重链恒定区包括铰链(hinge)部分，但不限于此。
[0221]
根据一个实施方式，免疫球蛋白fc区域可以在n末端处包括特定铰链序列。
[0222]
术语“铰链序列”是指位于重链中且通过链间双硫键(inter sulfide bond)来形成免疫球蛋白fc片段的二聚体的部位。
[0223]
在一个实施方式中，所述铰链序列可以被突变使得具有以下氨基酸序列的铰链序列中的一部分被删除以仅留下一个半胱氨酸残基，但不限于此：
[0224]
glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser-cys-pro(序列号45)。
[0225]
所述铰链序列可以包括由于序列号45的铰链序列中第8个或第11个半胱氨酸残基被删除而只保留一个半胱氨酸残基的示例。根据一个实施方式的铰链序列可以由包括仅一个半胱氨酸残疾的3个至12个氨基酸组成，但不限于此。更具体地，根据一个实施方式的铰链序列可以具有如下的序列：glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-pro-ser-cys-pro(序列号6)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser-pro(序列号47)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser(序列号48)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-pro(序列号49)、lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser(序列号50)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys(序列号51)、glu-lys-tyr-gly-pro-pro-cys(序列号52)、glu-ser-pro-ser-cys-pro(序列号53)、glu-pro-ser-cys-pro(序列号54)、pro-ser-cys-pro(序列号55)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-ser-cys-pro(序列号56)、lys-tyr-gly-pro-pro-pro-ser-cys-pro(序列号57)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-ser-cys-pro(序列号58)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys(序列号59)、lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro(序列号60)、glu-ser-lys-pro-ser-cys-pro(序列号61)、glu-ser-pro-ser-cys-pro(序列号62)、glu-pro-ser-cys(序列号63)、ser-cys-pro(序列号64)。
[0226]
更具体地，所述铰链序列可以包括序列号55(pro-ser-cys-pro)或序列号65(ser-cys-pro)的氨基酸序列，但不限于此。
[0227]
根据一个实施方式的免疫球蛋白fc区域可以具有其中免疫球蛋白fc链的两个分子由于铰链序列的存在而形成二聚体的形式。并且，根据一个实施方式的化学式1的缀合物可以具有接头的一端连接至二聚体的免疫球蛋白fc区域的一条链的形式，但不限于此。
[0228]
术语“n端”是指蛋白或多肽的氨基端，可以包括氨基酸的最末端，或者可以包括从最末端起一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个，或十个或更多氨基酸。本发明的免疫球蛋白fc片段可以在n端处包括铰链序列，但不限于此。
[0229]
并且，只要具有与天然型具有实质上相同或更改善的效果，所述免疫球蛋白fc区域可以是包括一部分或整个重连恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区1(cl1)的扩展的fc区域，而排除免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区。并且，所述免疫球蛋白fc也可以是其中相当于ch2和/或ch3的相当长的一部分氨基酸序列被删除的区域。
[0230]
例如，所述免疫球蛋白fc区域可以选自由(a)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域以及ch4结构域；(b)ch1结构域和ch2结构域；(c)ch1结构域和ch3结构域；(d)ch2结构域和ch3
结构域；(e)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域中一个或两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区中一部分的组合；以及(f)重链恒定区中各结构域和轻链恒定区的二聚体组成的组中，但不限于此。
[0231]
所述免疫球蛋白fc形式可以具有二聚体(dimeric form)形式，glp-1/gip双重激动剂的一个分子可以以共价键方式连接至具有二聚体形式的一个fc区域，此时，所述免疫球蛋白fc与glp-1/gip双重激动剂可以由非肽聚合物互相连接。另外，glp-1/gip双重激动剂的两个分子可以对称地结合至二聚体形式的一个fc区域。此时，所述免疫球蛋白fc和glp-1/gip双重激动剂可以由非肽接头互相连接。但不限于上述的例子。
[0232]
并且，所述免疫球蛋白fc区域不但包括天然氨基酸序列，而且还包括其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指天然氨基酸序列中一个或更多氨基酸残基由于删除、插入、非保守性取代或保守性取代或其组合而具有不同序列。
[0233]
例如，对于igg fc而言，已知为为结合很重要的第214至238、297至299、318至322或327至331个氨基酸残基可以用作适用于修饰的部位。并且，可以通过删除能够形成二硫键的部位、向天然型fc的n端附加蛋氨酸残基等获得各种衍生物。并且，为了消除效应器功能，可以除去补体结合部位，例如c1q结合部位，也可以除去抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位。制备这种免疫球蛋白fc区域的序列衍生物的技术是由国际专利公开第wo97/34631号、国际专利公开第96-32478号公开的。
[0234]
在不整体上改变分子活性的蛋白和肽中的氨基酸取代是本领域公知的(h.neurath,r.l.hill,the proteins,academic press,new york,1979)。最常规的交换为氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、asp/gly之间的交换。在一些情况下，可以通过磷酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、丙烯酸化(acrylation)、糖基化(glycosylation)、甲基化(methylation)、法尼基化(farnesylation)、乙酰化(acetylation)和酰胺化(amidation)等修饰(modification)。
[0235]
在上文中描述的fc衍生物可以表现出与所述fc区域相同的生物学活性且可以是增加fc区域对热、ph等的结构稳定性的。
[0236]
并且，这种fc区域可以是从人、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠或豚鼠等动物的体内分离的天然型获得的，也可以是从转化的动物细胞或微生物或的重组形式或其衍生物。在此，从天然型获得的方法可以是从人或动物的活体分离整个免疫球蛋白，并进行蛋白降解酶处理来获得的方法。在进行木瓜蛋白酶处理时，被切割成fab和fc，当进行胃蛋白酶处理时，被切割成pf'c和f(ab)2。可以通过使用尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatograpy)从此分离fc或pf'c。根据更加具体的实施方式，免疫球蛋白fc区域为从微生物中源自人的fc区域的重组免疫球蛋白fc区域。
[0237]
并且，免疫球蛋白fc区域可以是天然型糖链、其糖链相比于天然糖链增加的形式、其糖链相比于天然糖链减少的形式，或其中除去糖链的形式。化学方法、酶学方法和使用微生物的遗传工学方法等的常规方法可以用于增减或除去这种免疫球蛋白fc糖链。在此，从fc去糖基化的免疫球蛋白fc区与补体(c1q)的结合力显著降低，其抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性也被降低或消除，因此不会在体内诱发不需要的免疫反应。在这方面，
acid,pla)和聚乳乙醇酸(polylactic-glycolic acid,plga)的生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳类、透明质酸、寡核苷酸和其组合组成的组。所述多糖类可以是葡聚糖，但不限于此。
[0249]
根据更加具体的实施方式，所述非肽聚合物可以是聚乙烯醇，但不限于此。因此，所述接头可以含有乙二醇重复单元。并且，本发明的范围还包括本领域公知的其衍生物和能够以本领域技术水平容易制备的衍生物。
[0250]
只要是对体内蛋白分解酶具有抗性的聚合物，可以非限制性地用作所述非肽接头。非肽聚合物的化学式量可以为1至1,000kda范围，具体为1至100kda范围，更具体地为1至20kda范围，但不限于此。并且，所述非肽接头可以采用各种不同种类的聚合物的组合，而不是仅使用一个种类的聚合物。根据一个实施方式，所述乙二醇重复单元部分的化学式量可以为1至100kda范围，更具体地，可以为1至20kda范围内。
[0251]
根据一个实施方式，所述非肽接头的两端分别可以结合至生物相容性物质，例如，免疫球蛋白fc区域的胺基或巯基，以及glp-1/gip三重激动剂的胺基或巯基。
[0252]
具体地，所述非肽聚合物可以在其两侧端分别包括能够与生物相容性物质(例如，免疫球蛋白fc区域)和glp-1/gip三重激动剂结合的反应基团，具体地，能够与位于glp-1/gip三重激动剂或生物相容性物质(例如，免疫球蛋白fc区域)的n端或赖氨酸处的氨基或半胱氨酸的巯基结合的反应基团，但不限于此。
[0253]
并且，能够与诸如免疫球蛋白fc区域和glp-1/gip三重激动剂的生物相容性物质结合的所述非肽聚合物的反应基团可以选自由醛基、马来酰亚胺基团，以及琥珀酰亚胺衍生物组成的组，但不限于此。在上文中，可以例举丙醛基或丁醛基作为醛基的例子，但不限于此。在上文中、琥珀酰亚胺戊酸脂、琥珀酰亚胺甲基丁酸脂、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸脂、琥珀酰亚胺丙酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺羧甲基或琥珀酰亚胺碳酸脂作为琥珀酰亚胺衍生物，但不限于此。
[0254]
并且，通过由于醛键的还原性烷基化生成的最终产物比通过酰胺键连接的稳定得多。醛反应基团在低ph下选择性地在n端反应，在诸如ph9.0得高ph条件下可以与赖氨酸残基形成共价键。
[0255]
并且，所述非肽接头的两侧端的法英集团可以彼此相同或不同，例如，一侧端可以具有马来酰亚胺基，另一侧端可以具有醛基、丙醛基，或丁醛基。然而，生物相容性物质，具体地，免疫球蛋白fc区域和glp-1/gip双重激动剂可以与非肽接头的各端，不限于此。例如，所述非肽接头的一侧端可以包括马来酰亚胺基团作为反应基团，另一侧端可以具有醛基、丙醛基或丁醛基等。
[0256]
当使用在两侧端具有羟反应基团的聚乙二醇作为非肽聚合物时，可以通过公知的化学反应用所述各种反应基团激活所述羟基，或者可以使用市售的具有经修饰的反应基团的聚乙二醇来制备所述长效缀合物。
[0257]
根据一个实施方式，所述非肽聚合物可以连接至glp-1/gip三重激动剂的半胱氨酸残基，更具体地，半胱氨酸的-sh基团，但不限于此。
[0258]
在使用马来酰亚胺-peg-醛的情况下，马来酰亚胺基团通过硫醛(thioether)键与胰高血糖素/glp-1/gip三重激动剂的-sh基团连接，醛基可以通过还原性烷基化反应与生物相容性，具体地，免疫球蛋白fc的-nh2基团连接，但不限于此，这仅是一个示例。
[0259]
并且，在所述缀合物中，非肽聚合物的反映其短可以与位于免疫球蛋白fc区域的n端的-nh2连接，但这仅是一个示例。
[0260]
因此，所述根据一方面的缀合物可以由以下化学式1表示：
[0261]
[化学式1]
[0262]
x-l-f
[0263]
只是，在此，x为glp-1/gip双重激动剂，
[0264]
l为接头；
[0265]
f为增加x的体内半衰期的生物相容性物质，
[0266]-表示x与l之间、l与f之间的结合链接。
[0267]
在所述化学式1中，glp-1/gip双重激动剂、接头、以及生物相容性物质如上所述。
[0268]
在所述化学式1中，l可以为la，其中，a为0或自然数。然而，在a为2或更大的情况下，各l可以是彼此独立的。
[0269]
具体地，所述接头可以是由以下化学式2表示的聚乙二醇(peg)，但不限于此。
[0270]
[化学式2]
[0271][0272]
在此，n＝10至2400，n＝10至480，或n＝50至250，但不限于此。
[0273]
在所述长效缀合物中，peg部分不仅包括-(ch2ch2o)n-结构，而且还可以包括位于连接因素与所述-(ch2ch2o)n-之间的氧原子，但不限于此。
[0274]
所述聚乙二醇是包括乙二醇均聚物、peg共聚物，或单甲基取代的peg聚合物(mpeg)的形式的术语，但不限于此。
[0275]
根据一个实施方式，所述-可以表示x与l之间、l与f之间的共价键链接。
[0276]
所述glp-1/gip双重激动剂或其长效缀合物在正常小鼠中具有血糖调节能力，且在糖尿模型大鼠中表现处血糖减少功效和胰岛素抵抗改善效果，因此用于预防或治疗糖尿病。
[0277]
另一方面提供一种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐或其溶剂合物，或所述缀合物。
[0278]
所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐或其溶剂合物，或所述缀合物如上所述。
[0279]
术语“预防”是指通过施用所述组合物抑制或推迟发病的所有行为。
[0280]
术语“治疗”是指通过施用所述组合物使疾病的症状好转或变得有利的所有行为。
[0281]
所述“糖尿病(diabetes mellitus)”是一种胰岛素分泌量不够或无法实行正常功能的代谢疾病，其特征在于血中葡萄糖浓度的增加即高血糖症，由于高血糖症引起各种症状和证候，并且通过尿液排出葡萄糖。糖尿病分为一型糖尿病和二型糖尿病，其中，一型糖尿病以前被称为“儿童糖尿病”，是一种因根本无法产生胰岛素而发生的疾病。相对缺乏胰岛素的二型糖尿病的特征在于胰岛素抗性(insulin resistance；由于降低血糖的胰岛素功能的降低，细胞无法有效地燃烧葡萄糖)。通常，二型糖尿病被认为受到环境因素的影响，例如随着饮食生活的西方化引起的高热量、高脂肪、高蛋白饮食、缺乏运动、压力等，但是，除此之外，特定基因的缺陷也可能引起糖尿病，并且，胰脏手术、感染、药物也可能引起糖尿
病。
[0282]
根据一个实施方式，所述糖尿病可以是二型糖尿病。
[0283]
所述glp-1/gip双重激动剂或其长效缀合物在正常小鼠中表现出血糖调节能力，并且在糖尿模型大鼠中表现出血糖减少、糖化血红蛋白数值降低，以及胰岛素抗性改善功效，因此，除了糖尿病之外，还可以用于预防或治疗糖尿合并症，或与胰岛素抗性和糖尿病相关的其他疾病。
[0284]
因此，可选地，所述药物组合物可以是用于预防或治疗糖尿合并症的药物组合物。所述“糖尿合并症”是指高血糖状态持续较长期间而伴随的身体的各种病态症状，例如包括网膜病症、肾功能障碍、神经病、脑卒中、动脉硬化症、脑梗塞、脑血栓、心肌梗塞、高血压、肾脏、心脏疾病或糖尿病足部溃疡，以及心血关系疾病，但不限于此。在高血糖状态持续叫长期间，所述网膜病症、肾功能障碍、神经病、脑卒中、动脉硬化症、脑梗塞、脑血栓、心肌梗塞、高血压、肾脏、心脏疾病或糖尿病足部溃疡，以及心血关系疾病的风险，因此，为了预防这种合并症，有效的血糖管理是必不可少的。
[0285]
可选地，所述药物组合物可以是用于预防或治疗代谢综合征的药物组合物。所述代谢综合征可以是与胰岛素抗性和糖尿病相关的代谢综合征。所述代谢综合征可以包括与胰岛素抗性和糖尿病相关的血脂异常、肥胖，以及/或脂肪肝。
[0286]
所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体而言，在口服施用时可以混合使用结合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素以及香料等，作为注射剂可以混合施用缓冲剂、保护剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂以及稳定剂等，用于局部施用时可以使用基质、赋形剂、润滑剂和保护剂等。
[0287]
根据一个实施方式，所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。
[0288]
所述药物组合物的剂型是可以通过与如上所述的药学上可接受的载体混合制备成各种形式的。例如，在口服施用时，可以制备成片剂、锭剂、万能药、悬浮药、糖浆剂、糯米纸等形式，用作注射剂时，可以制备成单位剂量安瓿或多次给药形式。此外，还可以制备成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂和缓释制剂等。
[0289]
另一方面，适于制剂化的载体、赋形剂以及稀释剂的例子可以包括乳糖、葡聚糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢属、褐藻酸盐、明胶、磷酸钙、磷酸硅、纤维素、甲基纤维素，微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等。并且，所述药物组合物可以进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂，以及防腐剂等。
[0290]
所述药物组合物可以进一步包括用于治疗糖尿病、糖尿合并症，或代谢综合征的一个或更多其他制剂。所述制剂可以采用公知的物质。
[0291]
所述药物组合物的施用量和施用次数取决于需要治疗的疾病、施用路径、患者的年龄、性别和体重、疾病严重程度等各种相关因素和作为活性成份的药物的种类。
[0292]
由于所述药物组合物具有优异的体内持久性和效力，可以显著减少施用次数和频度。
[0293]
另一方面提供一种预防或治疗糖尿病的方法，其包括将有效量的所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物，或所述缀合物，或所述药物组合物施用于需要其的个体。
[0294]
可选地，所述方法可以是用于预防或治疗糖尿合并症的方法。
[0295]
可选地，所述方法可以是用于预防或治疗代谢综合征的方法。
[0296]
所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、所述缀合物、所述药物组合物、糖尿病、糖尿合并症，以及代谢综合征如上所述。
[0297]“有效量”或“药学有效量”是指其glp-1/gip上冲激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物，或其缀合物的量或容量，其在以单一容量或多次容量施用于患者时在诊断或治疗下提供患者所期望的效果。有效量可以是通过施用公知技术或观察在类似环境下获得的结果由作为相关技术领域的普通技术人员的主治医或诊断医容易确定的。在确定对患者的有效量时，由主治医或诊断医考虑多个因素考虑各种因素，其包括但不限于哺乳动物种类；其大小、年龄以及整体上的健康状态；所连累的具体的疾病或障碍；疾病或障碍的连累程度或严重程度；个别患者的反应；所施用的特定化合物；施用模式；所施用的制剂的生物实用性特征；所选择的给药疗法；同时药物处理使用；以及其他相关环境。
[0298]“个体”是指需要治疗疾病的对象，更加具体地，是指人或非人类的灵长类、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、毛、马和牛等哺乳类。
[0299]“施用”是指通过任何适当的方法将预设的物质导入患者中的方法。施用路径可以是可以用于到达患者体内靶的的任何通常的路径。所述施用例如可以是但不限于腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、经口施用、局部施用、鼻内施用，直长内施用。
[0300]
所述施用可以是将根据一个实施方式的组合物每天对各个体施用0.0001mg至1,000mg，例如，0.1mg至1,000mg、0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1,000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg，或1mg至25mg。只是，施用量是可以根据制剂化方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病状、饮食、施用时间、施用路径、排泄速度以及感应性等因素被不同地配方，本领域技术人员应当可以考虑这些因素来适当地调节施用量。施用次数可以是每天一次，或者在临床上可接受的副作用范围内的两次或更多次，对于施用部位，可以对一个部位或两个或更多部位进行施用，以每天或两天至五天间隔，总施用天数可以是每一次治疗时一天至30天。若需要，可以在合适时期之后重复相同的治疗。对除了人之外的其他动物，对每kg施用与人相同的施用量，或者，例如可以施用以对象动物和人的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等换算所述施用量的量。
[0301]
在所述方法中，有效量的所述glp-1/gip双重激动剂、药学上可接受的其盐、其溶剂合物，或其缀合物可以与有效量的一个或更多其他活性成份同时、分开地、或依次施用。所述一个或更多其他活性成份可以是用于治疗炎症性疾病或自我免疫疾病的一个或更多其他制剂，但不限于此。
[0302]
另一方面提供所述glp-1/gip双重激动剂、药学上可接受的其盐、其溶剂合物，或所述缀合物在用于制备用于预防或治疗的药物中的用途。
[0303]
可选地，所述用途可以是用于制备用于预防或治疗糖尿合并症的药物。
[0304]
可选地，所述用途可以是用于制备用于预防或治疗代谢综合征的药物。
[0305]
所述glp-1/gip双重激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、所述缀合物、所述药物组合物、糖尿病、糖尿合并症，以及代谢综合征如上所述。
[0306]
本技术中所公开的各项描述和实施方式也可以应用于各项其他描述和实施方式。
即，本技术中所公开的各种要素的所有组合属于本发明的范畴。并且，本发明的范畴不限于下面记载的具体描述内容。
[0307]
有益效果
[0308]
根据一方面的glp-1/gip双重激动剂或其长效缀合物具有增加的半衰期的同时表现出血糖调节、血糖降低、胰岛素抗性改善等效果，因此可以使用于预防或治疗糖尿病等的用途。
附图说明
[0309]
图1示出序列号20、36，以及40的双重激动剂-peg-免疫球蛋白fc区域缀合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析结果。
[0310]
图2a示出确认序列号20、36，以及40的长效缀合物在正常小鼠中的血糖调节功效的结果。
[0311]
图2b示出确认序列号20、36，以及40的长效缀合物在正常小鼠中血糖调节功效的结果。
[0312]
图3a示出确认序列号20的长效缀合物在二型糖尿病模型中的血糖降低效果的结果。
[0313]
图3b示出确认序列号20的长效缀合物在二型糖尿病模型中的糖化血红蛋白数值减小效果的结果。
[0314]
图4示出确认序列号20的长效缀合物在二型糖尿病模型中的胰岛素抗性改善功效的结果。
[0315]
最佳模式
[0316]
以下，通过实施例更加详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于本发明的示例性说明，本发明的范围并不限于这些实施例。
[0317]
实施例1：制备对glp-1受体和gip受体都具有活性的glp-1/gip双重激动剂
[0318]
制备对glp-1受体和gip受体都具有活性的glp-1/gip双重激动剂，并在以下表1中示出其序列。
[0319]
[表1]
[0320][0321][0322]
在所述表1中记载的序列中，用子下线表示的氨基酸是指用子下线表示的氨基酸彼此形成环。此外，用aib标记的氨基酸为属于非自然氨基酸的氨基异丁酸(aib；aminoisobutyric acid)。由nle标记的氨基酸是正亮氨酸(norleucine,nle；2-aminohexanoic acid)，是亮氨酸(leucine)的异构体。并且，
hp
y是指3-(4-羟基苯基)丙酸(3-(4-hydroproxyphenyl)propanoic acid，hp；phroletic acid)，肽的n端的酪氨酸(y)被3-(4-羟基苯基)丙酸取代以除去末端氨基。
[0323]
并且，
ca
h是指4-乙酸咪唑(4-imidazoleacetic acid)，肽的n端的组氨酸(h)被4-乙酸咪唑取代以除去末端氨基。
[0324]
另外，
ha
y是指2-(4-羟基苯基)乙酸(2-4-hydroxyphenyl acetic acid)或对羟基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid，ha)，肽的n段的酪氨酸(y)被2-(4-羟基苯基)乙酸取代以除去末端氨基。
[0325]
所述双重激动剂肽根据需要用作其c段被酰胺化的双重激动剂。
[0326]
实施例2：测定glp-1/gip双重激动剂的体外(in vitro)活性
[0327]
为了测定在所述实施例1中制备的glp-1/gip双重激动剂的活性，使用了通过施用glp-1受体和gip受体分别转化的细胞株在体外测定细胞活性的方法。所述细胞株是转化为在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,cho)中分别表达人gip-1和人gip受体基因，适于测定glp-1和gip的活性。因此，通过使用各转化细胞株测量了对各部分的活性。
[0328]
为了测量在所述实施例1中制备的双重激动剂的glp-1活性，将人glp-1从50nm以4倍连续稀释至0.000048nm，并将在所述实施例1中制备的双重激动剂从50nm以4倍连续稀释至0.000048nm。从其中所述经培养的人glp-受体表达的cho细胞除去培养液，将连续稀释的各种物质以各5μl添加至所述细胞，分别包括camp抗体的缓冲液，然后在室温下培养15分钟。然后，分别添加10μl的包括细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)的detection mix来裂解细胞，并在室温下进行反应90分钟。将所述反应结束的细胞裂解物应用于lance camp kit(perkinelmer，usa)来通过所积累的camp计算ec
50
值，并进行了互相比较。
[0329]
为了测量在所述实施例1中制备的双重激动剂的gip活性，将人gip从1nm以4倍连续稀释至0.00000095nm，并将所述实施例1中制备的双重激动剂从50nm以4倍连续稀释至0.000048nm。从其中所述经培养的人gip受体表达的cho细胞中除去培养液，将连续稀释的各种物质以5μl添加至所述细胞，分别添加5μl的包括camp抗体的缓冲液，然后在室温下培养15分钟。然后，分别添加10μl的包括细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)的detection mix来裂解细胞，并在室温下进行反应90分钟。将所述反应结束的细胞裂解物应用于lance camp kit(perkinelmer，usa)来通过所积累的camp计算ec50值，并进行了互相比较。
[0330]
在以下表2中示出相对于人glp-1的相对效力和相对于人gip的相对效力。
[0331]
[表2]
[0332][0333]
n/a是指在试验后没有获得活性。锁上所述，在实施例1中制备的新型双重激动剂对glp-1受体和gip受体具有活性。
[0334]
实施例3：制备双重激动剂的长效缀合物
[0335]
制备了一种长效缀合物，其包括在所述实施例1中制备的双重激动剂。具体地，将序列号20、36，和40的双重激动剂通过作为非肽聚合物的peg与免疫球蛋白fc区域连接。
[0336]
具体地，为了将mal-10k peg-ald(具有马来酰亚胺基(maleidmide)和丙醛基团(propionaldehyde)的10kda peg，nof，日本)聚乙二醇化为双重激动剂，添加异丙醇并进行反应1至2小时，所述反应的条件如下：在实施例1中制备的双重激动剂(序列号20、36和40)和peg的摩尔比为1：1至2，蛋白浓度为2mg/ml至5mg/ml，ph为6.5至7.5，温度为4℃至10℃。将所述反应液应用于sp sepharose high performance(ge healthcare life science,美国)以纯化单聚乙二醇化(mono-pegylated)双重激动剂。
[0337]
使所纯化的单聚乙二醇化双重激动剂与免疫球蛋白fc反应，所述反应的条件如下：摩尔比1：2至10、总蛋白浓度20mg/ml至50mg/ml、ph6.0至7.0、4℃至10、14小时至18小
时。此时，将异丙醇和作为还原剂的氰基硼氢化钠(nacnbh3)添加至反应液。
[0338]
将反应液供应给source 15q(ge healthcare life science,美国)柱以纯化缀合物，其中glp-ir/gipr双重激动剂分别由peg以共价键连接至免疫球蛋白fc。
[0339]
结果，通过se-hplc、rp-hplc分析确认所制备的序列号20的双重激动剂-peg-免疫球蛋白fc区域缀合物(以下称
‘
序列号20的长效缀合物’)、序列号36的双重激动剂-peg-免疫球蛋白fc区域缀合物(以下称
‘
序列号36的长效缀合物’)，以及序列号40的双重激动剂-peg-免疫球蛋白fc区域缀合物(以下称
‘
序列号40的长效缀合物’)制备成具有95％或更高的高纯度，sds-page分析结果如图1所示。
[0340]
实施例4：测定长效双重激动剂缀合物的体外(in vitro)活性
[0341]
为了测量在所述实施例3中制备的序列号20、36、40的长效性缀合物的活性，与所述实施例2相同，所使用的方法是使用glp-1受体和gip受体分别被转染的细胞株来测量体外细胞活性的方法。
[0342]
所述各细胞株被转化以在cho中分别表达人glp-1受体和人gip受体基因，与在实施例2中使用的细胞株相同。通过使用各转化细胞株测量了对各部分的活性。
[0343]
为了测量在所述实施例3中制备的序列号20、36，和40的长效性缀合物的glp-活性，将人glp-1从50nm以4倍连续稀释至0.000048nm，并将序列号20、36和40的长效缀合物从12.5nm以4倍连续稀释至0.000012nm。从其中所数据经培养的人glp-受体表达的cho细胞除去培养液，将连续稀释的各种物质以各5μl添加至所述细胞，分别包括camp抗体的缓冲液，然后在室温下培养15分钟。然后，分别添加10μl的包括细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)的detection mix来裂解细胞，并在室温下进行反应90分钟。将所述反应结束的细胞裂解物应用于lance camp kit(perkinelmer，美国)来通过所积累的camp计算ec
50
至，然后进行了互相比较。
[0344]
为了测量在所述实施例3中制备的序列号20、36和40的长效性缀合物的gip活性，将人gip从1nm以4倍连续稀释至0.00000095nm，并将序列号20、36和40的长效缀合物从12.5nm以4倍连续稀释至0.000012nm。从其中所述经培养的人gip受体表达的cho细胞中除去培养液，将连续稀释的各种物质以5μl添加至所述细胞，分别添加5μl的包括camp抗体的缓冲液，然后在室温下培养15分钟。然后，分别添加10μl的包括细胞裂解缓冲液(cell lysis buffer)的detection mix来裂解细胞，并在室温下进行反应90分钟。将所述反应结束的细胞裂解物应用于lance camp kit(perkinelmer，美国)来通过所积累的camp计算ec
50
至，然后进行了互相比较。
[0345]
在以下表3中示出相对于人glp-1的相对效力和相对于人gip的相对效力。
[0346]
[表3]
[0347][0348]
实施例5：确认长效双重激动剂缀合物在正常小鼠中的血糖调节功效(ipgtt)
[0349]
为了由于施用包括在所述实施例3中制备的序列号20、36和40的长效缀合物的组合物引起的体内(in vivo)，使用了正常雄性c57bl/6小鼠(orientbio，韩国)。
[0350]
使7周龄的小鼠适应环境约4天至6天后用于实验，并分为g1、g2、g3、g4的四个组，
各组6只。将所述4组分为没有进行任何施用的对照组(vehicle)、施用序列号20的长效缀合物的组(1nmol/kg)、施用序列号36的长效缀合物的组(1nmol/kg)、施用序列号40的长效缀合物的组(1nmol/kg)。将所述试验物质皮下施用，在20小时后，使小鼠禁食4小时。为了腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,ipgtt)，将葡萄糖以1g/kg腹腔内施用，然后，使用通过用26g注射器刺尾静脉部分来获得的1至2滴的血液，使用血糖分析仪(onetouch ultra,lifescan,inc.,美国)测量了小鼠血糖。在施用葡萄糖前、施用后15分钟、30分钟、1小时和2小时测量血糖。
[0351]
图2a示出确认序列号20、36，以及40的长效缀合物在正常小鼠中的血糖调节功效的结果。
[0352]
图2b示出确认序列号20、36，以及40的长效缀合物在正常小鼠中血糖调节功效的结果。
[0353]
由此确认，如图2a和图2b所示，序列号20、36，以及40的长效性缀合物均在葡萄糖耐量实验中表现出相对于对照组显著地改善的血糖调节能力。
[0354]
实施例6：确认长效双重激动剂缀合物在dio/stz大鼠中的血糖降低功效和胰岛素抗性改善
[0355]
为了测量施用在所述实施例3中制备的序列号20的长效缀合物的组合物引起的体内(in vivo)功效，使用了作为二型糖尿模型的dio/stz大鼠。
[0356]
将作为高脂肪饲料的d12492(rodent diet with 60kal％fat，research diet inc.,美国)供应给七周龄的正常雄性sd大鼠两周后，将能够破坏胰脏β细胞的stz以30mg/kg的容量施用每周总两次来制备了dio/stz大鼠。为了持续糖尿病状态，使所制备的模型继续摄取高脂肪饲料。将其中诱发糖尿的大鼠根据血糖分为g1、g2和g3的三个组。将所述组分为没有进行任何施用的对照组(vehicle)、施用低容量的序列号20的长效性缀合物的组(3.0nmol/kg/q3d)、施用高容量的序列号20的长效性缀合物的组(14.8nml/kg/q3d)。
[0357]
并且，在重复施用所述试验物质5周的同时测量了血糖和糖化血红蛋白。用26g注射器刺尾静脉部分获得的1至2滴的血液用于使用血糖分析仪(onetouch ultra,lifescan,inc.,美国)测量血糖，并且，使用糖尿诊断仪(dca vantage,siemens ag,德国)测量了糖化血红蛋白。
[0358]
重复施用5周后，通过使用elisa试剂盒(rat ultrasensitive insulin elisa,alpco,美国)测量大鼠的血液中胰岛素浓度来计算homa-ir(homeostatic model assessment-insulin resistance)。homa-ir是可以用于确认胰岛素抗性的最有代表性的试验和指标。
[0359]
图3a示出确认序列号20的长效缀合物在二型糖尿病模型中的血糖降低效果的结果。
[0360]
图3b示出确认序列号20的长效缀合物在二型糖尿病模型中的糖化血红蛋白数值减小效果的结果。
[0361]
已确认，如图3a和图3b所示，在将根据一实施例的长效缀合物施用于dio/std大鼠5周的情况下，血糖下降了。糖化血红蛋白数值也减少了。确认了血糖降低功效与施用量成比例地增加，糖化血红蛋白与施用期间和施用量成比例地减少，由此确认根据一实施例的双重激动剂直接参与血糖降低。
[0362]
图4示出确认序列号20的长效缀合物在二型糖尿病模型中的胰岛素抗性改善功效的结果。
[0363]
如图4所示，在将长效缀合物施用于dio/stz大鼠5周的情况下，胰岛素抗性改善效率得以显著改善。

技术特征：
1.一种肽，其包括选自由序列号1至44组成的组中的任一个氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽包括选自由序列号14、15、16、20、36、37、38和40组成的组中的任一个氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽包括选自由序列号20、36和40组成的组中的任一个氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的肽，其对胰高血糖素样肽-1受体和糖依赖性胰岛素释放肽受体具有活性。5.根据权利要求1所述的肽，其中，在所述肽序列中起n端的第十二个氨基酸与第十六个氨基酸或第十六个氨基酸与第二十个氨基酸互相成环。6.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽是在其c端未经修饰或经酰胺化的。7.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的肽。8.一种载体，其包括根据权利要求7所述的多核苷酸。9.一种缀合物，其中，根据权利要求1至6中任一项所述的肽与增加体内半衰期的生物相容性物质互相结合。10.根据权利要求9的缀合物，其中，所述生物相容性物质选自由高分子聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、fcrn结合物质、生物内结合组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类、肝素，以及弹性蛋白组成的组中。11.根据权利要求10所述的缀合物，其中，所述高分子聚合物选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多醇、聚乙烯醇、多糖类、聚乙烯乙基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、寡核苷酸以及其组合组成的组。12.根据权利要求9所述的缀合物，其中，所述生物相容性物质为fnrc结合物质。13.根据权利要求12所述的缀合物，其中，所述fcrn结合物质为免疫球蛋白fc区域。14.根据权利要求13所述的缀合物，其中，所述免疫球蛋白fc区域选自由(a)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域以及ch4结构域；(b)ch1结构域和ch2结构域；(c)ch1结构域和ch3结构域；(d)ch2结构域和ch3结构域；(e)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域以及ch4结构域中一个、两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区域或铰链区域中一部分的组合；以及(f)重链恒定区中的各结构域和轻链恒定区的二聚体组成的组。15.根据权利要求13所述的缀合物，其中，所述免疫球蛋白fc区域是非糖基化的。16.根据权利要求13所述的缀合物，其中，所述免疫球蛋白fc区域为igg4 fc区域。17.根据权利要求13所述的缀合物，其中，所述免疫球蛋白fc区域是源自人igg4的非糖基化fc区域。18.根据权利要求9所述的缀合物，其中，所述肽通过接头连接生物相容性物质。19.根据权利要求18所述的缀合物，其中，所述接头选自由肽、脂肪酸、糖类、高分子聚合物、低分子化合物、核苷酸以及其组合组成的组。20.根据权利要求19所述的缀合物，其中，所述高分子聚合物选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多醇、聚乙烯醇、多糖类、聚乙烯乙基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、寡核苷酸以及其组合组成的组。21.根据权利要求18所述的缀合物，其中，所述接头含有乙二醇重复单元。
22.根据权利要求21所述的缀合物，其中，所述乙二醇重复单元部分的化学式量在1至100kda的范围内。23.一种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的肽、其药学上可接受的盐或其溶剂合物，或根据权利要求8至22中的任一项所述的缀合物。24.根据权利要求23所述的药物组合物，其进一步包括药学上可接受的赋形剂。

技术总结
提供一种GLP-1/GIP双重激动剂、其药学上可接受的盐、其溶剂合物，或其长效缀合物，或包括其的用于预防或治疗糖尿病的药物组合物。括其的用于预防或治疗糖尿病的药物组合物。括其的用于预防或治疗糖尿病的药物组合物。


技术研发人员：金垠廷 崔宰赫 刘宁相 任炫炷 李相贤
受保护的技术使用者：韩美药品株式会社
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2023/7/12