一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法与流程

1.本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法。


背景技术：

2.免疫抑制剂是一类通过抑制细胞及体液免疫反应而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质，可抑制机体异常的免疫反应，主要应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。
3.目前对血药浓度监测传统方法学是以免疫学为主，需要受到药物抗体种类的限制，若没有合适的抗体，则无法开发相应的方法学，并且也无法同时测定两种免疫抑制剂。药物浓度监测的另外一种方法学是高效液相色谱法(hplc)，灵敏度相对液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)更低，在检测一些灵敏度要求比较高的药物时无法做到。
4.因此，针对上述技术问题，有必要提供一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，以解决现有技术中无法同时测定两种免疫抑制剂的问题。
6.为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：
7.一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，包括以下步骤：
8.s1、制备校准品和质控品：将校准品及质控品中间液和空白基质混合，并且涡旋震荡；
9.s2、将待测样本、校准品、质控品、内标萃取液取出放置室温并混匀；
10.s3、分别取待测样本、校准品、质控品、空白样于ep管中，加入内标中间液，再加入50ul 100mm znso4，涡旋震荡30s；
11.s4、加入有机溶剂，涡旋混匀，离心制得提取液；
12.s5、取100ul提取液上清液至96孔板中，盖上盖垫，使用液相色谱-串联质谱系统进行检测验证，采集质谱信号；
13.s6、建立已知浓度标准品与目标分析物响应值之间的函数关系。
14.进一步地，所述s1中校准品及质控品中间液和空白基质的比例为：1:199，并且以2000rpm/min涡旋震荡5min。
15.进一步地，所述s3中待测样本、校准品、质控品、空白样为：各50μl，ep管为：1.5ml，内标中间液为：5ul，100mm znso4为：50ul。
16.进一步地，所述s4中的有机溶剂为甲醇，纯度为色谱纯。
17.进一步地，所述s5中的液相色谱使用条件如下：流动相，包括流动相a和流动相b；色谱柱：kinetex f5，3.0
×
50mm,2.6μm；流速：0.6ml/min、进样体积：6μl、柱温：40℃、洗脱
方式为梯度洗脱。
18.进一步地，所述流动相a为2mm甲酸铵，且含有0.1％甲酸、流动相b为0.1％甲酸乙腈。
19.进一步地，所述s5中的检测验证包括基质曲线验证、准确度验证、精密度验证、特异性和选择性验证、残留验证、重复进样稳定性验证。
20.进一步地，所述基质曲线验证为：分别取基质曲线6个浓度点各50μl，按3.1/3.2项下的测定方法进行测定，以待测物浓度值为横坐标，以待测物与内标的面积比为纵坐标绘制标准曲线，进行回归计算。
21.进一步地，所述准确度验证为：配制低、高浓度2水平的质控品，添加到未知血清中去混匀后进行测试，每个浓度重复测定3次，同时测定加入了等量甲醇的未知血清即基础样本。
22.进一步地，所述精密度验证为：分别对低、高2个浓度的样本进行6次平行测定，重复测定3个批次，以area ratio值计算各浓度的批内及批间cv值。
23.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
24.本发明中，液相色谱串联质谱法采用高效液相色谱分离和质谱分析的结合方式，可以克服血液样本中的复杂背景干扰，提高性价比，对于体内浓度较小的药物，包括抗肿瘤药物可达到高灵敏度，方便检出。
25.本发明中，液相色谱串联质谱法可以对一次样品，检测多种物质，免疫抑制剂组合使用情况下，使用液相色谱串联质谱法可以对这些药物和代谢物同时进行检测，提高检测效率，对临床意义更大。
26.本发明中，对液相色谱串联质谱法前处理进行优化，简单步骤处理后即可上机检测，减少样本等待时间。
附图说明
27.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是本技术一实施方式中一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法的流程图；
29.图2是本技术一实施方式中检测仪器及型号表格图；
30.图3是本技术一实施方式中试剂及纯度表格图；
31.图4是本技术一实施方式中标准物质及英文表格图；
32.图5是本技术一实施方式中工作曲线浓度表表格图；
33.图6是本技术一实施方式中源气参数表格图；
34.图7是本技术一实施方式中离子对信息表格图；
35.图8是本技术一实施方式中洗脱梯度表格图；
36.图9是本技术一实施方式中曲线验证汇总表格图；
37.图10是本技术一实施方式中准确度验证结果表格图；
38.图11是本技术一实施方式中精密度验证数据表格图；
39.图12是本技术一实施方式中特异性验证汇总表格图；
40.图13是本技术一实施方式中残留效应汇总表格图；
41.图14是本技术一实施方式中重复进样验证结果汇总表格图。
具体实施方式
42.以下将结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细描述。但该等实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据该等实施方式所做出的结构、方法或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
43.本发明公开了一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，如图1-图14所示，包括以下步骤：
44.s1、制备校准品和质控品：将校准品及质控品中间液和空白基质混合，并且涡旋震荡；
45.s2、将待测样本、校准品、质控品、内标萃取液取出放置室温并混匀；
46.s3、分别取待测样本、校准品、质控品、空白样于ep管中，加入内标中间液，再加入50ul 100mm znso4，涡旋震荡30s；
47.s4、加入有机溶剂，涡旋混匀，离心制得提取液；
48.s5、取100ul提取液上清液至96孔板中，盖上盖垫，使用液相色谱-串联质谱系统进行检测验证，采集质谱信号；
49.s6、建立已知浓度标准品与目标分析物响应值之间的函数关系。
50.如图1-图2所示，s1中校准品及质控品中间液和空白基质的比例为：1:199，并且以2000rpm/min涡旋震荡5min，配制后各药物浓度如图4所示。s3中待测样本、校准品、质控品、空白样为：各50μl，ep管为：1.5ml，内标中间液为：5ul，100mm znso4为：50ul。
51.如图1-图3所示，s4中的有机溶剂为甲醇，纯度为色谱纯，并且是以2000rpm，涡旋混匀5min，提高混匀效果，然后在4℃的环境下通过离心机以14000rpm离心5min。
52.如图1-图8所示，s5中的液相色谱使用条件如下：流动相，包括流动相a和流动相b，流动相a为2mm甲酸铵，且含有0.1％甲酸、流动相b为0.1％甲酸乙腈。色谱柱采用kinetex f5，3.0
×
50mm,2.6μm、流速为0.6ml/min、进样体积为6μl、柱温在40℃，并且洗脱方式为梯度洗脱，而洗脱梯度表如图8所示。
53.具体地，本方法采用ab sciex triple quad 4500液相色谱质谱联用仪进行检测。
54.如图9-图14所示，s5中的检测验证包括基质曲线验证、准确度验证、精密度验证、特异性和选择性验证、残留验证、重复进样稳定性验证。
55.如图9所示，基质曲线验证为：分别取基质曲线6个浓度点各50μl，按3.1/3.2项下的测定方法进行测定，以待测物浓度值为横坐标，以待测物与内标的面积比为纵坐标绘制标准曲线，进行回归计算。
56.如图9所示，得出结论：2种药物线性r值均大于0.99，所以表明2种药物范围内线性关系良好。
57.如图10所示，准确度验证为：配制低、高浓度2水平的质控品，添加到未知血清中去混匀后进行测试，每个浓度重复测定3次，同时测定加入了等量甲醇的未知血清即基础样
本。
58.其中，实验样本的要求和制备方法：选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份；在3份样本中加入不同量的待测物标准，制成2个不同加入浓度的回收样本，如基质高、低质控点，计算加入的待测物的浓度；在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。然后用待评价方法对回收样本和基础样本进行测定，对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。
59.具体地，回收率的计算方式：回收率1＝(回收样本浓度1-基础样本浓度)/加入浓度
×
100％；
60.平均回收率的计算方式：平均回收率＝(回收率1+回收率2)/2
×
100％；平均回收率在85％～115％为可接受范围。
61.如图10所示，得出结论：可知所有药物的各浓度加标回收均在85％～115％之间，满足准确度性能验证要求。
62.如图11所示，精密度验证为：分别对低、高2个浓度的样本进行6次平行测定，重复测定3个批次，以area ratio值计算各浓度的批内及批间cv值。而高浓度准确度cv＜15％，低浓度cv＜20％即为可接受。
63.如图11所示，得出结论：2种免疫抑制剂药物浓度的批内及批间精密度均cv≤15％，满足性能验证要求。
64.如图12所示，特异性和选择性的验证测定方法：是通过检测空白(含内标样本基质)样本，并且无背景峰或背景峰小于llmi峰面积的20％在可接受范围。
65.如图12所示，得出结论：他克莫司和环孢素a的空白峰面积均小于llmi峰面积的20％，满足特异性和选择性的要求。
66.如图13所示，残留验证方法：分析高浓度样本后立刻进样1份或多份空白样本，空白样本的检测信号应远远低于llmi。本实验在分析完曲线最高点后立即进空白样本，重复测定6次，其峰面积与llmi的峰面积结果，得出结论：最高浓度样品之后在双空白样品中的残留均小于定量下限的20％，满足性能验证要求。
67.如图14所示，重复进样稳定性验证中，需要将将测定结果的平均值进行计算，并且要求cv≤15％，而由图可知，本验证各分析物重复性进样cv≤15％，满足验证要求。
68.结论：通过以上数据得出本方法基于ab sciex triple quad 4500液相色谱质谱联用仪下，可对2种免疫抑制剂药物进行准确定量，其中线性可满足r》0.99，最低标准点偏差
±
20％以内，其余标准点偏差在
±
15％以内，质控准确度满足re≤
±
15％，批内及批间精密度满足cv≤15％。即本产品适配于ab sciex triple quad 4500液相色谱质谱联用仪，满足临床对于2种免疫抑制剂药物浓度的检测要求。
69.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
70.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说
明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、制备校准品和质控品：将校准品及质控品中间液和空白基质混合，并且涡旋震荡；s2、将待测样本、校准品、质控品、内标萃取液取出放置室温并混匀；s3、分别取待测样本、校准品、质控品、空白样于ep管中，加入内标中间液，再加入50ul 100mm znso4，涡旋震荡30s；s4、加入有机溶剂，涡旋混匀，离心制得提取液；s5、取100ul提取液上清液至96孔板中，盖上盖垫，使用液相色谱-串联质谱系统进行检测验证，采集质谱信号；s6、建立已知浓度标准品与目标分析物响应值之间的函数关系。2.根据权利要求1所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述s1中校准品及质控品中间液和空白基质的比例为：1:199，并且以2000rpm/min涡旋震荡5min。3.根据权利要求1所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述s3中待测样本、校准品、质控品、空白样为：各50μl，ep管为：1.5ml，内标中间液为：5ul，100mm znso4为：50ul。4.根据权利要求1所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述s4中的有机溶剂为甲醇，纯度为色谱纯。5.根据权利要求1所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述s5中的液相色谱使用条件如下：流动相，包括流动相a和流动相b；色谱柱：kinetex f5，3.0
×
50mm,2.6μm；流速：0.6ml/min、进样体积：6μl、柱温：40℃、洗脱方式为梯度洗脱。6.根据权利要求5所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述流动相a为2mm甲酸铵，且含有0.1％甲酸、流动相b为0.1％甲酸乙腈。7.根据权利要求1所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述s5中的检测验证包括基质曲线验证、准确度验证、精密度验证、特异性和选择性验证、残留验证、重复进样稳定性验证。8.根据权利要求7所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述基质曲线验证为：分别取基质曲线6个浓度点各50μl，按3.1/3.2项下的测定方法进行测定，以待测物浓度值为横坐标，以待测物与内标的面积比为纵坐标绘制标准曲线，进行回归计算。9.根据权利要求7所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述准确度验证为：配制低、高浓度2水平的质控品，添加到未知血清中去混匀后进行测试，每个浓度重复测定3次，同时测定加入了等量甲醇的未知血清即基础样本。10.根据权利要求7所述的一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，其特征在于，所述精密度验证为：分别对低、高2个浓度的样本进行6次平行测定，重复测定3个批次，以area ratio值计算各浓度的批内及批间cv值。

技术总结
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种同时检测2种免疫抑制剂血药浓度的方法，包括以下步骤：S1、制备校准品和质控品：将校准品及质控品中间液和空白基质混合，并且涡旋震荡；S2、将待测样本、校准品、质控品、内标萃取液取出放置室温并混匀；S3、分别取待测样本、校准品、质控品、空白样于EP管中，加入内标中间液，再加入50uL 100mM ZnSO4，涡旋震荡30s；S4、加入有机溶剂，涡旋混匀，离心制得提取液；S5、取100uL提取液上清液至96孔板中，盖上盖垫，使用液相色谱-串联质谱系统进行检测验证，采集质谱信号；S6、建立已知浓度标准品与目标分析物响应值之间的函数关系。本发明可以克服血液样本中的复杂背景干扰，对于体内浓度较小的药物方便检出。方便检出。方便检出。


技术研发人员：邹珍珍 孔彬 杨毅 徐高军 杨曹骅
受保护的技术使用者：江苏瑞质生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/7/12