用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法

用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法
1.分案说明
2.本发明为申请日为2021年11月30日，申请号为202111443160.x，发明名称为“用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物、引物试剂盒及鉴定方法”的分案申请。
技术领域
3.本发明属于水产养殖中物种鉴定技术领域，具体的说是一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法。


背景技术：

4.传统鱼类物种鉴定均依据可量和可数的形态学特征，然而由于同一种鱼类的不同地理群体往往表现出可分辨的形态差异特征，而亲缘关系较近的不同鱼类间往往区别特征不明显，因此，难以快速、有效地通过形态特征进行鉴定。此外，鱼类生殖隔离机制不够完善，通过人工杂交育种可实现不同鱼类的种间杂交，并且天然的种间杂交在近缘物种间也较常见。鱼类种间杂交个体的形态特征复杂多样，有的偏向母本、有的偏向父本，有的则介于二者之间，这使得鱼类的物种鉴定更加困难和复杂。当前，分子标记技术已在鱼类群体遗传结构分析、亲子鉴定、疾病诊断、性别检测、物种鉴定等众多研究领域中广泛应用。因此，通过分子标记技术，研发物种特异性标记，可实现不同鱼类及其杂交个体的有效鉴定。与传统形态学方法相比，该技术无需对形态特征进行繁琐的测量和计数，可有效降低劳动强度，同时可大大提高鉴定的准确性，实现对目标样本的高效、准确鉴定。
5.乌苏里拟鲿(pseudobagrus ussuriensis)和圆尾拟鲿(p.tenuis)均为鲇形目、鲿科、拟鲿属鱼类，这两种鱼类在我国均具有广泛的分布范围，并且从淮河流域至珠江流域为二者分布的重叠区。这两种鱼类形态特征类似，非专业人士一般很难将二者区分开。此外，随着我国水产养殖产业对优良养殖品种需求的持续增大，通过种间杂交进行新品种培育，已在鲿科鱼类中广泛开展。乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿均为新兴的名优养殖鱼类，在开展这两种鱼类种间杂交育种试验时，发现这二者的杂交个体表型较复杂：大多数杂交个体倾向于母本的表型，但也有部分个体倾向于父本或者介于二者之间。通过形态学特征很难将乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿、乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿及圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿进行有效区分。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，即提供一组乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿种间特异性的pcr引物，作为精确、高效鉴定乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿、乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿和圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿的有力工具，可以有效解决背景技术中提出的问题。
7.技术方案：
8.本发明提供了一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物，以乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的4个种间特异位点的核苷酸序列seq id no：1-4为模板进行pcr引物设计，获得核苷酸序列为seq id no：5-12的四对引物。
9.进一步地，核苷酸序列seq id no：5-12为：
[0010][0011][0012]
本发明还提供了一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物试剂盒，所述引物试剂盒包含上述引物。
[0013]
优选地，所述引物试剂盒还包括pcr技术常用的试剂taq dna聚合酶、10
×
pcr buffer、dntps、重蒸水或mgcl2；上述各试剂的溶剂均为无菌超纯水。
[0014]
本发明还提供了一种乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，包括如下步骤：s1.dna抽提：抽提目标个体的基因组dna；s2.pcr扩增：以s1抽提的目标个体的基因组dna为模板，用所述的四对引物对目标个体的基因组dna分别进行pcr扩增，分别获得各目标个体四对引物的4个pcr扩增产物；s3.扩增产物电泳检测：将每个目标个体的4个pcr扩增产物等量混合，通过琼脂糖凝胶电泳并染色后检测s2获得的pcr扩增产物；s4.乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体鉴定：根据每个目标个体pcr扩增产物的带型鉴定其属于哪种鱼。
[0015]
优选地，所述s4中，具体的鉴定方法如下：仅在230bp和133bp处有条带的样本为乌苏里拟鲿；在507bp、419bp、260bp和110bp处均有条带的样本为圆尾拟鲿；在507bp和419bp处均无条带，在260bp、230bp、133bp和110bp至少三处有条带的为乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿在507bp和419bp处均有条带，在260bp、230bp、133bp和110bp至少三处有条带的为圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿
[0016]
优选地，在所述s1中，采用苯酚-氯仿dna提取方法抽提目标个体尾鳍组织的基因
组dna。
[0017]
优选地，在所述s2中，pcr扩增的反应体系为：总体积25-50μl，包含80-100ng的模板dna(约1.5-2.5μl)，1.5u taq dna聚合酶(0.2-0.3μl)，2.5-5μl 10
×
pcr buffer，0.8-1.5μl dntp(2.5mm)，seq5-seq6、seq7-seq8、seq9-seq10、seq11-seq12引物各0.8-1.2μl(引物浓度为2.5μm，各引物对的体系均单独配制)，灭菌超纯水18-25μl。
[0018]
优选地，在所述s2中，pcr扩增的程序为：95℃预变性6-8分钟；95℃变性45-60秒、50-64℃退火45-60秒、72℃延伸45-60秒，30-37个循环；最后72℃终延伸15-20分钟，pcr扩增产物于4℃保存。
[0019]
优选地，所述s3中，扩增产物电泳检测的具体过程为：将pcr扩增产物等量混合后，在已加入gelgreen染色剂的2％-5％琼脂糖凝胶中，300-350v电压下电泳2-3分钟，然后在200-240v恒定电压下电泳15-25分钟进行分离。
[0020]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0021]
一、无需进行繁琐的可量和可数形态特征的测量、计数与计算，有效降低鉴定过程中的劳动强度；
[0022]
二、pcr引物对扩增产物梯度明显，仅通过单次电泳即可达到检测目的，检测效率高，鉴定结果精准；
[0023]
三、本发明克服现有技术的不足，提供了一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物、引物试剂盒及鉴定方法，包括pcr引物对扩增、扩增产物电泳检测、带型分析与物种鉴定等步骤。本发明通过整合四个乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的种间特异性标记，构建了用于二者及其正反杂交个体鉴定的pcr体系，不仅提高了这二者及其正反杂交个体鉴定的效率和准确性，而且可有效降低劳动强度、节约劳动力，为乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿自然与养殖群体种质纯度的实时监测提供有力工具，对促进乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的杂交育种进程具有重要意义。
[0024]
因此，本发明研发了用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体鉴定的pcr引物，利用该组引物可以精确、高效地实现乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿、乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿和圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿
♂
个体的鉴定。
附图说明
[0025]
图1为利用本发明公布的pcr引物在乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿、乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿和圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿各4尾中的琼脂糖电泳带型图，泳道m为dm2000 dnamarker。
具体实施方式
[0026]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0027]
以下实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，《分子克隆实验指南(第三版)》，或接照制造厂商所建议的条件。
[0028]
实施例1乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的pcr体系的组成与配制
[0029]
(1)pcr体系组成：
[0030]
dntps(10mm)、taq dna聚合酶(5u/μl)、10
×
pcr buffer均为江苏康为世纪生物科技股份有限公司产品；
[0031]
引物为生工生物工程(上海)股份有限公司合成：以乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的4个种间特异位点的核苷酸序列seq id no：1-4为模板进行pcr引物设计，获得核苷酸序列为seq id no：5-12的四对引物：
[0032]
seq5:5'-ctcttgcctatatcgtgccg-3'
[0033]
seq6:5'-gtaatcatactgcttcttgggt-3'
[0034]
seq7:5'-gtatttattggaggatgagga-3'
[0035]
seq8:5'-gttatggagtagcacagtcgt-3'
[0036]
seq9:5'-tcctacactttcatctcccag-3'
[0037]
seq10:5'-acacttcaacagccgcatc-3'
[0038]
seq11:5'-gctttgccgttacgatactt-3'
[0039]
seq12:5'-tgcctgaatctgaactgactc-3'。
[0040]
上述引物可以制作成用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物试剂盒，该引物试剂盒还包括pcr技术常用的试剂taq dna聚合酶、10
×
pcr buffer、dntps、重蒸水或mgcl2。
[0041]
(2)10
×
pcr buffer组成：
[0042]
tris-hcl(ph8.3)100mm、kcl 500mm、mgcl215 mm。
[0043]
(3)pcr反应体系配制：
[0044]
总体积50μl，包含80-100ng的模板dna 3.0μl，2u taq dna聚合酶，5.0μl 10
×
pcr buffer，1.5μl dntp(2.5mm)，seq5-seq6/seq7-seq8/seq9-seq10/seq11-seq12引物1.5μl(各引物浓度为2.5μm，各引物对分别配制反应体系)，灭菌超纯水39μl。
[0045]
(4)琼脂糖凝胶配制：
[0046]
琼脂糖1.5g、0.5
×
tae 40ml、gelgreen染色剂(美国biotium公司产品)2.5μl。
[0047]
实施例2在已知乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交样本中的鉴定效果评估
[0048]
s1.随机选取繁殖场中的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿各80尾，人工催产并杂交的乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿各80尾，各样本分别剪取少量尾鳍组织，采用苯酚-氯仿法分别抽提基因组dna，并用灭菌超纯水将dna浓度稀释至80-100ng/μl。
[0049]
s2.以s1抽提的基因组dna为模板，按照实施例1中(3)的体系分别配制4个引物对的pcr反应混合液。
[0050]
s3.在pcr仪上进行扩增，95℃预变性6-8分钟；95℃变性45-60秒、50-64℃退火45-60秒、72℃延伸45-60秒，30-37个循环；最后72℃终延伸15-20分钟，pcr产物于4℃保存。
[0051]
s4.每尾个体取4个pcr引物对的产物5μl混合，然后点在按照实施例1中(4)的体系配制的琼脂糖凝胶中，先用300v电压电泳2分钟，然后在230v恒定电压下电泳15分钟进行分离。并用gel doctm ez(美国bio-rad)凝胶成像仪对每张凝胶扫描并拍照保存。
[0052]
乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿、乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿和圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿的鉴定：根据每个个体pcr扩增产物的电泳条带进行鉴定：仅在230bp和133bp处有条带的样本为乌苏里拟鲿；在507bp、419bp、260bp和110bp处均有条带的样本为圆尾拟鲿；在507bp
和419bp处均无条带，在260bp、230bp、133bp和110bp至少三处有条带的为乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿；在507bp和419bp处均有条带，在260bp、230bp、133bp和110bp至少三处有条带的为圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿如图1所示。鉴定结果如表1所示。
[0053]
表1本发明pcr引物鉴定乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的效果评估结果
[0054][0055]
从结果来看本发明中的pcr引物鉴定出的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体数均与已知各类型的个体数相吻合，反映了该组pcr引物对乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体鉴定准确率极高。
[0056]
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。

技术特征：
1.一种乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：s1. dna抽提：抽提目标个体的基因组dna；s2. pcr 扩增：以s1抽提的目标个体的基因组dna为模板，使用用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物对目标个体的基因组dna分别进行pcr扩增，分别获得各目标个体四对引物的4个pcr扩增产物；其中，所述引物是以乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的4个种间特异位点的核苷酸序列seq id no：1-4为模板进行pcr引物设计，获得核苷酸序列为seq id no：5-12的四对引物。2.s3. 扩增产物电泳检测：将每个目标个体的4个pcr扩增产物等量混合，通过琼脂糖凝胶电泳并染色后检测s2获得的pcr扩增产物；s4. 乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体鉴定：根据每个目标个体pcr扩增产物的带型鉴定其属于哪种鱼。3. 根据权利要求1所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：所述核苷酸序列seq id no：5-12为：seq5: 5'
‑ꢀ
ctcttgcctatatcgtgccg
ꢀ‑
3'seq6: 5'
‑ꢀ
gtaatcatactgcttcttgggt
ꢀ‑
3'seq7: 5'
‑ꢀ
gtatttattggaggatgagga
ꢀ‑
3'seq8: 5'
‑ꢀ
gttatggagtagcacagtcgt
ꢀ‑
3'seq9: 5'
‑ꢀ
tcctacactttcatctcccag
ꢀ‑
3'seq10: 5'
‑ꢀ
acacttcaacagccgcatc
ꢀ‑
3'seq11: 5'
‑ꢀ
gctttgccgttacgatactt
ꢀ‑
3'seq12: 5'
‑ꢀ
tgcctgaatctgaactgactc
ꢀ‑
3'。4.根据权利要求1所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：所述s4中，具体的鉴定方法如下：仅在230 bp和133 bp处有条带的样本为乌苏里拟鲿；在507 bp、419 bp、260 bp 和110 bp处均有条带的样本为圆尾拟鲿；在507 bp和 419 bp处均无条带，在260 bp、230 bp、133 bp和110 bp至少三处有条带的为乌苏里拟鲿
♀×
圆尾拟鲿
♂
；在507 bp和419 bp处均有条带，在260 bp、230 bp、133 bp和110 bp至少三处有条带的为圆尾拟鲿
♀×
乌苏里拟鲿
♂
。5.根据权利要求1所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：在所述s1中，采用苯酚-氯仿dna提取方法抽提目标个体尾鳍组织的基因组dna。6. 根据权利要求1所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：在所述s2中，pcr扩增的反应体系为：总体积25-50
ꢀµ
l，包含80-100 ng的模板dna，1.5 u taq dna聚合酶，2.5-5
ꢀµ
l 10
×
pcr buffer，0.8-1.5
ꢀµ
l dntp，seq5-seq6、seq7-seq8、seq9-seq10、seq11-seq12引物各0.8-1.2
ꢀµ
l，灭菌超纯水18-25
ꢀµ
l。7.根据权利要求1所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：在所述s2中，pcr扩增的程序为：95
°
c预变性6-8分钟；95
°
c变性45-60秒、50-64
°
c退火45-60秒、72
°
c延伸45-60秒，30-37个循环；最后72
°
c终延伸15-20分钟，pcr扩增产物于4
°
c保存。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，其特征在于：所述s3中，扩增产物电泳检测的具体过程为：将pcr扩增产物等量混合后，在已加入gelgreen染色剂的2%-5%琼脂糖凝胶中，300-350 v电压下电泳2-3分钟，然后在200-240 v恒定电压下电泳15-25分钟进行分离。

技术总结
本发明属于水产养殖中物种鉴定技术领域，公开了一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法，以乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的4个种间特异位点的核苷酸序列SEQ ID NO：1-4为模板进行PCR引物设计，获得核苷酸序列为SEQ ID NO：5-12的四对引物。本发明整合4个乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿种间特异性标记位点，开发了用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的方法，能够高效、准确地实现乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体的鉴定，可用于养殖与自然群体中乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体的鉴定；对乌苏里拟鲿与圆尾拟鲿的自然资源保护与杂交育种具有重要意义。自然资源保护与杂交育种具有重要意义。自然资源保护与杂交育种具有重要意义。


技术研发人员：朱传坤 潘正军 王辉 常国亮 丁怀宇 聂孝燕 吴楠 赵海涛 孙艳红 余祥胜
受保护的技术使用者：淮阴师范学院
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2023/7/12