一种体外生产血小板的方法与流程

1.本发明涉及血小板制备技术领域，尤其涉及一种体外生产血小板的方法。


背景技术：

2.血小板是哺乳动物血液中的重要有形成分之一，它在止血、凝血以及免疫炎症的发生发展中发挥了重要的作用。血小板减少或者功能障碍会引起机体不同度的出血，严重时甚至可导致患者死亡。对血小板减少或者功能碍的患者临床上目前多采用输注血小板的方法进行治疗；然而，随着血小板输注总人数的逐年递增，仅仅靠无偿献血获得的血小板并不能满足临床的需求，同时由无偿献血获得的血小板还受到储存时间短和易受病原污染等方面的限制，因此需要更安全、可信赖的血小板来源和更便利的血小板生产方法。
3.现有技术中存在一些利用干细胞在体外诱导生成血小板的方案，包括采用外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞、脐带血造血干细胞和胚胎干细胞等，例如lu等用人胎胞( human embryonic stem cell，hesc)来源的成血管细胞(heman-gioblasts/blast cells，bcs)作为生成巨核细胞的中间细胞，诱导其生成巨核细胞进而生成血小板。该研究小组还探讨了适合bcs细胞诱导分化为巨核细胞的培养体系，采用由stem-line1、50 ng/ml tpo、20 ng/ml干细胞因子(stem cellfactor，scf)、20ng/ml il-11组成的tsi培养基培养条件下培养4~6d得到的人胎干胞巨核细胞( human escmegakaryocytes,hesc-mk)，加到由op9鼠基质细胞、a-mem、150 ml/l 胎牛血清(fbs)、50ng/ml scf、100ng/ml tpo、25 /ml肝素钠组成的体系中，继续培养4-8d，通过流式细胞仪检测cd41/cd42b的表达情况，结果发现该培养体系有利于hesc-mk生成血小板，并验证了hesc-来源的血小板也同样具有正常人血液中血小板相似的特性。但是，即便如此，esc诱导生成血小板仍然受到了体外培养体系复杂，难以实现体外高产量或高效率生成血小板。
4.现有的研究虽然能够获得巨核细胞和血小板，但是在体外由每个巨核细胞分化产生的血小板的数量仍低于体内，并不能实现血小板规模化生产。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种体外生产血小板的方法，以解决现有技术中血小板生产效率低、不能实现规模化生产的问题。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种体外生产血小板的方法，包括以下步骤：将初始巨噬细胞进行扩增培养，得到扩增后的巨噬细胞；将扩增后的巨噬细胞进行传代，得到传代后的巨噬细胞；将传代后的巨噬细胞接种至诱导培养基，培养12~36h后在诱导培养基中加入复合诱导试剂，继续培养12h以上，完成血小板的体外生产；所述诱导培养基中包括以下终浓度的组分：40~60μg/ml的艾曲泊帕和50~100μg/ml的干细胞因子；
所述复合诱导试剂中包括以下终浓度的组分：50~100ng/ml的血小板生成素和50~100ng/ml的血小板衍生因子。
7.优选的，所述诱导培养基采用α-mem培养基和/或581培养基作为基础培养基。
8.优选的，所述扩增培养采用扩增培养基，所述扩增培养基中包括以下组分：血清替代品、谷氨酰胺溶液和neaa非必需氨基酸溶液；所述血清替代品占扩增培养基总体积的3~8%；所述谷氨酰胺溶液占扩增培养基总体积的0.5~1.5%；所述neaa非必需氨基酸溶液占扩增培养基总体积的0.5~1.5%。
9.优选的，所述扩增培养基采用α-mem培养基和/或581培养基作为基础培养基。
10.优选的，所述传代后的巨噬细胞为第二代细胞。
11.优选的，所述初始巨噬细胞来源于胎盘组织。
12.优选的，所述初始巨噬细胞通过包括以下步骤的制备方法得到：将胎盘组织进行预处理，得到组织碎块；将组织碎块进行2~5次消化过滤，合并滤液后终止消化，得到细胞混合物；将细胞混合物进行预纯化，得到分散细胞液；将分散细胞液进行纯化，得到初始巨噬细胞；所述胎盘组织在预处理之前采用胎盘保存液进行保存，和/或，所述胎盘组织在预处理之前采用3~5℃条件保存；所述胎盘保存液以生理盐水为溶剂，所述胎盘保存液包括以下终浓度的组分：3~8%白蛋白和0.5~1.5%青-链霉素；所述保存的时间在36h之内；所述消化采用消化液进行，所述消化液以581培养基为溶剂，包括以下终浓度的组分：0.03~0.08%胰蛋白酶替代物和0.05~0.15g/ml中性蛋白酶；所述组织碎块和消化液的质量体积比为1g:8~12ml；每次消化的时间为8~12min；所述过滤的目数为80~120目。
13.优选的，所述预处理包括以下步骤：去除胎盘组织中的大血管和结缔组织，用pbs缓冲液洗涤至胶白色，然后去除胎盘组织中的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎，得到1~3mm3组织碎块；所述终止消化具体包括将滤液与血清替代品混合，所述滤液和血清替代品的体积比为2~5%。
14.优选的，所述预纯化包括第一次离心、去除红细胞、第二次离心、洗涤、第三次离心和重悬细胞；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的温度独立的为3~5℃，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的转速独立的为800~1200g，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的时间独立的为3~8min；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心结束后分别收集沉淀，得到第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀；
所述去除红细胞具体包括将第一沉淀和红细胞裂解液混合；所述去除红细胞的过程中伴随冰浴；所述去除红细胞的时间为20~40min；所述洗涤具体包括采用pbs缓冲液对第二沉淀洗涤2~5次；所述重悬细胞具体包括采用581培养基与第三沉淀混合，得到分散细胞液。
15.优选的，所述纯化具体包括将分散细胞液加至淋巴细胞分离液上层，进行离心，离心后的体系表现出培养基层和淋巴细胞分离液层，初始巨噬细胞位于培养基层和淋巴细胞分离液层交界面上；所述分散细胞液和淋巴细胞分离液的体积比为1:0.8~1.2；所述离心的温度为3~5℃，所述离心的转速为300~700g，所述离心的时间为15~25min。
16.本发明的技术效果和优点：本发明通过设计特定的诱导方案，诱导巨噬细胞实现了血小板爆发式分泌的现象，能够在短时间内获得大量血小板，为血小板成分血制品的规模化生产提供了一种有效途径。
具体实施方式
17.本发明提供了一种体外生产血小板的方法，包括以下步骤：将初始巨噬细胞进行扩增培养，得到扩增后的巨噬细胞；将扩增后的巨噬细胞进行传代，得到传代后的巨噬细胞；将传代后的巨噬细胞接种至诱导培养基，培养12~36h后在诱导培养基中加入复合诱导试剂，继续培养12h以上，完成血小板的体外生产。
18.在本发明中，所述初始巨噬细胞优选通过包括以下步骤的制备方法得到：将胎盘组织进行预处理，得到组织碎块；将组织碎块进行2~5次消化过滤，合并滤液后终止消化，得到细胞混合物；将细胞混合物进行预纯化，得到分散细胞液；将分散细胞液进行纯化，得到初始巨噬细胞。
19.本发明所述胎盘组织在预处理之前优选采用胎盘保存液进行保存，所述胎盘组织优选取自足分娩月婴儿的胎盘，所述胎盘保存液以生理盐水为溶剂，包括以下终浓度的组分：3~8%白蛋白和0.5~1.5%青-链霉素，所述胎盘保存液中白蛋白的终浓度进一步优选为4~6%，所述胎盘保存液中青-链霉素的终浓度进一步优选为0.8~1.2%；所述保存的温度优选为3~5℃，进一步优选为4℃；所述保存的时间优选在36h之内，进一步优选在24h之内；本发明选用健康分娩的胎盘，并采用低温和特定的胎盘保存液对胎盘进行保存，在短时间进入试验流程，目的在于提取出活性高的巨噬细胞。
20.在本发明中，所述预处理优选包括以下步骤：去除胎盘组织中的大血管和结缔组织，用pbs缓冲液洗涤至胶白色，然后去除胎盘组织中的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎，得到1~3mm3组织碎块，此步骤优选在无菌环境中进行。
21.在本发明中，所述消化优选采用消化液进行，所述消化液优选以581培养基为溶剂，包括以下终浓度的组分：0.03~0.08%胰蛋白酶替代物和0.05~0.15g/ml中性蛋白酶，本发明所述消化液中胰蛋白酶替代物的终浓度优选为0.04~0.06%，本发明所述消化液中中性蛋白酶的终浓度优选为0.08~0.12g/ml；所述组织碎块和消化液的质量体积比优选为1g:8~
12ml，进一步优选为1g:9~11ml；本发明中，每次消化的时间优选为8~12min，进一步优选为9~11min；所述过滤的目数优选为80~120目，进一步优选为100目，所述消化优选在23~28℃条件下进行，所述消化优选伴随搅拌，以使消化更为充分；本发明中所述终止消化具体包括将滤液与血清替代品混合，所述滤液和血清替代品的体积比为2~5%，进一步优选为3~4%。在本发明中，胎盘组织采用双酶法进行酶解，不采用常规使用的胰酶和dna酶等酶解作用强烈的酶解液，而是采用了胰酶替代物和中性酶两种酶解液充分消化胎盘组织，使得巨噬细胞能迅速提取出来而不被伤害；并且酶解液中采用581培养基作为溶剂，在酶解过程中为细胞提供很好的营养供给，保证了细胞的活力。
22.在本发明中，所述预纯化优选包括第一次离心、去除红细胞、第二次离心、洗涤、第三次离心和重悬细胞；所述第一次离心的温度优选为3~5℃，进一步优选为4℃、转速优选为800~1200g，进一步优选为1000g、时间优选为3~8min，进一步优选为5min；所述第二次离心的温度优选为3~5℃，进一步优选为4℃、转速优选为800~1200g，进一步优选为1000g、时间优选为3~8min，进一步优选为5min；所述第三次离心的温度优选为3~5℃，进一步优选为4℃、转速优选为800~1200g，进一步优选为1000g、时间优选为3~8min，进一步优选为5min；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心结束后分别收集沉淀，得到第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀；所述去除红细胞优选将第一沉淀和红细胞裂解液混合，所述红细胞裂解液的添加量优选为第一沉淀的20~30倍；所述去除红细胞的过程中优选伴随冰浴；所述去除红细胞的时间优选为20~40min，进一步优选为25~35min；所述洗涤优选采用pbs缓冲液对第二沉淀洗涤2~5次；所述重悬细胞优选采用581培养基与第三沉淀混合，重悬得到分散细胞液，所述分散细胞液中的细胞浓度优选为1~2
×
105cells/ml。
23.在本发明中，所述纯化优选将分散细胞液加至淋巴细胞分离液上层，进行离心，离心后的体系表现出培养基层和淋巴细胞分离液层，初始巨噬细胞位于培养基层和淋巴细胞分离液层交界面上，所述淋巴细胞分离液优选为ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液；所述分散细胞液和淋巴细胞分离液的体积比优选为1:0.8~1.2，进一步优选为1:1；所述离心的温度优选为3~5℃，进一步优选为4℃，所述离心的转速优选为300~700g，进一步优选为400~600g，所述离心的时间优选为15~25min，进一步优选为18~22min，离心后优选将初始巨噬细胞吸取转移至新的容器并采用581培养基进行洗涤、洗涤后在4℃、500g条件下再次离心10min，得到纯化后的初始巨噬细胞。
24.在本发明中，将获得的初始巨噬细胞进行扩增培养，所述扩增培养优选采用扩增培养基，所述扩增培养基中包括以下组分：血清替代品、谷氨酰胺溶液和neaa非必需氨基酸溶液，所述血清替代品优选占扩增培养基总体积的3~8%，进一步优选为4~6%，所述谷氨酰胺溶液的初始浓度为180~200mm，稀释100后加至扩增培养基中，所述谷氨酰胺溶液优选占扩增培养基总体积的0.5~1.5%，进一步优选为0.8~1.2%；所述neaa非必需氨基酸溶液优选占扩增培养基总体积的0.5~1.5%，进一步优选为0.8~1.2%，所述扩增培养基优选采用α-mem培养基和/或581培养基作为基础培养基，进一步优选将α-mem培养基和581培养基混合使用，所述α-mem培养基和581培养基的添加量比优选为1:1~2；在本发明中，所述传代后的巨噬细胞优选为第二代细胞，也即传代一次得到的子代细胞。
25.在本发明中，将传代后的巨噬细胞接种至诱导培养基，培养12~36h，优选为培养18~24h；所述诱导培养基优选采用α-mem培养基和/或581培养基作为基础培养基，进一步优选
将α-mem培养基和581培养基混合使用，所述α-mem培养基和581培养基的添加量比优选为1:1~2；所述诱导培养基中包括以下终浓度的组分：40~60μg/ml的艾曲泊帕和50~100μg/ml的干细胞因子，所述艾曲泊帕的终浓度进一步优选为45~55μg/ml，所述干细胞因子的终浓度进一步优选为60~70μg/ml；然后在诱导培养基中加入复合诱导试剂，继续培养12h以上，优选为继续培养18h~36h，所述复合诱导试剂中包括以下终浓度的组分：50~100ng/ml的血小板生成素和50~100ng/ml的血小板衍生因子，所述血小板生成素的终浓度进一步优选为60~80ng/ml，所述血小板衍生因子的终浓度进一步优选为70~90ng/ml，即可诱导得到大量血小板。
26.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
27.实施例11）配制以生理盐水为溶剂，添加终浓度为5%白蛋白和1%青-链霉素的胎盘保存液，备用；在医院获取足分娩月婴儿的胎盘，胎盘用含有青-链霉素的pbs缓冲液（青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml）清洗后，浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输，分娩后24小时内进入实验程序。
28.2）组织处理：组织消化取约100g胎盘组织，置于玻璃盘，用无菌剪刀将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，置pbs充分洗涤，直到胎盘组织呈胶白色，尽可能去除肉眼可见的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎至1~3mm3。配制以581基础培养基为溶剂、添加终浓度为0.05%胰蛋白酶替代物（gibco）、0.1g/ml中性蛋白酶组成的消化液，备用；每10g胎盘组织加入消化液100ml，加入后在室温调节下匀速搅拌10min，共消化3次，每次消化完后都通过100目细胞过滤网过滤，并收集滤液。
29.在收集的滤液中添加体积比3%的helios血清替代品，混合均匀以终止消化，在4℃、1000g条件下离心10min，弃上清，加入15ml预冷红细胞裂解液，冰浴30min后在4℃、1000r/min条件下离心5min，弃上清，pbs缓冲液洗涤细胞3次，4℃、1000r /min离心5min，弃上清，加4ml 581基础培养基重悬细胞，得到细胞悬液。
30.3）巨噬细胞纯化提取：向15ml离心管中加入5ml ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液(密度1.007g/l)，将15ml上述步骤得到的细胞悬液缓慢加至淋巴细胞分离液上层，在4℃、500g条件下离心20min。离心完成后液体分为3层，其中巨噬细胞处于培养基与淋巴细胞分离液的交界面上。用吸管将巨噬细胞转移至15ml离心管中，添加4ml 581培养基对细胞进行洗涤，洗涤完成后在4℃、500g条件下离心10min，弃上清。
31.4）细胞接种：配制增殖培养基：以1:1混合的αmem基础培养基和581基础培养基作为基础培养基，加入终体积浓度为5%的血清替代品（品牌：helios；货号：hpcplcrl05）、初始浓度200mm并稀释100倍，终体积浓度为1%的谷氨酰胺溶液（solarbio，g0200）、终体积浓度为1%的neaa（gibco厂家，货号：11140050），备用；将步骤3）中得到的细胞接种至增殖培养基。
32.5）37℃、5%co2、95%湿度条件下培养48h后，弃上清，取一皿细胞进行贴壁率计算。
33.6）待细胞融合后，进行细胞传代，得到二代细胞。
34.7）细胞诱导48h：配制诱导培养基：以1:1混合的αmem基础培养基和581基础培养基作为基础培养基，加入终浓度为50μg/ml的艾曲泊帕（eltrobopag）、终浓度为70μg/ml的scf（干细胞因子），备用；将步骤6）得到的二代细胞接种至诱导培养基，诱导24h后在培养基中添加50ng/ml的tpo（血小板生成素）和100ng/ml的pdgf-bb（血小板衍生因子），tpo购买于上海齐源生物科技有限公司，货号4351-10，pdgf-bb购买于北京启维益成科技有限公司，货号cyt-242；8）流式检测：待细胞长至融合度达85%时进行流式检测：取细胞悬液用含10%fbs的pbs清洗两遍；分成两管细胞（1.53
×
106cells/管），向离心管中加200μl 1
×ꢀ
pbs-bsa-抗巨噬细胞抗体(fitc标记)将细胞染色，向另一离心管中加200μl 1
×
pbs-bsa作为对照，室温避光孵育45min，用于检测。
35.实施例21）配制以生理盐水为溶剂，添加终浓度为3%白蛋白和0.5%青-链霉素的胎盘保存液，备用；在医院获取足分娩月婴儿的胎盘，胎盘用含有青-链霉素的pbs缓冲液（青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml）清洗后，浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输，分娩后24小时内进入实验程序。
36.2）组织处理：组织消化取约100g胎盘组织，置于玻璃盘，用无菌剪刀将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，置pbs充分洗涤，直到胎盘组织呈胶白色，尽可能去除肉眼可见的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎至1~3mm3。配制以581基础培养基为溶剂、添加终浓度为0.03%胰蛋白酶替代物（gibco）、0.05g/ml中性蛋白酶组成的消化液，备用；每10g胎盘组织加入消化液80ml，加入后在室温调节下匀速搅拌8min，共消化3次，每次消化完后都通过100目细胞过滤网过滤，并收集滤液。
37.在收集的滤液中添加体积比3%的helios血清替代品，混合均匀以终止消化，在4℃、800g条件下离心10min，弃上清，加入15ml预冷红细胞裂解液，冰浴20min后在4℃、1000r/min条件下离心5min，弃上清，pbs缓冲液洗涤细胞3次，4℃、1000r /min离心5min，弃上清，加4ml 581基础培养基重悬细胞，得到细胞悬液。
38.3）巨噬细胞纯化提取：向15ml离心管中加入5ml ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液(密度1.007g/l)，将5ml上述步骤得到的细胞悬液缓慢加至淋巴细胞分离液上层，在4℃、500g条件下离心20min。离心完成后液体分为3层，其中巨噬细胞处于培养基与淋巴细胞分离液的交界面上。用吸管将巨噬细胞转移至15ml离心管中，添加4ml 581培养基对细胞进行洗涤，洗涤完成后在4℃、500g条件下离心10min，弃上清。
39.4）细胞接种：配制增殖培养基：以1:2混合的αmem基础培养基和581基础培养基作为基础培养基，加入终体积浓度为3%的血清替代品（品牌：helios；货号：hpcplcrl05）、初始浓度200mm并稀释100倍，终体积浓度为1%的谷氨酰胺溶液（solarbio，g0200）、终体积浓度为0.5%的neaa（gibco厂家，货号：11140050），备用；将步骤3）中得到的细胞接种至增殖培养基。
40.5）37℃、5%co2、95%湿度条件下培养48h后，弃上清，取一皿细胞进行贴壁率计算。
41.6）待细胞融合后，进行细胞传代，得到二代细胞。
42.7）细胞诱导48h：配制诱导培养基：以1:1混合的αmem基础培养基和581基础培养基作为基础培养基，加入终浓度为50μg/ml的艾曲泊帕（eltrobopag）、终浓度为70μg/ml的scf（干细胞因子），备用；将步骤6）得到的二代细胞接种至诱导培养基，诱导24h后在培养基中添加50ng/ml的tpo（血小板生成素）和100ng/ml的pdgf-bb（血小板衍生因子）8）流式检测：待细胞长至融合度达85%时进行流式检测：取细胞悬液用含10%fbs的pbs清洗两遍；分成两管细胞（1.53
×
106cells/管），向离心管中加200μl 1
×ꢀ
pbs-bsa-抗巨噬细胞抗体(fitc标记)将细胞染色，向另一离心管中加200μl 1
×
pbs-bsa作为对照，室温避光孵育45min，用于检测。
43.实施例31）配制以生理盐水为溶剂，添加终浓度为8%白蛋白和1.5%青-链霉素的胎盘保存液，备用；在医院获取足分娩月婴儿的胎盘，胎盘用含有青-链霉素的pbs缓冲液（青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml）清洗后，浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输，分娩后24小时内进入实验程序。
44.2）组织处理：组织消化取约100g胎盘组织，置于玻璃盘，用无菌剪刀将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，置pbs充分洗涤，直到胎盘组织呈胶白色，尽可能去除肉眼可见的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎至1~3mm3。配制以581基础培养基为溶剂、添加终浓度为0.05%胰蛋白酶替代物（gibco）、0.1g/ml中性蛋白酶组成的消化液，备用；每10g胎盘组织加入消化液120ml，加入后在室温调节下匀速搅拌10min，共消化3次，每次消化完后都通过100目细胞过滤网过滤，并收集滤液。
45.在收集的滤液中添加体积比3%的helios血清替代品，混合均匀以终止消化，在4℃、1000g条件下离心10min，弃上清，加入15ml预冷红细胞裂解液，冰浴30min后在4℃、1000r/min条件下离心5min，弃上清，pbs缓冲液洗涤细胞3次，4℃、1000r /min离心5min，弃上清，加4ml 581基础培养基重悬细胞，得到细胞悬液。
46.3）巨噬细胞纯化提取：向15ml离心管中加入5ml ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液(密度1.007g/l)，将5ml上述步骤得到的细胞悬液缓慢加至淋巴细胞分离液上层，在4℃、500g条件下离心20min。离心完成后液体分为3层，其中巨噬细胞处于培养基与淋巴细胞分离液的交界面上。用吸管将巨噬细胞转移至15ml离心管中，添加4ml 581培养基对细胞进行洗涤，洗涤完成后在4℃、500g条件下离心10min，弃上清。
47.4）细胞接种：配制增殖培养基：以1:1混合的αmem基础培养基和581基础培养基作为基础培养基，加入终体积浓度为8%的血清替代品（品牌：helios；货号：hpcplcrl05）、初始浓度200mm并稀释100倍，终体积浓度为1%的谷氨酰胺溶液（solarbio，g0200）、终体积浓度为1.5%的neaa（gibco厂家，货号：11140050），备用；将步骤3）中得到的细胞接种至增殖培养基。
48.5）37℃、5%co2、95%湿度条件下培养48h后，弃上清，取一皿细胞进行贴壁率计算。
49.6）待细胞融合后，进行细胞传代，得到二代细胞。
50.7）细胞诱导48h：配制诱导培养基：以1:1混合的αmem基础培养基和581基础培养基作为基础培养基，加入终浓度为60μg/ml的艾曲泊帕（eltrobopag）、终浓度为100μg/ml的scf（干细胞因子），备用；将步骤6）得到的二代细胞接种至诱导培养基，诱导24h后在培养基中添加100ng/ml的tpo（血小板生成素）和50ng/ml的pdgf-bb（血小板衍生因子）8）流式检测：待细胞长至融合度达85%时进行流式检测：取细胞悬液用含10%fbs的pbs清洗两遍；分成两管细胞（1.53
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106cells/管），向离心管中加200μl 1
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pbs-bsa-抗巨噬细胞抗体(fitc标记)将细胞染色，向另一离心管中加200μl 1
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pbs-bsa作为对照，室温避光孵育45min，用于检测。
51.对比例1与实施例1的不同之处仅在于，将艾曲泊帕的终浓度替换为200μg/ml。
52.对比例2与实施例1的不同之处仅在于，将干细胞因子的终浓度替换为200μg/ml。
53.对比例3与实施例1的不同之处仅在于，将血小板生成素的添加量替换为200ng/ml。
54.对比例4与实施例1的不同之处仅在于，将血小板生成素的添加量替换为10ng/ml。
55.对比例5与实施例1的不同之处仅在于，将血小板衍生因子的添加量替换为10ng/ml。
56.对比例6与实施例1的不同之处仅在于，将血小板衍生因子的添加量替换为200ng/ml。
57.对比例7与实施例1的不同之处仅在于，将血小板衍生因子的添加量替换为0ng/ml。
58.实验例1 plt数量鉴定采用血细胞计数仪检测单位体积内巨噬细胞分泌plt的数量，结果如下表1所示：表1 巨噬细胞分泌plt（n≥3）数量检测结果
由以上实施例可知，本发明提供了一种血小板的生产方法，通过本发明方案能够使巨噬细胞在单位体积内分泌的血小板浓度能达到450
×
109/l以上，说明巨噬细胞在本发明的诱导体系下，能够大量分泌血小板。
59.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种体外生产血小板的方法，其特征在于，包括以下步骤：将初始巨噬细胞进行扩增培养，得到扩增后的巨噬细胞；将扩增后的巨噬细胞进行传代，得到传代后的巨噬细胞；将传代后的巨噬细胞接种至诱导培养基，培养12~36h后在诱导培养基中加入复合诱导试剂，继续培养12h以上，完成血小板的体外生产；所述诱导培养基中包括以下终浓度的组分：40~60μg/ml的艾曲泊帕和50~100μg/ml的干细胞因子；所述复合诱导试剂中包括以下终浓度的组分：50~100ng/ml的血小板生成素和50~100ng/ml的血小板衍生因子。2.根据权利要求1所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述诱导培养基采用α-mem培养基和/或581培养基作为基础培养基。3.根据权利要求1所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述扩增培养采用扩增培养基，所述扩增培养基中包括以下组分：血清替代品、谷氨酰胺溶液和neaa非必需氨基酸溶液；所述血清替代品占扩增培养基总体积的3~8%；所述谷氨酰胺溶液占扩增培养基总体积的0.5~1.5%；所述neaa非必需氨基酸溶液占扩增培养基总体积的0.5~1.5%。4.根据权利要求3所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述扩增培养基采用α-mem培养基和/或581培养基作为基础培养基。5.根据权利要求1所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述传代后的巨噬细胞为第二代细胞。6.根据权利要求1所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述初始巨噬细胞来源于胎盘组织。7.根据权利要求6所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述初始巨噬细胞通过包括以下步骤的制备方法得到：将胎盘组织进行预处理，得到组织碎块；将组织碎块进行2~5次消化过滤，合并滤液后终止消化，得到细胞混合物；将细胞混合物进行预纯化，得到分散细胞液；将分散细胞液进行纯化，得到初始巨噬细胞；所述胎盘组织在预处理之前采用胎盘保存液进行保存，和/或，所述胎盘组织在预处理之前采用3~5℃条件保存；所述胎盘保存液以生理盐水为溶剂，所述胎盘保存液包括以下终浓度的组分：3~8%白蛋白和0.5~1.5%青-链霉素；所述保存的时间在36h之内；所述消化采用消化液进行，所述消化液以581培养基为溶剂，包括以下终浓度的组分：0.03~0.08%胰蛋白酶替代物和0.05~0.15g/ml中性蛋白酶；所述组织碎块和消化液的质量体积比为1g:8~12ml；每次消化的时间为8~12min；所述过滤的目数为80~120目。
8.根据权利要求7所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述预处理包括以下步骤：去除胎盘组织中的大血管和结缔组织，用pbs缓冲液洗涤至胶白色，然后去除胎盘组织中的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎，得到1~3mm3组织碎块；所述终止消化具体包括将滤液与血清替代品混合，所述滤液和血清替代品的体积比为2~5%。9.根据权利要求7或8所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述预纯化包括第一次离心、去除红细胞、第二次离心、洗涤、第三次离心和重悬细胞；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的温度独立的为3~5℃，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的转速独立的为800~1200g，所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的时间独立的为3~8min；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心结束后分别收集沉淀，得到第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀；所述去除红细胞具体包括将第一沉淀和红细胞裂解液混合；所述去除红细胞的过程中伴随冰浴；所述去除红细胞的时间为20~40min；所述洗涤具体包括采用pbs缓冲液对第二沉淀洗涤2~5次；所述重悬细胞具体包括采用581培养基与第三沉淀混合，得到分散细胞液。10.根据权利要求9所述的体外生产血小板的方法，其特征在于，所述纯化具体包括将分散细胞液加至淋巴细胞分离液上层，进行离心，离心后的体系表现出培养基层和淋巴细胞分离液层，初始巨噬细胞位于培养基层和淋巴细胞分离液层交界面上；所述分散细胞液和淋巴细胞分离液的体积比为1:0.8~1.2；所述离心的温度为3~5℃，所述离心的转速为300~700g，所述离心的时间为15~25min。

技术总结
本发明提供了一种体外生产血小板的方法，属于血小板制备技术领域。本发明通过设计特定的诱导方案，诱导巨噬细胞实现了血小板爆发式分泌的现象，克服了现有技术中血小板生产效率低、不能实现规模化生产的问题。本发明能够在短时间内获得大量血小板，通过本发明方案能够使巨噬细胞在单位体积内分泌的血小板浓度达到450


技术研发人员：谢佳琦 卢瑞珊 高大
受保护的技术使用者：广州正源生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/7/12