基因PlMKP1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用

基因plmkp1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因plmkp1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。


背景技术：

2.荔枝霜疫霉(peronophythora litchii)隶属于藻物界(chromista)、卵菌门(oomycota)。由荔枝霜疫霉引起的荔枝霜疫病，在荔枝上危害最为严重，且尚未发现有效的抗病荔枝种植品种。研究表明，荔枝霜疫霉成功侵染荔枝主要依赖于一系列致病因子，因此，充分挖掘荔枝致病相关基因并开展功能研究，对有效控制荔枝霜疫霉的危害和选育抗病品种具有重要意义。
3.荔枝霜疫霉引起的荔枝霜疫病严重威胁着我国荔枝产业的健康发展，是荔枝生产及采后为害最为严重、影响最为广泛的病害。该病可以侵染嫩叶、嫩枝、花穗及果实，引起大量花穗和果实腐烂，一般年份可造成10％～30％的产量损失，流行年份可造成80％的产量损失，在广东、广西和四川发生尤为严重。荔枝霜疫病多发生于荔枝果实转色至成熟阶段，但幼果、嫩叶、嫩枝及花穗等也可被为害。嫩叶发病会形成不规则褐色病斑，而成熟叶片受侵染则仅沿中脉出现褐色斑点。花穗受害则变褐腐烂，随后干枯脱落。果实发病时，初形成褐色病斑，无明显边缘，病斑发展迅速，可导致全果变褐，果肉发酸、糜烂，流出酸汁液；若连续阴雨或空气湿度大时，病果表面长出白色的霉层；幼果感病后很快脱落，造成大量落果。


技术实现要素：

4.为了克服现有防治荔枝霜疫霉技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基因plmkp1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。
5.本发明公开了荔枝霜疫霉一个新的未知蛋白基因plmkp1的功能，基因plmkp1为seq id no:1所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白plmkp1为seq id no:2所示的蛋白质。本发明应用基于聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)介导的原生质体转化技术与crispr/cas9敲除策略，通过构建pbssk::plmkp1、pyf2.3g-ribo-sgrna敲除载体并通过peg介导的原生质体转化，利用同源重组的方法将基因plmkp1从荔枝霜疫霉中敲除，获得敲除突变体；致病性测定结果表明，敲除突变体对荔枝嫩叶(品种：妃子笑)和荔枝果实(品种：怀枝)的致病力显著降低。上述试验证明，荔枝霜疫霉plmkp1基因为荔枝霜疫霉的致病相关基因。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.本发明提供基因plmkp1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。
8.其中，所述的荔枝霜疫霉基因plmkp1，其氨基酸序列如seq id no：2所示，或者是如seq id no：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有调控荔枝霜疫霉致病力功能的类似物；
9.所述的基因plmkp1，其核苷酸序列为下列a、b、c之一：
10.a、编码seq id no：2所示氨基酸序列的dna序列；
11.b、如seq id no：1所示的dna序列；
12.c、以上a和b通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有调控荔枝霜疫霉致病力功能的类似物。
13.本发明提供一种基因plmkp1具有调控荔枝霜疫霉合成相关基因表达水平的作用。
14.本发明提供一种基因plmkp1在防治荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病中的应用。
15.本发明再提供一种基因plmkp1作为用于植物病害防治的药物靶标的应用，所述的植物病害是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。
16.本发明再提供一种治疗和/或预防由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，是通过阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达实现的。
17.所述的阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达为利用基因plmkp1的反义rna或sirna阻断和/或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达。
18.本发明再提供一种阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1表达的药剂，包括阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达的成分。
19.所述的阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1表达的药剂，包括基因plmkp1的反义rna和/或sirna。
20.所述的阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1表达的药剂，用于控制由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。
21.含有上述荔枝霜疫霉基因plmkp1的敲除载体、重组菌在该方面的应用也属于本发明的保护范围。
22.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
23.本发明通过试验证明，将基因plmkp1的上下游序列分别扩增出来，与pbssk载体相连，同源重组后通过聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)介导的原生质体转化技术与crispr/cas9敲除策略进行敲除。因为基因plmkp1的缺失，所获得的突变体与野生型相比，荔枝霜疫霉致病力显著降低。本发明证实基因plmkp1是荔枝霜疫霉致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明荔枝霜疫霉的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。
附图说明
24.图1是荔枝霜疫霉plmkp1基因同源重组的构建示意图。
25.图2是荔枝霜疫霉plmkp1基因敲除转化子的pcr验证的琼脂糖凝胶电泳图；其中，wt：荔枝霜疫霉野生型；t31、t32、t45分别表示基因plmkp1的三个已敲除转化子。
26.图3是荔枝霜疫霉plmkp1基因敲除转化子的定量pcr扩增结果图。
27.图4是野生型wt、敲除突变体t31、t32、t45在ca培养基上菌落形态图。
28.图5是野生型wt、敲除突变体t31、t32、t45在ca培养基上的生长速率结果图。
29.图6是敲除突变体t31、t32、t45的叶片致病性实验结果照片图。
30.图7是敲除突变体t31、t32、t45的叶片致病性实验统计结果图。
31.图8是敲除突变体t31、t32、t45的果实致病性实验结果照片图。
32.图9是敲除突变体t31、t32、t45的果实致病性实验统计结果图。
具体实施方式
33.下面结合实际及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方法不限于此。
34.下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
35.试验材料：
36.供试菌株、植物与载体：
37.供试菌株为荔枝霜疫霉野生型菌株(peronophythora litchii，wild type，简称wt)为常规的疫霉菌，可通过商业途径或自然界分离获得，大肠杆菌(eschrichia coli)菌株dh5α，可通过商业途径得到；供试接种植物材料是荔枝(妃子笑)嫩叶和荔枝(怀枝)果实(采自华南农业大学园艺实习果园)；卵菌敲除及转化载体pyf2-psnls-hspcas9、pyf2.3g-ribo-sgrna(已在文献“yufeng,fang,linkai,et al.efficient genome editing in the oomycetephytophthora sojaeusing crispr/cas9[j].current protocols in microbiology,2017”中公开)、pbssk(已在文献“a crispr/cas9-mediated in situ complementation method for phytophthora sojae mutants[j].molecular plant pathology,2021,22(3)”中公开，以上载体均由南京农业大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室惠赠)。
[0038]
主要供试培养基：
[0039]
胡萝卜榨汁培养基(carrot agar，ca)(1l)：胡萝卜300g榨汁，纱布过滤，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.5％(w/v)琼脂粉。
[0040]
lb培养基(1l)：5g酵母提取物(yeast extract)，10g胰蛋白胨(tryptone)，10g氯化钠(nacl)，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.5％(w/v)琼脂粉。
[0041]
营养豌豆培养基(nutrition pea broth，npb)(1l)：新鲜豌豆120g加水煮20min后过滤。滤液中加入5g山梨醇(d-sorbitol)，5g甘露醇(d-mannitol)，5g葡萄糖，3g硝酸钾(kno3)，2g碳酸钙(caco3)，2g酵母提取物，1g磷酸氢二钾(k2hpo4)，1g磷酸二氢钾(kh2po4)，0.5g硫酸镁(mgso4)，0.1g氯化钙(cacl2)，2ml维生素混合液(vitamin stock)和2ml痕量元素(trace elements)，加ddh2o定容至1l，121℃，灭菌20min。固体培养基则另加入1.5％(w/v)difco bacto agar。
[0042]
豌豆甘露醇培养基(pea/0.5mol
·
l-1
manitol，pm)(1l)：新鲜豌豆120g，加水煮20min后过滤。滤液中加入91g d-mannitol，2g caco3和1.32g cacl2，加ddh2o定容至1l，121℃，灭菌20min。固体培养基则另加入1.5％(w/v)difco bacto agar。
[0043]
皮氏培养基(1l)：0.5g磷酸二氢钾，0.25g七水硫酸镁(mgso4·
7h2o)，1g l-天冬酰胺(l-asparagine)，1mg维生素b1(vitamin b1)，0.5g酵母提取物，10mgβ-谷甾醇(β-sitosterol)和25g葡萄糖，加入ddh2o定容至1l，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.5％(w/v)琼脂粉。
[0044]
实施例1crispr/cas9技术相关载体的构建
[0045]
(1)pyf2.3g-ribo-sgrna::plmkp1的构建
[0046]
根据设计sgrna网站(http://grna.ctegd.uga.edu/)，选择plmkp1基因上的靶向
rna(sgrna)，交由生工生物合成后，参照表1配制sgrna退火体系，金属浴37℃，30min。
[0047]
sgrna序列如下：
[0048]
plmkp1-sgrna1-f：
[0049]
ctagcacgtcactgatgagtccgtgaggacgaaacgagtaagctcgtctgacgtaggacagacttgag
[0050]
plmkp1-sgrna1-r：
[0051]
aaacctcaagtctgtcctacgtcagacgagcttactcgtttcgtcctcacggactcatcagtgacgtg
[0052]
plmkp1-sgrna2-f：
[0053]
ctagcaccccgctgatgagtccgtgaggacgaaacgagtaagctcgtccggggtaaagcggtgactga
[0054]
plmkp1-sgrna2-r：
[0055]
aaactcagtcaccgctttaccccggacgagcttactcgtttcgtcctcacggactcatcagcggggtg
[0056]
表1sgrna合成体系(takara)
[0057][0058]
随后在上述体系内加入4μl 0.5mol
·
l-1
nacl，混匀后于沸水浴煮沸2min，置于室温冷却3-4h，dna片段退火形成双链。
[0059]
plmkp1基因上的靶向rna(sgrna)退火形成双链，与酶切后pyf2.3g-ribo-sgrna载体(酶切体系见表2)用t4-dna连接酶连接，连接体系如表3，反应条件为16℃，4h，置于冰上冷却，随后进行大肠杆菌转化。
[0060]
表2pyf2.3g-ribo-sgrna载体双酶切体系(50μl)(neb)
[0061][0062]
表3pyf2.3g-ribo-sgrna载体与双链sgrna连接反应体系(10μl)(neb)
[0063][0064]
(2)pbssk::plmkp1载体的构建
[0065]
根据plmkp1基因上游、下游各约1kb的序列，设计扩增引物(plmkp1-left-f、plmkp1-left-r，plmkp1-right-f、plmkp1-right-r)。
[0066]
plmkp1-left-f：
[0067]
gaactagtggatcccccgcctccagctcagcaag
[0068]
plmkp1-left-r：
[0069]
ctgatgtactatacattatgacgtcttgcgattgatg
[0070]
plmkp1-right-f：
[0071]
atcaatcgcaagacgtcataatgtatagtacatcagtt
[0072]
plmkp1-right-r：
[0073]
atcgaattcctgcagcccagttttcttcgggctgttc
[0074]
用高保真酶phanta max super-fidelity dna polymerase(南京诺唯赞)进行pcr扩增，以荔枝霜疫霉基因组dna为模板扩增左右同源臂序列，具体pcr扩增体系如下表4：
[0075]
表4 phanta max高保真酶pcr扩增体系(50μl)
[0076][0077][0078]
扩增程序为：预变性95℃，3min，变性95℃，15s，退火56-72℃，15s，延伸72℃，30s/kb，进行34个循环，最后再延伸5min。目的条带经电泳检测后使用omega公司的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收，具体步骤参考试剂盒的说明书。将得到的产物plmkp1基因左右同源臂序列检测浓度后用定向无缝克隆试剂盒clonexpress one step cloning kit(南京诺唯赞)与线性化的pbssk载体(环状pbssk载体由smaⅰ限制性内切酶neb酶切，反应条件为25℃，2h。酶切后产物使用omega公司的pcr纯化试剂盒纯化回收)进行连接，连接体系如表5，得到pbssk::plmkp1。
[0079]
表5 pbssk::plmkp1载体连接反应体系(10μl)
kit)提取peg介导转化所需的3种质粒(pyf2-nls-hspcas9、pyf2.3g-ribo-sgrna::plmkp1、pbssk::plmkp1)
[0094]
实施例2荔枝霜疫霉原生质体的制备及peg介导的转化
[0095]
荔枝霜疫霉野生型菌株wt在营养豌豆固体平板培养基上活化。取菌丝块放入锥形瓶中，加入50ml npb液体培养基进行培养，共培养三瓶，于25℃黑暗培养3d，每隔12h摇晃一次。纱布过滤，收集菌丝，用镊子轻轻挤压后加入到含酶解液(酶解液的组成：称取0.15g溶壁酶(lysing enzymes，sigma)和0.06g纤维素酶(cellulase，sigma)于灭菌烧杯中，超净台内加入10ml 0.8mol
·
l-1
mannitol，8ml灭菌ddh2o，800μl 0.5mol
·
l-1
kcl，800μl 0.5mol
·
l-1
mes-koh和400μl 0.5mol
·
l-1
cacl2，充分溶解后转移至50ml离心管待用)的50ml离心管中，轻轻混匀后，25℃，40rpm，酶解40～45min。待菌丝酶解后，迅速用包有三层miracloth滤布的50ml烧杯过滤菌丝，并将滤液转移至50ml圆底离心管中，4℃，1500rpm离心3min。弃上清，加入10ml w5 solution(w5 solution的组成称取7.8g glucose，4.6g cacl2，2.25g nacl，0.093g kcl，加入ddh2o定容至250ml)重悬浮原生质体，再加入25ml w5 solution，上下颠倒轻轻混匀，4℃，1500rpm离心4min。弃上清，加入7ml w5 solution重悬浮原生质体，置于冰上放置30min。随后4℃，1500rpm离心4min，弃上清，加入6ml的mmg solution(mmg solution的组成：甘露醇18.22g、mgcl2·
6h2o 0.76g、mes buffer 2ml，加水定容至250ml)重悬浮原生质体，温室放置10min。
[0096]
取6支灭菌50ml离心管置于冰上，向每个离心管中加入3种质粒：pyf2-nls-hspcas9，pyf2.3g-ribo-sgrna::plmkp1，pbssk::plmkp1，各30μg，得到含原生质体的mmg solution。向每个50ml离心管中加入1ml含原生质体的mmg solution，轻轻摇晃混匀，置于冰上10min。沿管壁向每个离心管加入580μl 40％聚乙二醇(peg)溶液，连续加入3次。此过程中缓慢旋转离心管，使peg与原生质体混匀，冰上放置20min。豌豆甘露醇培养液(pm)中1000:1加入100mg
·
ml-1
氨苄抗生素得到amppm。离心管依次加入2ml amppm，轻轻上下颠倒，冰上放置2min；离心管依次加入8ml amppm，并轻轻上下颠倒，冰上放置2min；最后各个离心管中依次加入10ml amppm，并轻轻上下颠倒，倾斜放置。25℃下黑暗培养14～16h，使原生质体再生。过夜培养后，显微镜下观察原生质体再生情况，随后2000rpm离心5min。各离心管弃上清至剩余5ml液体培养基，悬浮沉淀后加入30ml含30μg
·
ml-1
遗传霉素g418的豌豆甘露醇固体培养基，颠倒混匀后倒入2个9cm灭菌培养皿中，25℃黑暗培养2～3d。挑取单菌落对其进行编号命名，用于鉴定。
[0097]
实施例3验证和测定
[0098]
(1)plmkp1基因敲除转化子的pcr琼脂糖凝胶电泳验证
[0099]
将荔枝霜疫霉野生型wt与转化子用ctab法进行基因组dna提取，以基因组dna为模板，设计基因组中plmkp1左右同源臂片段外的引物mkp1-out-f、mkp1-out-r分别进行常规pcr扩增。通过凝胶电泳检测条带大小，验证plmkp1是否成功敲除并送测序检测。
[0100]
mkp1-out-f：atcacgtaatggcaagcaaaaggagcaa
[0101]
mkp1-out-r：cgacaatgctttcttcatcctccgtagc
[0102]
实验结果如图2所示，测序结果证明，peg转化敲除成功，并获得3个plmkp1基因敲除转化子，依照转化子验证顺序从t1起进行编号，3个敲除成功的突变体分别命名为t31、t32、t45。
[0103]
(2)plmkp1基因敲除转化子的荧光定量分析验证
[0104]
将荔枝霜疫霉野生型wt与转化子的菌丝，用bbi公司的all-in-one dna/rna mini-preps kit试剂盒进行rna提取，利用天根的fastking cdna第一链合成试剂盒进行基因组dna去除和逆转录cdna合成，以plactin基因为内参基因设计定量引物plactin-f、plactin-r，以plmkp1基因的cds序列为目的基因设计定量引物plmkp1-qpcr-f、plmkp1-qpcr-r，通过使用sybr premix ex taq tm试剂盒(takara)进行实时荧光定量pcr，通过分析plmkp1基因的表达，验证plmkp1基因是否成功敲除。
[0105]
将荔枝霜疫霉野生型wt与转化子用ctab法进行基因组dna提取，以基因组dna为模板，设计基因组中plmkp1左右同源臂片段外的引物mkp1-out-f、mkp1-out-r分别进行常规pcr扩增并送测序检测。
[0106]
plactin-f：tcacgctattgttcgtctgg
[0107]
plactin-r：tcatctcctggtcgaagtcc
[0108]
plmkp1-qpcr-f：acgctctacctccactggat
[0109]
plmkp1-qpcr-r：tagtctctgtccgtctgcca
[0110]
mkp1-out-f：atcacgtaatggcaagcaaaaggagcaa
[0111]
mkp1-out-r：cgacaatgctttcttcatcctccgtagc
[0112]
测序结果证明，peg转化敲除成功，并获得三个与步骤(1)中相同的plmkp1基因敲除转化子t31、t32、t45。
[0113]
(3)敲除突变体生长速率的测定
[0114]
荔枝霜疫霉野生型wt菌株以及plmkp1基因敲除成功的突变体t31、t32、t45在无抗生素的ca平板转代2次，打孔取菌龄一致的9mm直径的wt和t31、t32、t45菌丝块，接种在15ml等量胡萝卜培养基平板(直径＝9cm)中央。设3个重复，25℃黑暗培养5d，测量菌落直径大小并计算生长速率并拍照。实验独立重复三次，用spss软件中的duncan’s multiple range test进行菌株间的差异显著性分析。
[0115]
生长速率(mm/d)＝第5天菌落直径/5天。
[0116]
(4)敲除突变体游动孢子嫩叶致病力测定
[0117]
取测定步骤(2)中转代培养得到的菌龄一致的9mm直径的wt和t31、t32、t45菌丝块，每组取5个置于2.5ml ddh2o中，用涡旋振荡器震荡1min，使孢子囊充分从孢囊梗脱落，获得孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液置于16℃培养箱静置使游动孢子释放，显微镜下计数稀释至10个游动孢子/μl。荔枝(品种为妃子笑)嫩叶经ddh2o浸泡后置于湿润滤纸上，每片嫩叶接种10μl游动孢子悬浮液，每个菌株重复接种10片叶龄相近嫩叶，于25℃保湿放置，48h后拍照并测量病斑直径。用spss软件中的duncan’s multiple range test进行差异显著性分析。
[0118]
(5)敲除突变体游动孢子果实致病力测定
[0119]
取测定步骤(2)中转代培养得到的菌龄一致的9mm直径的wt和t31、t32、t45菌丝块，每组取5个置于2.5ml ddh2o中，用涡旋振荡器震荡1min，使孢子囊充分从孢囊梗脱落，获得孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液置于16℃培养箱静置使游动孢子释放，显微镜下计数稀释至10个游动孢子/μl。荔枝(品种为怀枝)果实经ddh2o浸泡后置于湿润滤纸上，每片果实接种10μl游动孢子悬浮液，每个菌株重复接种10颗果实，于25℃保湿放置，48h后拍照并
测量病斑直径。用spss软件中的duncan’s multiple range test进行差异显著性分析。
[0120]
实施例4结果与分析
[0121]
(1)荔枝霜疫霉plmkp1基因重组片段的构建
[0122]
应用pcr技术分别克隆获得了plmkp1基因同源臂left、同源臂right序列片段，多片段连接至线性化pbssk载体，成功得到了pbssk::plmkp1载体；双链合成获得了sgrna，连接至线性化pyf2.3g-ribo-sgrna载体，成功得到了pyf2.3g-ribo-sgrna::plmkp1载体。敲除示意图如图1。
[0123]
(2)荔枝霜疫霉基因plmkp1敲除突变体的筛选
[0124]
将荔枝霜疫霉野生型wt与转化子用ctab法进行基因组dna提取，以基因组dna为模板，设计基因组中plmkp1左右同源臂片段外的引物mkp1-out-f、mkp1-out-r分别进行常规pcr扩增。通过凝胶电泳检测条带大小(图2)证明，peg转化敲除成功。
[0125]
用基因plmkp1的实时荧光定量pcr引物plmkp1-qpcr-f、plmkp1-qpcr-r，以及plactin基因为内参基因的实时荧光定量pcr引物plactin-f、plactin-r，通过实时荧光定量pcr，分析敲除转化子plmkp1基因的表达情况，结果显示，t31、t32、t45三个转化子均不能对plmkp1基因进行表达，说明t31、t32、t45为基因plmkp1的敲除转化子(图3)，测序结果证实确已敲除。
[0126]
(3)基因plmkp1敲除突变体生长速率的分析
[0127]
与荔枝霜疫霉野生型wt相比，敲除突变体t31、t32、t45在ca培养基中生长没有显著减慢(图4～5)。
[0128]
(4)基因plmkp1敲除突变体致病性分析
[0129]
与荔枝霜疫霉野生型wt相比，敲除突变体t31、t32、t45，在接种相同浓度游动孢子悬浮液后，病斑直径显著减小，证明基因plmkp1的缺失导致荔枝霜疫霉的致病力显著降低(图6～9)。
[0130]
因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。另外，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物靶标。本领域技术人员可以根据本说明书的指导与启示，开发用于防治植物病害、特别是荔枝霜疫病的药物。
[0131]
上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方案，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.基因plmkp1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用，其特征在于：所述的荔枝霜疫霉基因plmkp1，其氨基酸序列如seq id no：2所示，或者是如seq id no：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有调控荔枝霜疫霉致病力功能的类似物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因plmkp1具有调控荔枝霜疫霉合成相关基因表达水平的作用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因plmkp1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：所述的基因plmkp1，其核苷酸序列为下列a、b、c之一：a、编码seq id no：2所示氨基酸序列的dna序列；b、如seq id no：1所示的dna序列；c、以上a和b通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有调控荔枝霜疫霉致病力功能的类似物。5.一种权利要求1所述的基因plmkp1作为用于植物病害防治的药物靶标的应用，其特征在于：所述的植物病害是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。6.一种基因plmkp1在防治荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病中的应用，其特征在于：所述的植物病害是由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病。7.一种治疗由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，其特征在于：是通过阻断或抑制权利要求1所述基因plmkp1的表达实现的。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达为利用基因plmkp1的反义rna和/或sirna阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达。9.一种阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1表达的药剂，其特征在于：包括阻断或抑制荔枝霜疫霉中基因plmkp1的表达的成分。10.根据权利要求9所述的药剂，其特征在于：包括基因plmkp1的反义rna和/或sirna。

技术总结
本发明提供了一种基因PlMKP1在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用。本发明通过试验证明，将基因PlMKP1的上下游序列分别扩增出来，与PBSSK载体相连，同源重组后通过聚乙二醇介导的原生质体转化技术与CRISPR/Cas9敲除策略进行敲除。因为基因PlMKP1的缺失，所获得的突变体与野生型相比，荔枝霜疫霉致病力显著降低。本发明证实基因PlMKP1是荔枝霜疫霉致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明荔枝霜疫霉的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。基因。基因。


技术研发人员：孔广辉 宋雨 刘茜芫 李锐 周钢强 黄伟雄 习平根 李敏慧 姜子德
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/12