一种蜱的抗凝血蛋白Qinghaienin及其编码基因在抗凝血中的应用的制作方法

kskptatkspkkppktsdskatkkprsttt katrqpkatr skvpgpkpkt ttsntpatts etpgttkkpv nqdkmkpknpkkckskrrrr dknastqew（seq id no.1）。
7.本发明的抗凝血蛋白获自青海血蜱，命名为抗凝血蛋白qinghaienin。
8.本发明除了保护上述抗凝血蛋白qinghaienin，进一步地，本发明还应保护在上述蛋白的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；以及经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的抗凝血蛋白；或来源于青海血蜱且与抗凝血蛋白qinghaienin具有98％以上同源性且与抗凝血相关的蛋白质。
9.本发明第二个方面公开了编码上述蛋白质的核酸分子，其中编码抗凝血蛋白qinghaienin的核苷酸序列为：tacaagcaatcgatgcagacttttatgagtacgataactttctttgcgatggcaatccaaatcctggaaacagcactgttgaccactgcaattttcactgtgccccaaatggtactgaggattggcaaaataggcgccaccagaatgggacgaagtgcaagtctggcatttgtctaacaataaatgaacatgccaattgttacgacgaaagctctgaggcagcgaaggaatataggaatattacgaaatcaacgcttaaatcgccgaagagtaagccaactgctaccaaatcgccaaagaaaccaccgaaaaccagcgacagcaaagcgacgaaaaaaccaagatcgaccactaccaaggccacaaggcaaccgaaagcgacccgtagcaaagtaccaggtccgaagccgaaaacgaccaccagcaatacacctgcaacaaccagcgaaacacccgggaccaccaaaaaacctgttaatcaggataaaatgaaaccaaagaatccgaagaagtgcaaatcgaaacgtcgtcgtcgggacaaaaacgctagcacgcaagaatggtagccctcgtagcaaaacacatgaataaaatagttattttctggcaaaaaaagaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaagaaaaaaaaaaagaaaaaacaaaa（seq id no.2）。
10.上述核酸分子为青海血蜱的抗凝血蛋白编码基因hq021。本发明所公开的核苷酸序列属于首次公开，在现有技术的检索中未发现与其有相似性的同源序列。
11.在本发明中，本领域技术人员公知的是，由于蛋白质遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法（如pcr方法、突变方法）或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此，该部分核苷酸序列都应该包括在本发明保护范围内。
12.本发明利用本领域常用的报道基因与本发明的基因相连获得开放阅读框架。优选地，所述开放阅读框还包括启动子和/或增强子。
13.本发明第三个方面公开了一种包含上述青海血蜱抗凝血蛋白编码基因hq021的重组表达载体。
14.在本发明中，所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可以为重组表达载体。优选地，所述重组载体为重组表达载体。进一步优选地，所述重组表达载体选自重组原核表达载体中的任意一种。在本发明的一种优选的实施方式中，所述重组载体为将本发明提供的基因与原核表达载体pet30a连接构建得到的重组载体。
15.本发明第四个方面公开了一种包含上述重组表达载体的转基因细胞系。本发明还可以利用上述核酸分子构建重组质粒，在重组菌中进行表达。
16.在本发明中，所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。
17.在本发明中，所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株（如大肠杆菌感受态菌株rosetta(de3)）中而获得。
18.在本发明中，本发明对获得所述转基因细胞系或重组菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常规的选择，例如，可以通过氯化钙法化学转化或高压电击转化。
19.本发明第五个方面公开了一种抗凝血重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组表达质粒或重组质粒表达的。
20.本发明中的基因hq021是从蜱的唾液腺cdna文库中克隆得到的，基因序列长度为722bp, 基因序列含有一个长度为600bp（27位至626位）的开放阅读框架（orf），编码的氨基酸序列长度为199aa，理论分子量为22.16kda，等电点pi为9.79。将去掉信号肽后的编码序列与pet30a表达载体连接构建重组表达质粒，将质粒转化至大肠杆菌rosetta（de3），诱导表达获得重组蛋白qinghaienin。所表达的重组蛋白的羧基端引入了lehhhhhh纯化标签，该重组蛋白含有191个氨基酸残基，理论分子量为21.5kda, 等电点pi为9.84。以纯化的重组蛋白进行aptt实验，证实蜱抗凝血蛋白qinghaienin分子具有抗凝血生物活性，可用于制备抗凝血制剂。
21.本发明第六个方面公开了上述抗凝血蛋白的重组表达方法，包括以下步骤：构建含青海血蜱抗凝血蛋白qinghaienin编码基因序列的重组表达质粒；将所述重组表达质粒转化至大肠杆菌中，经诱导表达获得qinghaienin抗凝血重组蛋白。
22.本发明第七个方面公开了上述抗凝血蛋白、核酸分子、重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或抗凝血重组蛋白在制备抗凝血药物中的应用，所述抗凝血药物用于抑制血液的凝固性。
23.与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：本发明的青海血蜱抗凝血蛋白qinghaienin，经重组表达后获得抗凝血qinghaienin重组蛋白，将该蛋白与血浆混合孵育后，测定血浆激活的部分凝血活酶时间（aptt），该蛋白质能延长aptt时间。证实该重组蛋白具有抗凝血生物活性，非常适于制备抗凝血生物制剂。
附图说明
24.图1为目标基因片段pcr扩增产物电泳图。
25.图2为重组表达质粒构建图谱。
26.图3为诱导表达的目标蛋白及其纯化产物sds-page电泳图，其中m.标准分子量蛋白marker；1. 重组菌裂解液；2.纯化的目标蛋白。
27.图4为本发明中抗凝血蛋白延长aptt柱状图。
具体实施方式
28.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
29.实施例1
本实施例用于说明本发明提供的蛋白编码基因的克隆。
30.（1）以从青海血蜱cdna文库中所获阳性克隆hq021作为pcr反应的模板，用上游引物：gccatatggacttttatgagtacgat（seq id no.3）和下游引物：tactcgagccattcttgcgtgcta（seq id no.4）扩增目的基因片段的去信号肽编码区，琼脂糖电泳显示扩增产物与理论值562bp相符，见附图1。
31.（2）切胶回收纯化步骤（1）的pcr扩增产物，将纯化后的pcr产物克隆到pgem-t-easy载体（购于promega公司），构建重组克隆质粒。
32.（3）用步骤（2）的质粒转化大肠杆菌感受态细胞dh5
ɑ
（购自上海唯地生物公司）,并提取重组克隆质粒。
33.实施例2本实施例用于说明重组原核表达质粒的构建与表达。
34.（1）将实施例1步骤（3）获得的重组克隆质粒和原核表达载体pet30a(购于novagen公司)分别利用限制性内切酶nde i和xho i进行酶切，分别获得目的基因插入片段和线性化载体。
35.（2）将步骤（1）所获插入片段和线性化载体用t4连接酶（购于promega公司）连接，构建重组原核表达质粒pet30a-hq021（见附图2），用所构建质粒转化感受态细胞dh5
ɑ
,并提取重组表达质粒。
36.（3）将步骤（2）所提取的重组表达质粒送北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定，确认目的基因片段插入pet30a中。
37.（4）将步骤（3）经测序验证正确的重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞rosetta（de3）（购自上海唯地生物公司），经卡那霉素抗性筛选，挑取单克隆菌落，接种于lb液体培养基（含50μg/ml卡那霉素）中于37℃，200rpm振荡培养过夜，获得种子液。
38.（5）将步骤（4）所获种子液按1:100的比例接种于2
×
yt液体培养基中（含50μg/ml卡那霉素），在37℃，200rpm振荡培养至od600大约为0.6-0.8。
39.（6）向步骤（5）经培养的培养液中加入iptg，使iptg的终浓度达到0.1mmol/l，于26℃，200rpm，诱导表达10小时。将菌液于4℃，6000g离心10min，弃上清，收集沉淀。
40.实施例3本实施例用于说明重组蛋白的纯化。
41.（1）将实施例2步骤（6）所获重组菌沉淀充分重悬于结合缓冲液中（50mmol/l tris，500mmol/l nacl，30mmol/l 咪唑），用高压均质机裂解重组菌3轮至裂解液透亮。
42.（2）将步骤（1）所获重组菌裂解液于4℃，9400g离心30min，收集上清液，用0.45μm滤器过滤除去细胞碎片，滤液可直接上柱纯化。
43.（3）利用结合缓冲液平衡ni-nta agarose蛋白纯化柱（购于invitrogen公司），将步骤（2）经过过滤的细菌裂解液加到蛋白纯化柱上。
44.（4）用约10倍柱床体积的冲洗缓冲液（50mmol/l tris，500mmol/l nacl，80mmol/l 咪唑）冲洗柱子至吸光值近本底且不再降低。
45.（5）用洗脱液（50mmol/l tris，500mmol/l nacl，250mmol/l 咪唑）洗脱柱子，收集目的蛋白。
46.（6）使用12%的sds-page凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测目的蛋白。结果如附图3
所示。从附图3可以看出，重组菌株能够很好地表达目的蛋白，经纯化获得了高纯度的目的蛋白。
47.实施例4本实施例用于说明本发明重组蛋白的抗凝血功能验证。
48.（1）将实施例3步骤（6）所获重组蛋白稀释为不同浓度，与枸橼酸钠抗凝血浆按1：4体积比混合，使重组蛋白终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2μm，同时设蛋白保存缓冲溶液（50 mm tris ph 7.5、500 mm nacl）为空白对照，将血浆与蛋白稀释液混合物于37℃预孵育10min。
49.（2）用法国斯塔高诊断股份有限公司产的全自动凝血分析仪（star max，diagnostica stago）测定孵育后血浆的aptt、pt、tt，具体方法为凝固法。所用试剂为斯塔高公司的配套凝血试剂盒。
50.从附图4可以看出，终浓度为 1.6μm 的重组蛋白能将血浆的 aptt延长4倍（图4），但该重组蛋白不影响血浆的pt 和 tt。
51.实施例1-4的结果表明，本发明提供的重组蛋白在抗凝血方面具有良好的应用前景。
52.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
53.《110》 鄂尔多斯市中心医院（内蒙古自治区超声影像研究所）《120》 一种蜱的抗凝血蛋白qinghaienin及其编码基因在抗凝血中的应用《130》 l23050527f《160》 4《170》 patentin version 3.5《210》 1《211》 199《212》 prt《213》 青海血蜱（haemaphysalis qinghaiensis）《400》 1met val ile ile ala leu ile cys ser phe leu ile gln ala ile asp1
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24

技术特征：
1.一种蜱的抗凝血蛋白，其特征在于，所述抗凝血蛋白为青海血蜱的抗凝血蛋白qinghaienin，其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码权利要求1所述抗凝血蛋白qinghaienin的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如seq id no.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸分子。4.一种转基因细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体。5.一种抗凝血重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是由权利要求3所述的重组表达载体表达的。6.根据权利要求5所述的抗凝血重组蛋白，其特征在于，所述抗凝血重组蛋白的表达方法包括以下步骤：构建含青海血蜱抗凝血蛋白qinghaienin编码基因序列的重组表达质粒，所述青海血蜱抗凝血蛋白qinghaienin编码基因序列是编码seq id no .1所示氨基酸序列的核苷酸序列；将所述重组表达质粒转化至大肠杆菌中，经诱导表达获得qinghaienin抗凝血重组蛋白。7.如权利要求1所述抗凝血蛋白、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述转基因细胞或权利要求5所述重组蛋白在制备抗凝血制剂中的应用。8.根据权利要求7所述的抗凝血制剂，其特征在于，所述制剂用于抑制血液的凝固性。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，本发明提供了一种蜱的抗凝血蛋白Qinghaienin及其编码基因在抗凝血中的应用，该抗凝血蛋白为青海血蜱的抗凝血蛋白Qinghaienin，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还提供了青海血蜱抗凝血蛋白Qinghaienin的编码基因Hq021，该Hq021基因包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2。将该基因在大肠杆菌中进行表达，利用镍离子亲和层析树脂纯化获得了目标蛋白。将纯化的目标蛋白与血浆混合孵育，测定凝血指标，结果显示该抗凝蛋白能延长激活的部分凝血活酶时间（APTT）。该抗凝血蛋白适用于研制抗凝制剂。制抗凝制剂。制抗凝制剂。


技术研发人员：高金亮 折占飞 高东兵 陈开廷 贺晓菲 广慧 曹美娜 赵文斌 白梦蝶 杨寅冉 苏木雅 马林源
受保护的技术使用者：鄂尔多斯市中心医院（内蒙古自治区超声影像研究所）
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/7/12