一种可长期控制NGF&bFGF释放的肝素-透明质酸水凝胶及其制备方法与应用

一种可长期控制ngf&bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医学和组织工程领域，具体涉及一种可长期控制ngf&bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.中枢神经系统疾病或损害如阿尔茨海默症、脑卒中或脊髓损伤是导致人类长期残疾的主要原因之一。无论是阿尔茨海默症、脑卒中还是脊髓损伤都不能自发恢复，缺乏有效治疗的最根本原因就是患病或创伤局部神经元的死亡丢失，导致的相应功能的缺失。
3.近三十年余年的研究证明，在哺乳类包括人类在内的整个生命周期中，在脑和脊髓的特定区域都持续存在着多潜能的神经干/祖细胞（nscs / npcs），譬如成年脑的海马齿状回、脑室下区和脊髓的中央管附近区域，越来越多的证据证明内源性nsc / npc能在脑卒中、阿尔茨海默症或脊髓损伤后发挥替代、修复和保护的作用。但这些疾病或损伤很难自发恢复。这是因为中枢神经系统疾病或损伤后，病损部位的神经元死亡丢失的同时会发生强烈的炎性浸润，使病损部位的局部微环境变得非常恶劣，这就抑制了内源性神经干祖细胞的增殖及向神经元方向的分化，反而诱使神经干细胞向星形胶质细胞分化最终导致胶质瘢痕的形成，进一步抑制了脑或脊髓内新生成熟的神经元的产生与功能恢复。因此，如何调控病损局部的微环境，将局部恶劣的微环境改造成促神经元再生的良好环境，是当前医学界亟待解决的重要的问题之一。已有研究证明许多细胞因子，譬如神经营养因子（如ngf、bfgf、bdnf、nt-3 等）、一些肽类（如nogo-66多肽、硫酸软骨素蛋白abc酶等）都能促进中枢神经系统的发育与再生。但这些蛋白类细胞因子及肽类在生理环境中半衰期很短（数秒-数分钟），不易滞留在病损的局部保持其浓度以发挥作用且因分子量过大不易通过血-脑脊液屏障，这些导致了它们在临床的利用效率很低。
4.目前，通过生物凝胶填充成年哺乳类中枢神经（脑或脊髓）病损区是一种被广泛接受的治疗中枢神经系统损伤的干预手段。如中国专利cn 103623462a，公布了一种治疗脊髓损伤的透明质酸定向通道复合支架的制备和应用，所述透明质酸水凝胶接枝ngr抗体已封闭ngr阻断因髓鞘崩解产生抑制因子，通过聚乳酸聚乙醇酸共聚物（plga）包裹脑源性神经生长因子（bdnf）和血管内皮生长因子（vegf），将其添加至上述透明质酸水凝胶支架中，移植至脊髓损伤区，有效促进血管再生，促进神经再生。但其并未对上述两种细胞因子（bdnf、vegf）的控制释放动力学进行解析，此外该专利未对所述水凝胶与上述细胞因子的结合方式（如是物理结合、化学交联、还是光交联？，等等）进行约定和解释。中国专利cn112933293a提供了一种治疗中枢神经损伤的可注射水凝胶及其制备方法。所述可注射水凝胶为：以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸修饰过的多臂聚乙二醇-x 与多臂聚乙二醇
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y 通过点击化学反应得到用于病灶原位形成水凝胶支架的聚合物，所述聚合物还负载有纳米/微米粒子和细胞生长因子。该水凝胶能在正确的时间节点，在病灶部位精确缓释免疫调控药物抑制过度的炎症反应，保护残留神经组织或轴突，抑制囊性空腔和瘢痕组织的形成，并长时间地缓释细
胞生长因子，促进神经的再生，从而达到一种无瘢痕的组织愈合。但其也未对上述各种生长因子的控制释放周期等动力学进行分析，此外该专利未对所述水凝胶与上述细胞因子的结合方式（如是物理结合、化学交联、还是光交联？，等等）进行约定和解释。中国专利cn 1539514 a公布了一种具有生物活性的接枝层黏连蛋白的透明质酸水凝胶的制备方法。此发明在碳二亚胺盐酸盐的介导下将透明质酸与己二酸二酰肼进行交联制备出透明质酸水凝胶，在借助交联剂1，1
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碳基二咪唑将层黏连蛋白与透明质酸水凝胶接枝并冷冻干燥。该专利未对所述水凝胶与层黏连蛋白的结合方式（物理结合？化学交联？还是光交联？等等）及上述各种生长因子的控制释放周期等动力学进行分析约定和解释。


技术实现要素：

5.针对蛋白类的细胞因子在37℃时半衰期短，不易通过血-脑脊液屏障且不易固定于病灶局部发挥其生物学作用。本发明提供了一种可长期控制释放ngf&bfgf的可注射型的肝素-透明质酸水凝胶及其制备方法与应用，以治疗中枢神经疾病或损伤。根据病灶的病理生理动态变化特点，该水凝胶的力学性能（弹性模量）类似于脑或脊髓组织，能长期在病灶局部控制释放ngf和bfgf，保护并促进残留神经组织或轴突再生，促进新生神经元的产生，从而达到一种有效再生性愈合（非瘢痕性愈合）。本发明开发了一种可缓释细胞因子的可注射水凝胶体系，有望在临床上治疗中枢神经损伤或疾病。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种治疗中枢神经系统损伤及疾病的可长期控制ngf和bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶的制备方法，包括下述步骤：1）首先采用反相乳液聚合法通过自由基聚合反应制备出肝素纳米颗粒；2）利用所述肝素纳米颗粒与细胞因子之间的非共价可逆相互作用，将 ngf 和 bfgf 结合到所述肝素纳米颗粒中，得到负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒；其中，所述ngf代表神经生长因子；所述bfgf代表碱性成纤维细胞生长因子；3）制备透明质酸凝胶前体（ha-ac）；4）将步骤2）制备的负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒与步骤3）制备的透明质酸凝胶前体进行迈克尔加成反应，得到负载 ngf 和 bfgf 的肝素-透明质酸凝胶。
7.上述方法步骤1）中，所述肝素纳米颗粒的制备：因肝素分子缺乏双键官能团，故对肝素进行两步改性，使其获得双键，两步改性的原理如图1所示，具体步骤如下：（a1）使用碳二亚胺活化肝素上的羧基，使其与己二酸二酰肼（adipic dihydrazide, adh）的氨基反应生成酰胺键；（b1）将所述步骤（a1）得到的产物（he-adh）中的氨基与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯（acrylic acid-n-succinimide ester, nas）上的酯基反应，使得肝素侧链上带有双键，得到改性后的肝素单体；（c1）将所述步骤（b1）得到的改性后的肝素单体溶于 ph=4 的醋酸钠溶液中，然后加入n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)，超声混匀，形成水相溶液 a；将水相溶液 10 倍体积的己烷与乳化剂混合，快速搅拌，形成油相溶液 b；随后在不断搅拌下，将水相溶液 a 添加到油相溶液 b 中，形成预聚物乳液；然后向预聚物乳液中加入aps （过硫酸铵）水溶液（100 mg/ml），之后立即超声； 向上述溶液中加入等体积的乙醇，离心，倒掉上清液，再加乙
醇洗涤，离心，此操作重复三次；得到肝素纳米颗粒。
8.进一步的，所述步骤（a1）的改性方法具体如下：利用碳二亚胺法生成酰胺键，在酸性条件下，采用 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（1
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（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, edc）活化肝素上的羧基，使其与 adh 上的氨基反应，生成酰胺键。
9.更具体的方法如下：在室温、ph 值为4.75-5.5的pbs 缓冲液中，先用 edc 活化肝素上的羧基，再与adh进行反应；之后将反应后的溶液置于100mm的氯化钠溶液中透析 48-72小时，再于蒸馏水中透析72-96 小时（透析袋截留分子量（molecular weight cut off, mwco）=12-14kd）；透析后，将上述透析袋内保留的溶液冷冻干燥72-96小时，得到 he-adh。
10.上述步骤（a1）的改性方法中，所述反应的时间为12-18小时；所述肝素上的羧基与adh 的摩尔比可为 1:10。
11.进一步的，所述步骤（b1）的改性方法具体如下：室温环境下，将he-adh 溶于 ph值为7.2-7.4 的pbs 缓冲液中，与 nas反应，使得氨基和酯基反应生成酰胺键；之后将反应后的溶液置于100mm的氯化钠溶液中透析 48-72小时，再置于蒸馏水中透析72-96 小时（透析袋截留分子量（molecular weight cut off, mwco）=12-14kd）；透析后，将上述溶液冷冻干燥72-96小时，得到改性后的肝素单体。
12.上述步骤（b1）中，所述he-adh与nas的质量比为1000:3，所述反应的时间可为12-18小时。
13.进一步的，所述步骤（c1）的改性方法具体如下：将所述步骤（b1）得到的改性后的肝素单体溶于10ml ph=4 的醋酸钠溶液(100 mg/ml)中，然后加入 25 μl n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)，放在超声清洗机中超声 10分钟，超声清洗机功率 100%，形成水相溶液 a；将水相溶液 10 倍体积的己烷与乳化剂（所述乳化剂是span 80 和 tween 80质量比75:25的混合物，己烷与乳化剂的质量比为75:1）混合，快速搅拌，形成油相溶液 b；随后在不断搅拌下，将水相溶液 a 添加到油相溶液 b 中，形成预聚物乳液；然后向所述预聚物乳液中加入 10 μl 的 aps 水溶液（100 mg/ml），之后立即超声 2小时；向上述溶液中加入等体积的乙醇，以 6000 r/min 的转速离心 30 min 后，倒掉上清液，再加乙醇洗涤，离心，此操作重复三次；最后将离心收获的沉淀物溶于水，在 mwco=100 kd 的透析装置中透析 72 小时，并冷冻干燥72小时，得到肝素纳米颗粒。
14.对所述粒径300-350nm的肝素纳米颗粒的 zeta 电位表征，其 zeta 电位值是-35.3
±
1.9 mv。肝素纳米颗粒不仅带负电荷，而且电位值均在 30 mv 以上，这表明制备出的纳米颗粒体系都很稳定，不会聚结成团。
15.上述方法步骤2）中，所述肝素纳米颗粒通过特异性相互作用与 ngf和 bfgf结合；粒径均一、表面高负电荷的肝素纳米颗粒对带正电荷的 ngf和 bfgf有很强的亲和力，为确保反应过程最小程度地影响生长因子的结构，我们利用肝素纳米颗粒和细胞因子之间的非共价可逆相互作用，将 ngf 和 bfgf 结合到肝素纳米颗粒中。 ngf 和bfgf 与肝素相互作用的结构示意图如图 2所示。
16.具体制备方法如下：称取适量冻干好的肝素纳米颗粒粉末溶液水中，得到0.1
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0.3mg/ml 的肝素纳米颗粒溶液；0.22μm 滤膜过滤所述肝素纳米颗粒溶液，将滤过的肝素纳米颗粒溶液放置在 2-6℃备用；在 2-6℃环境下，分别将 ngf 和 bfgf溶解于上述滤过
且预冷的肝素纳米颗粒溶液中，使ngf 和 bfgf 的终浓度均为 20-50 μg/ml，得到了负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒的溶液，置于4℃备用。
17.上述方法步骤3）中，所述透明质酸凝胶前体（ha-ac）的制备需要两步改性，两步改性的原理如图3所示，具体步骤如下：（a2）利用碳二亚胺法生成酰胺键，在室温环境下，将透明质酸钠溶解于0.1m的 pbs 缓冲液中，搅拌至充分溶解后，再将adh 加入并搅拌至溶解，之后添加 edc、1-羟基苯并三唑（hobt）搅拌至溶解，最后在 ph值为4.75-5.5 的 pbs 缓冲液中进行反应；之后将反应完成后的溶液置于100mm的nacl 溶液中透析 72-120 小时，再于蒸馏水中透析 72-120小时（透析袋截留分子量 mwco=12-14kd）；透析后，将上述溶液冷冻干燥 72-120小时后，获得 ha-adh；（b2）利用氨基和酯键反应生成酰胺键，即将ha-adh中的氨基与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯（acrylic acid-n-succinimide ester, nas）上的酯基反应，将氨基转化为酰胺键，合成了 ha-ac。
18.上述步骤（a2）的改性方法中，所述透明质酸钠、adh 、edc、1-羟基苯并三唑（hobt）的质量比依次为0.5:9.0:1.0:0.2。所述反应的时间可为12-18小时；所述肝素上的羧基与adh 的摩尔比可为 1:10。
19.进一步的，所述步骤（b2）的改性方法具体如下：将ha-adh 溶于ph值为7.2-7.4的 pbs中，加入nas，充分混匀后室温反应，将氨基转化为酰胺键，合成了 ha-ac，将其置于100mm的 nacl 溶液中透析 72 小时，之后在蒸馏水中透析 72小时（透析mwco=12-14kd）以去除小分子杂质。
20.上述步骤（b2）中，所述ha-adh与nas的质量比为4:3，所述反应的时间可为12-18小时。
21.上述方法步骤4）的具体方法如下：透明质酸凝胶前体粉末、负载ngf&bfgf的肝素纳米颗粒以及二硫苏糖醇（dithiothreitol, dtt）在溶液（水）中37℃反应 30-60分钟成胶，制备出负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶。
22.其中，透明质酸凝胶前体粉末、ngf&bfgf的肝素纳米颗粒、二硫苏糖醇的质量比1.25: 23 : 0.05。
23.上述方法制备得到的负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶（即可长期控制ngf和bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶）也属于本发明的保护范围。
24.为了验证负载ngf&bfgf 肝素-透明质酸凝胶的生物活性，将其与成年大鼠鼠的背根神经节细胞（drg）共培养1-7天，检测其能否促进drg细胞的突起的生长。结果如图 4 所示。基础培养基组（cm）、一次性添加细胞因子组(sf)和负载细胞因子的肝素-透明质酸凝胶(gel)与drg共培养的第 1 天、第 3 天和第 7 天的神经突起长度如图4所示：三组drg细胞的突长度组间均有显著性差异，基础培养基组和共培养启始一次性添加细胞因子组的drg细胞突长度较短，负载细胞因子的肝素纳米颗粒组的神经突长度最长，且随着共培养时间的延长不断增长。
25.载有ngf 和 bfgf 的肝素-透明质酸凝胶的力学性能（即弹性模量），包括凝胶在内的生物材料支架需要具备与需修复的组织相似的力学性能。我们采用万能试验机对制得的肝素-透明质酸凝胶进行力学测试，结果如图5 所示。根据该曲线计算得出肝素-透明质
酸凝胶的弹性模量为10.84
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0.11 kpa，文献表明，虽然脑或脊髓组织弹性模量的测量值因测量方法和区域而异，但其弹性模量在几百pa 到几十kpa 之间 ，本发明测得的该凝胶的弹性模量处于脑或脊髓组织的弹性模量范围内（图5）。
26.载有ngf 和 bfgf 的肝素-透明质酸凝胶的释放动力学。采用 elisa 法测定肝素-透明质酸凝胶中 ngf 和 bfgf 在体外与神经干细胞共培养时的释放曲线。结果显示：ngf&bfgf 的释放曲线并没有像以往文献中所示，在一开始很短的时间内就出现突释现象，而是在共培养开始时间段（0-2d）释放相对缓慢，在第 3 天释放曲线斜率明显增加；之后，第 7 天以后又呈现出相对缓慢的释放；到第 21 天时，肝素-透明质酸凝胶累计释放量出的 ngf 和 bfgf 的浓度分别为 15.54
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1.52 ng/ml 和 14.39
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1.41 ng/ml。以上结果证明，肝素-透明质酸凝胶能够缓释 ngf 和 bfgf 至少21天（图6）。
27.载有ngf&bfgf 的肝素-透明质酸凝胶可促进成年脊髓损伤及脑损伤后的神经发生。将载有ngf&bfgf 的肝素-透明质酸凝胶分别移植至成年大鼠胸t7-8脊髓损伤区或脑皮层损伤区，术后连续一周向实验大鼠腹腔内注射brdu以标记增殖细胞的命运，以单损组及假手术组（sham）为对照，术后3个月，将上述实验大鼠过量麻醉致死后灌流取材及切片，借助免疫荧光化学技术并结合brdu染色，定量分析了脊髓损伤区或脑损伤区的neu n&brdu双阳性的细胞（新生成熟神经元的标志物）数量，结果证明：载有ngf&bfgf 的肝素-透明质酸可促进成年脊髓损伤及脑损伤后的神经发生（图7）。
28.本发明还保护上述载有ngf&bfgf 的肝素-透明质酸凝胶的应用。
29.所述应用是其在下述1）和/或2）中的应用：1）在制备用于中枢神经系统损伤及疾病治疗的产品中的应用；2）在制备重建或修复组织或器官缺损的产品中的应用；上述应用中，所述组织包括但不限于神经组织。
30.所述中枢神经系统损包括但不限于不同类型的脊髓损伤或脑损伤。
31.所述产品包括但不限于生物材料支架。
32.所述重建或修复组织或器官缺损具体体现在下述至少一方面：1）促进脊髓损伤及脑损伤后的神经发生；2）促进nsc 的存活、分化及突起的生长；3）激活内源性神经干细胞，募集其迁移至脑或脊髓损伤区。
33.有益效果：本发明开发了一种用于中枢神经系统损伤及疾病治疗的可长期控制ngf和bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶及其制备方法并具有以下效果：1）该凝胶的力学性能（弹性模量为10.84
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0.11 kpa）与脑或脊髓组织相匹配；2）该凝胶可缓释 ngf 和 bfgf 至少 3 周；3）该凝胶可促进nsc 的存活、分化及突起的生长；4）该凝胶可促进成年脊髓损伤及脑损伤后的神经发生。
附图说明
34.图1为肝素经过两步改性得到he-ac的合成流程图；图2为ngf 和bfgf 与肝素相互作用的结构示意图；其中，(a) ngf 的三维结构，可以与肝素相互作用的基本结构域显示为灰色；(b) bfgf 的三维结构，可以与肝素相互作用的基本结构域显示为黄色；
图3为ha-ac 的合成流程图；图4为drg 细胞突起长度的定量分析（*表示p ≤ 0.05）；图5为肝素-透明质酸系统的弹性模量；图6为肝素-透明质酸凝胶的释放动力学；图7为负载ngf&bfgf 的肝素-透明质酸凝胶可促进成年脊髓损伤及脑损伤后的神经发生；s：脊髓损伤区；b：脑损伤区；sham:假手术组；lc：单纯损伤组：gel：载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶移植组；3m：术后3个月。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
36.下述实施例中所使用的神经生长因子的通用名称是注射用鼠神经生长因子 (mouse nerve growth fact for injection)，商品名称是金路捷，生产厂家是中国武汉海特生物制药有限公司，购自于国药集团化学试剂有限公司，规格是20μg(9000au)/瓶。
37.下述实施例中所用的碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）的通用名称是外用重组人碱性成纤维细胞生长因子（recombinant human basic fibroblast growth factor for external use），生产厂家是中国北京双鹭药业股份有限公司，规格是35000iu/ 瓶。
38.下述实施例中所使用过的仪器设备等均可从市场购得或是本行业常用的。
39.实施例1：肝素纳米颗粒的制备在酸性条件下，采用 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（1
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（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, edc）活化肝素上的羧基，使其与 adh 上的氨基反应，生成酰胺键。在室温的pbs 缓冲液（ph= 4.75）中，用 edc（0.2g）活化肝素（1.0g）上的羧基，与3.0g adh（己二酸二酰肼）反应12-18小时，羧基与adh 的摩尔比为 1:10。之后将上述溶液置于100mm的氯化钠溶液中透析 48小时，再于蒸馏水中透析96 小时（透析袋截留分子量（molecular weight cut off, mwco）=12-14kd）。透析后，将上述溶液冷冻干燥96小时，得到 he-adh。
40.室温环境下，将10g he-adh 溶于 pbs 缓冲液（ph=7.4）中，与 0.3g nas反应3小时，使得氨基和酯基反应生成酰胺键，之后将上述溶液置于100mm的氯化钠溶液中透析 48小时，再置于蒸馏水中透析96 小时（透析袋截留分子量（molecular weight cut off, mwco）=12-14kd）。透析后，将上述溶液冷冻干燥96小时，得到得到改性后的肝素单体。
41.随后，将制得的改性后的肝素单体溶于 ph=4 的醋酸钠溶液(100 mg/ml)中，然后加入 25 μl n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)，放在超声清洗机中超声 10 min，超声清洗机功率 100%，形成水相溶液 a。 将水相溶液 10 倍体积的己烷与乳化剂（质量比是75:25的 span 80 和 tween 80 的混合物）混合，快速搅拌，形成油相溶液 b。
42.随后在不断搅拌下，将水相溶液 a 添加到油相溶液 b 中，形成预聚物乳液。然后向预聚物乳液中加入 10 μl 的 aps 水溶液（100 mg/ml），之后立即超声 2 h。向上述溶液中加入等体积的乙醇，以 6000 r/min 的转速离心 30 min 后，倒掉上清液，再加乙醇洗涤，离心，此操作重复三次。 最后将离心收获的沉淀物溶于水，在 mwco=100 kd 的透析装置中透析 72 小时，并冷冻干燥72小时天，得到肝素纳米颗粒。
43.对上述粒径300-350nm的肝素纳米颗粒进行 zeta 电位表征，其 zeta 电位值是-35.3
±
1.9 mv。肝素纳米颗粒不仅带负电荷，而且电位值均在 30 mv 以上。这提示制备出的纳米颗粒体系都很稳定，不会聚结成团。
44.实施例2：负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒的制备称取适量实施例1冻干好的肝素纳米颗粒粉末，溶于 10 ml 水中，超声 10 min，形成 0.1 mg/ml 的肝素纳米颗粒溶液。借助 0.22 μm 滤膜过滤上述肝素纳米颗粒溶液，将滤过的肝素纳米颗粒溶液放置在 4℃备用。 在 4℃环境，分别将 ngf 和 bfgf溶解于上述滤过且预冷的肝素纳米颗粒溶液中。使ngf 和 bfgf 的终浓度均为 20-50 μg/ml。将结合了 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒溶液放于 4℃备用。肝素纳米颗粒通过静电作用结合 ngf 和 bfgf，可以保护生长因子避免被酶降解等，从而达到长时间缓释生长因子的效果。
45.实施例3：透明质酸前体（ha-ac）粉末的制备第1步改性：利用碳二亚胺法生成酰胺键，即在室温环境下，称取 0.5 g 透明质酸钠溶解于100ml的0.1m的 pbs 缓冲液中，搅拌至充分溶解后，再将9.0 g adh 加入并搅拌至溶解，之后添加 1.0 g edc、0.2 g 1-羟基苯并三唑（hobt）搅拌至溶解，最后在 ph：4.75-5.5 的 pbs 缓冲液中反应过夜。反应完成后置于100mm的 nacl 溶液中透析 72 小时，之后在蒸馏水中透析 72小时（透析袋 mwco=12-14kd）。将上述溶液冷冻干燥 72小时后，获得 ha-adh；第2步改性：利用氨基和酯键反应生成酰胺键，即将上述 ha-adh 溶于ph：7.2-7.4的 pbs中，加入nas（质量比 m ha-adh : m nas=4 : 3 ），充分混匀且该反应在室温下过夜，将氨基转化为酰胺键，合成了 ha-ac，将其置于100mm的 nacl 溶液中透析 72 小时，之后在蒸馏水中透析 72小时（透析mwco=12-14kd）以去除小分子杂质,然后将去除杂质的甚于物质冷冻干燥72-96小时，得到透明质酸前体粉末(ha-ac)。
46.实施例4：负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶的合成：透明质酸凝胶前体粉末、ngf&bfgf的肝素纳米颗粒以及二硫苏糖醇（dithiothreitol, dtt）在水中37℃反应 30-60 min 成胶，制备出负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶。
47.其中，透明质酸凝胶前体粉末、ngf&bfgf的肝素纳米颗粒、二硫苏糖醇的质量比1.25 : 23: 0.05。
48.实施例5：（一）负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶的生物活性检测：将负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶与成年大鼠的背根神经节细胞（drg）共培养1-7天，检测其能否促进drg细胞的突起的生长。
49.具体实验操作方法可参照下述文献：yang z, duan h, mo l, et al. the effect of the dosage of nt-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells[j]. biomaterials, 2010, 31(18):4846.
[0050]
结果见图4。基础培养基组（cm）、细胞因子组(sf，20ng/ml)和负载ngf&bfgf的肝素-透明质酸凝胶(gel，20ng/ml)组与drg共培养的第 1 天、第 3 天和第 7 天的神经突起长度如图4所示：三组drg细胞的突长度组间均有显著性差异，基础培养基组的drg细胞突长度最短；负载ngf&bfgf的肝素-透明质酸凝胶组的神经突长度最长，且随着共培养时间的延
长不能增长。
[0051]
（二）肝素-透明质酸系统的力学性能（即弹性模量）包括凝胶在内的生物材料支架需要具备与所需修复的组织相似的力学性能，我们采用万能试验机对制得的负载ngf&bfgf的肝素-透明质酸凝胶进行力学测试（图5）。使用万能试验机检测 3 个样本，每个样本测量 3 次。万能试验机参数设置：压缩应变为 0%
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10%，压缩速度为 1 mm/min。得出肝素-透明质酸凝胶的弹性模量为10.84
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0.11 kpa，文献表明，虽然脑或脊髓组织弹性模量的测量值因测量方法和区域而异，但其弹性模量在几百pa 到几十kpa 之间，本发明测得的该凝胶的弹性模量处于脑或脊髓组织的弹性模量范围内（见图5）。
[0052]
（三）负载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶的释放动力学：采用 elisa 法测定肝素-透明质酸凝胶中 ngf 和 bfgf 在体外与原代培养的wiatar大鼠脑源性的神经干细胞共培养时的释放曲线。
[0053]
结果见图6。由图6可知，ngf&bfgf 的释放曲线并没有像以往文献中所示，在一开始很短的时间内就出现突释现象，而是在共培养开始时间段（0-2d）释放相对缓慢，在第 3 天释放曲线斜率明显增加；之后，第 7 天以后又呈现出相对缓慢的释放；到第 21 天时，肝素-透明质酸凝胶累计释放量出的 ngf 和 bfgf 的浓度分别为 15.54
ꢀ±ꢀ
1.52 ng/ml 和 14.39
ꢀ±ꢀ
1.41 ng/ml。以上结果证明，肝素-透明质酸凝胶能够缓释 ngf 和 bfgf 至少21天（图6）。
[0054]
（四）负载ngf&bfgf 的肝素-透明质酸凝胶可促进成年脊髓损伤及脑损伤后的神经发生通过体内植入（分别植入脊髓损伤区或脑皮层损伤区）实验，评价植入载ngf&bfgf肝素-透明质酸凝胶半年时，定量分析其在激活内源性神经干细胞（nsc）,募集其迁移至损伤区分化为成熟神经元的效果（图7）。
[0055]
该体内植入实验的具体操作方法可参考下述文献：1 .yang z, zhang a, duan h, et al. nt3-chitosan elicits robust endogenous neurogenesis to enable functional recovery after spinal cord injury[j]. proceedings of the national academy of sciences of the united states of america （ pnas ） , 2015, 112(43):13354-13359.2 . duan h, li x, cong w, et al. functional hyaluronate collagen scaffolds induce nscs differentiation into functional neurons in repairing the traumatic brain injury[j]. acta biomaterialia, 2016, 45:182-195.brdu/neun新生神经元的定量分析：取术后特定时间的包括损伤区在内的恒冷箱切片样品，进行免疫荧光细胞化学染色。为了定量双阳性细胞，所有染色的样本进行激光共聚焦显微镜的顺序扫描。高倍镜下手动全 z 轴检测每一个 brdu
+
细胞，只有与特定目的蛋白标记物共标记的细胞记为双阳性细胞。细胞数表示为：个/mm2。所有数据以均数
±
标准差表示，spss 用于统计分析，借助shapiro
–
wilk 方法检测数据的正态分布情况，借助levene 检测数据的方差齐性，借助单因素方差分析比较多组间的统计学差异，p《0 .05 认为有统计学差异。
[0056]
将2mg的 载有ngf&bfgf 的肝素-透明质酸凝胶分别移植至成年大鼠胸t7-8脊髓
损伤区（简称s）或脑皮层损伤区（简称b），术后连续一周向实验大鼠腹腔内注射brdu以标记增殖细胞的命运，以单损组及假手术组（sham）为对照，术后3个月，将上述实验大鼠过量麻醉致死后灌流取材及切片，借助免疫荧光化学技术并结合brdu染色，定量分析了脊髓损伤区或脑损伤区的neun&brdu双阳性的细胞（新生成熟神经元的标志物）数量，结果证明：载有ngf&bfgf 的肝素-透明质酸可促进成年脊髓损伤及脑损伤后的神经发生（图7）。

技术特征：
1.一种可长期控制ngf和bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶的制备方法，包括下述步骤：1）首先采用反相乳液聚合法通过自由基聚合反应制备出肝素纳米颗粒；2）利用所述肝素纳米颗粒与细胞因子之间的非共价可逆相互作用，将 ngf 和 bfgf 结合到所述肝素纳米颗粒中，得到负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒；其中，所述ngf代表神经生长因子；所述bfgf代表碱性成纤维细胞生长因子；3）制备透明质酸凝胶前体粉末；4）将步骤2）制备的负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒与步骤3）制备的透明质酸凝胶前体进行迈克尔加成反应，得到负载 ngf 和 bfgf 的肝素-透明质酸水凝胶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述肝素纳米颗粒的制备步骤具体如下：（a1）使用碳二亚胺活化肝素上的羧基，使其与己二酸二酰肼的氨基反应生成酰胺键，得到产物he-adh；（b1）将所述步骤（a1）得到的产物he-adh中的氨基与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯上的酯基反应，使得肝素侧链上带有双键，得到改性后的肝素单体；（c1）将所述步骤（b1）得到的改性后的肝素单体溶于 ph=4 的醋酸钠溶液中，然后加入n,n,n',n'-四甲基乙二胺，超声混匀，形成水相溶液 a；将水相溶液 10 倍体积的己烷与乳化剂混合，快速搅拌，形成油相溶液 b；随后在不断搅拌下，将水相溶液 a 添加到油相溶液 b 中，形成预聚物乳液；然后向预聚物乳液中加入过硫酸铵水溶液，之后立即超声；向上述溶液中加入等体积的乙醇，离心，倒掉上清液，再加乙醇洗涤，离心，此操作重复三次，得到肝素纳米颗粒。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a1）的改性方法具体如下：在室温、ph 值为4.75-5.5的pbs 缓冲液中，先用 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化肝素上的羧基，再与己二酸二酰肼进行反应；之后将反应后的溶液置于100mm的氯化钠溶液中透析 48-72小时，再于蒸馏水中透析72-96 小时，透析袋截留分子量=12-14kd；透析后，将上述溶液冷冻干燥72-96小时，得到产物he-adh。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a1）的改性方法中，所述反应的时间为12-18小时；所述肝素上的羧基与己二酸二酰肼的摩尔比为 1:10。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b1）的改性方法具体如下：室温环境下，将所述步骤（a1）得到的产物he-adh溶于 ph值为7.2-7.4 的pbs 缓冲液中，与 丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯反应，使得氨基和酯基反应生成酰胺键；之后将反应后的溶液置于100mm的氯化钠溶液中透析 48-72小时，再置于蒸馏水中透析72-96 小时，透析袋截留分子量=12-14kd；透析后，将上述溶液冷冻干燥72-96小时，得到改性后的肝素单体。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b1）的改性方法中，所述he-adh与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯的质量比为1000:3，所述反应的时间为12-18小时。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（c1）的改性方法具体如下：将所述步骤（b1）得到的改性后的肝素单体溶于10ml ph=4 的醋酸钠溶液中，使其浓度为100 mg/ml，然后加入 25 μl n,n,n',n'-四甲基乙二胺，放在超声清洗机中超声 10 分钟，超声清洗机功率 100%，形成水相溶液 a；将水相溶液 10 倍体积的己烷与乳化剂混合，快
速搅拌，形成油相溶液 b；随后在不断搅拌下，将水相溶液 a 添加到油相溶液 b 中，形成预聚物乳液；然后向所述预聚物乳液中加入 10 μl 的浓度为100 mg/ml 的过硫酸铵水溶液，之后立即超声 2 小时；向上述溶液中加入等体积的乙醇，以 6000 r/min 的转速离心 30 min 后，倒掉上清液，再加乙醇洗涤，离心，此操作重复三次；最后将离心收获的沉淀物溶于水，在截留分子量=100 kd 的透析装置中透析 72 小时，并冷冻干燥72小时，得到肝素纳米颗粒；所述乳化剂是span 80 和 tween 80质量比75:25的混合物；所述己烷与所述乳化剂的质量比为75:1。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）的具体制备方法如下：称取肝素纳米颗粒粉末溶液水中，得到0.1-0.3mg/ml 的肝素纳米颗粒溶液；0.22μm 滤膜过滤所述肝素纳米颗粒溶液，将滤过的肝素纳米颗粒溶液放置在 2-6℃备用；在 2-6℃环境下，分别将 ngf 和 bfgf溶解于上述滤过且预冷的肝素纳米颗粒溶液中，使ngf 和 bfgf 的终浓度均为 20-50 μg/ml，得到了负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒的溶液，置于4℃备用。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述透明质酸凝胶前体的制备需要两步改性，具体步骤如下：（a2）利用碳二亚胺法生成酰胺键，在室温环境下，将透明质酸钠溶解于0.1m的 pbs 缓冲液中，搅拌至充分溶解后，再将己二酸二酰肼加入并搅拌至溶解，之后添加 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑搅拌至溶解，最后在 ph值为4.75-5.5 的 pbs 缓冲液中进行反应；之后将反应完成后的溶液置于100mm的nacl 溶液中透析 72-120 小时，再于蒸馏水中透析 72-120小时，透析袋截留分子量=12-14kd；透析后，将上述溶液冷冻干燥 72-120小时后，获得 ha-adh；（b2）利用氨基和酯键反应生成酰胺键，即将ha-adh中的氨基与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯上的酯基反应，将氨基转化为酰胺键，合成了 ha-ac，即透明质酸凝胶前体。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a2）的改性方法中，所述透明质酸钠、己二酸二酰肼、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑的质量比依次为0.5:9.0:1.0:0.2；所述反应的时间为12-18小时；所述透明质酸钠上的羧基与adh 的摩尔比为 1:10。11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b2）的改性方法具体如下：将ha-adh 溶于ph值为7.2-7.4的 pbs中，加入丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯，充分混匀后室温反应，将氨基转化为酰胺键，合成了 ha-ac，将其置于100mm的 nacl 溶液中透析 72 小时，之后在蒸馏水中透析 72小时，透析袋截留分子量mwco=12-14kd，以去除小分子杂质。12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b2）中，所述ha-adh与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯的质量比为4:3，所述反应的时间为12-18小时。13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4）的具体方法如下：将透明质酸凝胶前体粉末、负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒以及二硫苏糖醇在水中37℃反应 30-60 分钟成胶，制备出负载 ngf 和 bfgf 的肝素-透明质酸水凝胶；其中，所述透明质酸凝胶前体粉末、负载 ngf 和 bfgf 的肝素纳米颗粒、二硫苏糖醇的质量比1.25 : 23 : 0.05。
14.权利要求1-13中任一项所述方法制备得到的可长期控制ngf和bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶。15.权利要求14所述的可长期控制ngf和bfgf释放的肝素-透明质酸水凝胶的应用：1）在制备用于中枢神经系统损伤及疾病治疗的产品中的应用；2）在制备重建或修复组织或器官缺损的产品中的应用。16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述组织包括神经组织；所述中枢神经系统损包括不同类型的脑或脊髓损伤；所述产品包括生物材料支架；所述重建或修复组织或器官缺损具体体现在下述至少一方面：1）促进脊髓损伤及脑损伤后的神经发生；2）促进内源性神经干细胞的存活、分化及突起的生长；3）激活内源性神经干细胞，募集其迁移至脑或脊髓损伤区。

技术总结
本发明公开了一种可长期控制NGF&bFGF释放的肝素-透明质酸水凝胶及其制备方法与应用。本发明首先制备了肝素纳米颗粒；再通过特异性相互作用将NGF&bFGF加载至肝素纳米颗粒；将加载了细胞因子的肝素纳米颗粒与透明质酸凝胶前体借助迈克尔加成反应制造出加载了NGF&bFGF的肝素-透明质酸凝胶。本发明的肝素纳米颗粒呈球形、分散性良好、粒径可控且分布均一、表面带负电荷；加载了NGF&bFGF的肝素-透明质酸水凝胶可显著促进了背根神经节细胞突起的生长、分化。其弹性模量与脑或脊髓组织相匹配，可以在体外缓释NGF&bFGF至少3周；该水凝胶可明显促进脑卒中或脊髓损伤区内产生新生的神经元。的神经元。的神经元。


技术研发人员：李晓光
受保护的技术使用者：首都医科大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/7/12