一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法

1.本发明属于药物分析技术领域，涉及一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法。


背景技术：

2.艾草（artemisia argyi l
é
vl.et vant.），又称艾蒿、陈艾等，是一种菊科蒿属植物，在中国已有3000余年应用历史，始载于战国时期的《五十二病方》，《黄帝内经》“臟寒生满病。其治宜艾焫
”ꢀ
也叙述了艾草的作用。东汉张仲景的《伤寒论》用艾叶配阿胶、芍药、川芎、当归、干地黄、侧柏叶所组成的胶艾汤和柏叶汤，主治官冷不孕及吐血不止。《蕲艾传》、《本草纲目》中载艾叶配方52个。艾草广泛分布于亚洲、欧洲和北美，因其巨大的经济和健康效益被称为“草中钻石”。尤其在中国，艾草是中国植物药材的重要组成部分，具有历史悠久，药用价值高等优势。
3.艾叶作为艾草的干燥叶已被收录到2020年版的《中国药典》中。目前，中国国内主要以蕲艾最为出名，被广泛用于制作艾绒。艾绒是艾草经过晒干捣碎得到的软细如棉的艾草纤维，将其作为主要原材料可加工成艾灸。而脱绒艾草则是指艾草脱去艾绒之后的主要副产品，又称“艾粉”，其富含艾草中大量的非挥发性成分，比如黄酮类、有机酸类、苯丙素类、萜类和多糖类等，具有丰富的营养价值和开发利用潜力大等特点。但市面上因脱绒艾草产量巨大，深加工不足，常被大多数工厂所丢弃，造成资源的极大浪费。如何实现脱绒艾草资源的“废物”利用，是目前艾草行业的一大产业难题。
4.随着饲料禁抗的全面实施，脱绒艾草直接或者提取黄酮等活性物质后用于畜牧养殖改善畜禽生长性能，这成为脱绒艾草开发的热点。为保证脱绒艾草的有序开发，脱绒艾草全面、有效、系统的质量评价方法和标准控制是必不可少的。
5.《中国药典》2020版中规定了艾叶的质量控制指标和方法，但是对于脱去艾绒的部分，控制挥发油成分不适用于脱绒艾草的质量评价，而且目前还未见脱绒艾草质量控制的相关报道。因此，制定能够全面、快速控制脱绒艾草样品的质量控制方法是目前急需解决的问题，也是脱绒艾草资源重复开发利用的重要基础。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，以能够重现性和稳定性好、准确性高、检测成本低、检测效率高的进行脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测，从而为脱绒艾草相关产品的质量控制方法的建立奠定基础。
7.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：（1）精密称取脱绒艾草样品，加入提取溶液进行提取，离心取上清，得供试品溶液；（2）将供试品溶液用高效液相色谱法进行检测，所述的高效液相色谱法的具体检测条件如下：
色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；检测波长：270-400 nm；柱温：30-45 ℃；流速：0.5-1.5 ml/min；进样量：5-30 μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b。
8.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（1）中，所述的脱绒艾草样品选自艾草干燥制作艾绒后剩余的副产品，以及该副产品的提取物、含该副产品的食品添加剂、含该副产品的饲料添加剂中的一种或者多种。
9.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（1）中，精密称取脱绒艾草样品后先破碎，再加入提取溶液进行提取。
10.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（1）中，所述的提取溶液为体积百分比浓度为10-100%的甲醇或乙醇的水溶液，优选体积百分比浓度为70%的甲醇的水溶液。
11.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（1）中，所述的提取的温度为25-45 ℃，时间为10-100 min，优选60 min。
12.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（1）中，脱绒艾草样品与提取溶液的质量体积比为1:5-500，优选1:10-250，更优选1:50。
13.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（1）中，在提取时还进行超声波震荡。
14.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（2）中，所述的色谱柱的尺寸为4.6
×
250 mm，填料颗粒平均粒度为5 μm。
15.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中步骤（2）中，所述的检测波长为326 nm，所述的柱温为40℃，所述的流速为1.0 ml/min，所述的进样量为10 μl。
16.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中所述的特征图谱至少包括11个共有特征峰，与对照脱绒艾草样品中的11个共有特征峰的保留时间相对应，其中峰8设为s峰，计算峰1～峰7、峰9～峰11与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.32(峰1)、0.48(峰2)、0.49(峰3)、0.54(峰4)、0.71(峰5)、0.93(峰6)、0.96(峰7)、s（峰8）、1.13(峰9)、1.26(峰10)、1.38(峰11)。
17.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其中脱绒艾草样品的特征图谱按保留时间顺序的11个峰中，峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰3为咖啡酸、峰4为隐绿原酸、峰5为夏佛塔苷、峰6为异绿原酸b、峰7为异绿原酸a、峰8为异绿原酸c、峰10为棕矢车菊素、峰11为异泽兰黄素。
18.本发明的有益效果在于，利用本发明的脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，能够重现性和稳定性好、准确性高、检测成本低、检测效率高的进行脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测，从而为脱绒艾草相关产品的质量控制方法的建立奠定基础。
19.本发明建立了一套快速、全面、专属性强的脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，该方法操作简便，适用范围广，为脱绒艾草样品质量控制如脱绒艾草副产品，脱绒艾草提取物及相关的食品添加剂、保健品和饲料添加剂等相关产品的质量控制提供了新的分析手段。
20.本发明的方法经过方法学验证，重现性和稳定性好，检测成本低，检测效率高，为规范脱绒艾草相关的生产和检测提供了重要保障。
21.本发明采用超高液相色谱法，相比于薄层色谱法和紫外分光光度法等，更加快捷、有效且专属性更强，更有利于脱绒艾草等的产业化应用。
22.且本发明对色谱条件进行合理优化，建立了脱绒艾草样品的特征图谱、含量测定方法的组合。特征图谱属于定性方法，人为干扰较少，检测灵敏度较高，对脱绒艾草及相关产品的整体概貌、有效成分可进行全面控制，确保产品质量的有效性和安全性。
23.且本发明首次对脱绒艾草的质量标准进行了全面研究，首次建立了符合脱绒艾草整体特性要求的特征图谱，构建了含有11个特征峰的特征图谱，指认了10个共有峰分别是：新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、夏佛塔苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c、棕矢车菊素、异泽兰黄素。
附图说明
24.图1为不同检测波长下的检测图谱。
25.图2为不同色谱柱条件下的高效液相色谱检测图谱。
26.图3为不同梯度洗脱条件下的高效液相色谱检测图谱（自上至下的六张图分别为梯度1至梯度6洗脱所得高效液相色谱检测图谱）。
27.图4为29批不同产地的脱绒艾草样品的高效液相色谱检测图谱叠加图。
28.图5为用本发明确定的最佳检测方法检测所得到的脱绒艾草的典型高效液相色谱特征图谱。
具体实施方式
29.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
30.下述实施例中用到的仪器及试剂如下：agilent-1260高效液相色谱仪；ptx
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fa210s分析天平（福州市华志电子科技有限公司）；avanti j-26s xp高速冷冻离心机（美国beckmancoulter）；kq-500de数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；乙腈（色谱纯，macklin公司）；甲醇（色谱纯thermo fisher公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
31.实施例1高效液相色谱条件的建立脱绒艾草对照品提取液的制备在湖北与河南两省份采集29批不同的脱绒艾草样品（见表8），每个样品取10 g，等质量混合均匀作为脱绒艾草对照品。取脱绒艾草对照品0.2 g，精密加入体积百分比浓度为50%的甲醇提取溶液20 ml, 室温下超声提取15 min，12000 rpm离心15 min，收集上清，
0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，获得脱绒艾草对照品提取液，上机待测。
32.检测波长的确定高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；柱温：45 ℃；流速：0.5 ml/min；进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-15 min，5%~10% b；15-20 min，10%~20% b；20-50 min，20%~25% b；50-55 min，25%~30% b；55-60 min，10% b。采集脱绒艾草对照品提取液在270
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400 nm波长范围内3d色谱图，如图1所示。结果表明，在326 nm波长下色谱峰的个数较多，基线平稳，因此选用326 nm作为检测波长。
33.色谱柱考察在高效液相色谱条件为，流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；检测波长：326 nm；柱温：45 ℃；流速：0.5 ml/min；进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-15 min，5%~10% b；15-20 min，10%~20%b；20-50 min，20%~25% b；50-55 min，25%~30%b；55-60 min，10% b时，评价不同色谱柱：shimadzu c18 hss (250 mm
×
4.6 mm, 5 μm)、waters c18（250 mm
×
4.6 mm，5 μm)、zorbax sb-aq (250 mm
×
4.6 mm，5 μm) 对脱绒艾草对照品提取液的分离效果，记录相应色谱图，结果见图2。结果表明，不同色谱柱对各特征峰的相对保留时间影响相对较大，shimadzuc18 hss (250 mm
×
4.6 mm，5 μm) 色谱柱对各特征峰的分离效果最好。
34.洗脱条件的优化在高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；检测波长：326 nm；柱温：45 ℃；流速：0.5 ml/min；进样量：10μl时，按下表1中的不同线性梯度洗脱，评价不同的洗脱条件对脱绒艾草对照品提取液的分离效果，不同线性梯度洗脱条件分离效果见图3。
35.表1 不同的线性梯度洗脱条件
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图3结果表明，梯度6的分离效果较好，基线平稳，峰形对称，因此，选择梯度6的洗脱条件进行后续研究。
36.柱温考察在高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；流速：0.5 ml/min；检测波长：326 nm; 进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b时，考察30
°
c、35
°
c、40℃三个柱温温度对脱绒艾草对照品提取液的分离效果，记录色谱图特征峰保留时间并计算相对保留时间（色谱图中共有至少11个特征峰，它们的保留时间与脱绒艾草样品中的11个特征峰的保留时间相对应相同，其中将按保留时间从小到大的峰8设为s峰，计算峰1～峰7、峰9～峰11与s峰的相对保留时间，它们应在规定值的
±
10％范围之内，规定值分别为：0.32(峰1)、0.48(峰2)、0.49(峰3)、0.54(峰4)、0.71(峰5)、0.93(峰6)、0.96(峰7)、1.13(峰9)、1.26(峰10)、1.38(峰11)），结果见下表2。
37.表2 柱温考察结果
表2结果表明，柱温40℃时样品测定结果的相对保留时间最符合要求，耐用性好。
38.流速考察在高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；柱温：40℃；检测波长：326 nm; 进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b时，考察0.5 ml/min、0.6 ml/min、0.8 ml/min、1.0 ml/min四个流速，分别记录特征峰保留时间，结果见表3。
39.表3 流速考察结果表3结果表明，流速在1.0 ml/min时样品测定结果的相对保留时间最符合要求，耐用性好。
40.实施例2样品前处理方法的考察不同提取溶液的考察取实施例1中脱绒艾草对照品，精密称取0.2 g，精密加入提取溶液10 ml进行室温提取60 min，提取中进行超声震荡（功率250 w，频率40 khz），平行样提取溶液分别为30v/v%甲醇、50 v/v %甲醇、甲醇、水、乙醇。提取后冷却至室温后，12000rpm离心15 min，收集上清，0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测，高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；柱温：40℃；检测波长：326 nm; 流速：1.0 ml/min；进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b。根据色谱图计算特征峰总峰面积/称样量，结果见表4。
41.表4 不同提取溶液提取效果的比较
由表4结果可见，体积百分比浓度70%的甲醇的特征峰总峰面积/称样量数值最大，提取效率较高，因此确定提取溶液为体积百分比浓度70%的甲醇。
42.不同提取方式的考察取实施例1中脱绒艾草对照品，精密称取0.2 g，精密加入提取溶液（为体积百分比浓度70%的甲醇溶液）10 ml进行提取，平行样提取方式分别为：冷浸泡（25℃）3 h、室温超声震荡（功率250 w，频率40 khz）提取30 min和室温振摇（2800r/min）30 min。提取后冷却至室温后，12000 rpm离心15 min，收集上清，0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测，高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzuc18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；柱温：40℃；检测波长：326 nm; 流速：1.0 ml/min；进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b，根据色谱图计算特征峰总峰面积/称样量，结果见表5。
43.表5 不同提取方式提取效果的比较由表5结果可见，不同提取方式的提取效果差别不大，考虑到操作的方便，因此确定提取方法为超声处理。
44.不同提取时间的考察取实施例1中脱绒艾草对照品，精密称取0.2g，精密加入提取溶液（为体积百分比浓度70%的甲醇溶液）10 ml进行室温提取，提取中进行超声震荡（功率250 w，频率40 khz），平行样提取时间分别为：20 min、30 min、40 min、60 min、90 min。提取后冷却至室温后，12000 rpm离心15 min，收集上清，0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测，高效液相色谱条件为，色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；柱温：40℃；检测波长：326 nm; 流速：1.0 ml/min；进样量：10μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b，根据色谱图计算特征峰总峰面积/称样量，结果见表6。
45.表6 不同提取时间提取效果的比较
40min，20%~35%b；40-55min，35%~55%b；55-60min，55%~30%b。
49.脱绒艾草特征图谱的构建取表8中29个不同批次的脱绒艾草样品，按照上述最佳的样品前处理方法和最优的高效液相色谱条件，采集色谱图，所得色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版）”软件绘制特征图谱，如图4所示，至少包括11个共有特征峰，与对照脱绒艾草样品中的11个共有特征峰的保留时间相对应，其中峰8与对照品参照物峰的保留时间相对应，设为s峰，计算峰1～峰7、峰9～峰11与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内。规定值为：0.32(峰1)、0.48(峰2)、0.49(峰3)、0.54(峰4)、0.71(峰5)、0.93(峰6)、0.96(峰7)、1.13(峰9)、1.26(峰10)、1.38(峰11)。经高分辨质谱分析，并与对照品比对，明确保留时间为12.666、18.892、19.379、21.052、27.688、35.992、37.017、38.306、48.175、52.773min的色谱峰分别为新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、夏佛塔苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c、棕矢车菊素、异泽兰黄素。
50.利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版）”软件进行相似度评价，结果见表8。由表8可知，不同产地脱绒艾草样品的特征图谱与对照特征图谱的相似度均大于0.9，表明不同产地脱绒艾草提取物化学成分差异不大，而且样品质量整体上比较稳定。
51.表829批脱绒艾草提取物样品特征图谱与对照特征图谱相似度评价结果用该确定的最佳检测方法检测不同来源的脱绒艾草样品，所得到的脱绒艾草的典型高效液相色谱特征图谱如图5所示，将该特征图谱与现有技术方法（专利cn202211005718.0，一种艾叶及其制剂特征图谱的构建方法、特征图谱和应用）相比，说明该检测方法分离效果好，能够尽可能多的确定脱绒艾草的特征峰，特征峰中的咖啡酸、异绿原酸b和夏弗塔苷也是首次被指认。
52.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精
神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：（1）精密称取脱绒艾草样品，加入提取溶液进行提取，离心取上清，得供试品溶液；（2）将供试品溶液用高效液相色谱法进行检测，所述的高效液相色谱法的具体检测条件如下：色谱柱：shimadzu c18 hss；流动相：a液为0.2 wt%磷酸水溶液，b液为乙腈；检测波长：270-400 nm；柱温：30-45 ℃；流速：0.5-1.5 ml/min；进样量：5-30 μl；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7% b；5-20 min，7%~8% b；20-30 min，8%~20% b；30-40 min，20%~35% b；40-55 min，35%~55% b；55-60 min，55%~30% b。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的脱绒艾草样品选自艾草干燥制作艾绒后剩余的副产品、该副产品的提取物、含该副产品的食品添加剂或含该副产品的饲料添加剂中的任何一种或者多种。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，精密称取脱绒艾草样品后先破碎，再加入提取溶液进行提取。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的提取溶液为体积百分比浓度为10-100%的甲醇或乙醇的水溶液。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的提取的温度为25-45℃，提取的时间为10-100 min。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，脱绒艾草样品与提取溶液的质量体积比为1:5-500。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，在提取时还进行超声波震荡。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的色谱柱的尺寸为4.6
×
250 mm，填料颗粒平均粒度为5 μm。9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的检测波长为326 nm，所述的柱温为40℃，所述的流速为1.0 ml/min，所述的进样量为10 μl。10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：脱绒艾草样品的特征图谱按保留时间顺序的11个峰中，峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰3为咖啡酸、峰4为隐绿原酸、峰5为夏佛塔苷、峰6为异绿原酸b、峰7为异绿原酸a、峰8为异绿原酸c、峰10为棕矢车菊素、峰11为异泽兰黄素。

技术总结
本发明公开了一种脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测方法，包括：（1）制备供试品溶液；（2）将供试品溶液用高效液相色谱法进行检测，具体检测条件包括：流动相：A液为0.2wt%磷酸水溶液，B液为乙腈；检测波长：270-400 nm；柱温：30-45℃；线性梯度洗脱程序：0-5 min，7%B；5-20 min，7%~8%B；20-30 min，8%~20%B；30-40 min，20%~35%B；40-55 min，35%~55%B；55-60 min，55%~30%B。本发明的检测方法能够重现性和稳定性好、准确性高、检测成本低、检测效率高的进行脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测。进行脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测。进行脱绒艾草高效液相色谱特征图谱的检测。


技术研发人员：张军民 张会艳 赵青余 汤超华 司玮 郭晓青
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/7/12