一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法与流程

1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。


背景技术：

2.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，简称：nadp，又名氧化型辅酶ii)，是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，简称：nad，又名氧化型辅酶ii)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，是生物氧化过程中不可缺少的氢传递体，通过氧化还原反应的形式传递质子、电子及能量，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，能活化多酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，提高物质转运和调节控制，改善代谢功能。研究表明，nadp能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用。nadp是nad通过nad激酶催化磷酸化所产生。
3.在不对称合成手性药物和手性中间体生产中几乎50％左右的反应涉及到辅酶的酶催化参与，生产上需要添加辅酶以满足对反应速率的要求。
4.目前，制备nadp的方法有多种，包括化学合成、生物酶催化及酵母菌发酵提取等。化学合成法由于化工所固有的污染严重，条件苛刻，加之得率不高，导致合成成本较高。对于酵母菌发酵提取的方法，由于nadp在酵母菌中的含量过低，因此该方法在工业制备规模上具有很大的局限性。生物酶催化因为其固有的高效率、绿色环保等优点逐渐成为工业制备nadp的主流方法，但目前已有的生物酶催化法也存在部分缺点。例如：
5.引用文献1公开了一种氧化型辅酶ii的酶催化制备方法，以烟酰胺核苷(nr)和三磷酸腺苷二钠盐(atp-na2)为原料，在烟酰胺核苷激酶(nrk)、无机焦磷酸酶、nad激酶及多聚磷酸激酶四种酶存在下，在ph为4.0～8.5的缓冲溶液中，以及温度10℃～40℃下进行一锅煮反应得到氧化型辅酶ii。引用文献1公开的方法存在工艺路线长，使用酶种类多，合成反应时间长，转化率较低，nadp产品浓度低等问题，不能满足工业化生产nadp的要求。
6.引用文献2公开了一种nadp辅酶的制备方法，包括：第一步：获得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；第二步，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸经过atp磷酸化后制成nadp；第一步合成以烟酰胺核糖为起始底物在烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和三磷酸腺苷的参与下合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：首先，起始底物烟酰胺核糖在烟酰胺核糖激酶的催化下，与三磷酸腺苷反应得到烟酰胺单核苷酸；其次，烟酰胺单核苷酸在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的作用下，与另一三磷酸腺苷反应，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。然而，引用文献2公开的方法中，第一步合成转化率最高仅60％，且第二步合成使用atp作为磷酰基供体，成本高，故不能满足工业化生产nadp的要求。
7.引用文献3公开了一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，以腺苷酸、六偏磷酸钠、atp为底物经腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nmprt)、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)和多聚磷酸依赖型nad激酶(ppnk)四种酶合物，催化合成
nadp，其工艺流程图如图1所示。引用文献3公开的方法同样具有工艺路线长，涉及酶多的问题，且当量生成副产物腺嘌呤，原子经济性差，转化率较低为90％-96％，nadp产品浓度较低为34g/l-37g/l，工业生产经济性较低。
8.因此，需要开发一种工艺路线短且经济适用性更高的nadp合成方法，以满足规模化生产nadp的市场需求。
9.引用文献：
10.引用文献1：cn102605027b；
11.引用文献2：cn108998484a；
12.引用文献3：cn110643587b。


技术实现要素：

13.发明要解决的问题
14.针对上述现有技术中存在的，例如nadp合成方法工艺路线长，产量低，经济实用性差等问题，本发明的目的在于开发一种工艺路线短，底物成本适中，原子经济性高，副产物少，转化率高，合成时间短，产物浓度高，满足工业化生产nadp的合成工艺。
15.用于解决问题的方案
16.本发明提供了一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
17.第1步反应：在反应体系i中，以烟酰胺单核苷酸(nmn)，和三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐为底物，在烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)的催化下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和焦磷酸；可选的，在无机焦磷酸酶(ipp1)的催化下水解所述焦磷酸，促进反应正向进行；
18.第2步反应：在反应体系ii中，第1步反应生成的所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在磷酰基供体的参与下，在atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(mfnk)的催化下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)。
19.进一步地，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶来源于地狱甲烷球菌(methanocaldococcus infernus)，所述无机焦磷酸酶来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)s288c菌株，所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶来源于黄色微球菌(micrococcus flavus)；
20.优选地，
21.所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶选自如下(a1)～(a4)中的任一项：
22.(a1)包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；
23.(a2)具有如seq id no.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；
24.(a3)由编码(a1)或(a2)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；
25.(a4)由与seq id no.2或seq id no.3所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；
26.所述无机焦磷酸酶选自如下(b1)～(b4)中的任一项：
27.(b 1
)包含如seq id no.4所示的氨基酸序列，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；
28.(b 2
)具有如seq id no.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；
29.(b 3
)由编码(b 1
)或(b 2
)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；
30.(b 4
)由与seq id no.5所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；
31.所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶选自如下(c1)～(c4)中的任一项：
32.(c 1
)包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽；
33.(c 2
)具有如seq id no.6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽；
34.(c 3
)由编码(c 1
)或(c 2
)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；
35.(c 4
)由与seq id no.7或seq id no.8所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽。
36.进一步地，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、所述无机焦磷酸酶和所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶以纯酶，或粗酶，或表达其的宿主细胞破碎液，或表达其的宿主细胞的形式参与反应。
37.优选地，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、所述无机焦磷酸酶和所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶以表达其的宿主细胞的形式参与反应。
38.可选地，在所述反应体系i或所述反应体系ii中，表达所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的宿主细胞、表达所述无机焦磷酸酶的宿主细胞和表达所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶的宿主细胞的湿重浓度分别独立的为5g/l～50g/l。
39.进一步地，所述第1步反应和第2步反应在反应介质中进行，所述反应介质为磷酸盐缓冲溶液、tris-hcl缓冲溶液或纯水；
40.可选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mm～100mm。
41.进一步地，在所述反应体系i中，所述烟酰胺单核苷酸的初始浓度为50mm～400mm；
42.优选地，在所述反应体系i中，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐的初始摩尔比为1:1～1:1.5。
43.进一步地，所述反应体系i中还包含二价金属离子；
44.优选地，所述二价金属离子包括镁离子和/或锰离子；
45.优选地，在所述反应体系i中，所述镁离子的浓度为1mm～60mm，所述锰离子的浓度为0.5mm～40mm。
46.进一步地，所述反应体系i中还包含曲拉通x-100；
47.优选地，在所述反应体系i中，所述曲拉通x-100的浓度为0.1％(v/v)～0.2％(v/v)。
48.进一步地，所述反应体系i的ph为7.0～10.0，所述第1步反应的反应温度为25℃～42℃，所述第1步反应的反应时间为1.0h～6.0h。
49.进一步地，在所述反应体系ii中，所述磷酰基供体为无机磷酸盐，优选的磷酰基供体为多偏磷酸盐或多聚磷酸盐；
50.优选地，以所述烟酰胺单核苷酸在所述反应体系i中的初始量为基础，所述烟酰胺单核苷酸与所述反应体系ii中的磷酰基供体的摩尔比为1:0.6～1:1.5；
51.优选地，在所述第2步反应中，所述磷酰基供体以液体流加方式加入反应体系，流加时间控制为1.0h-8.0h。
52.进一步地，所述反应体系ii的ph为5.0～8.0，所述第2步反应的反应温度为30℃～60℃，所述第2步反应的反应时间为1.5h～15.0h。
53.发明的效果
54.通过上述技术方案的实施，本发明取得了以下技术效果：
55.首先，本发明提供的酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法以nmn为起始底物，经nmnat、ipp1、mfnk三酶催化合成nadp，底物成本适中，工艺路线短，原子经济性高，副产物少；并且，本发明优选酶源及合成条件，合成时间短，酶催化效率高，底物耐受强，合成转化率高，可满足高浓度底物高效催化合成nadp；此外，本发明提供的方法可以纯水为反应介质，简化合成体系，nadp合成液中nadp浓度高，杂质含量低，有效降低nadp后续提取成本；因此，本发明所选的酶及合成工艺，满足nadp工业化生产要求，具有产业化价值。
附图说明
56.图1为中国专利文献cn110643587b中公开的一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法的工艺流程图。
57.图2为本发明提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的合成技术路线图。
具体实施方式
58.以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。
59.在本发明中，使用“数值a～数值b”或“数值a-数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
60.在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
61.在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
62.在本发明中，术语“约”可以表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在某一特定数值或范围的
±
10％、
±
5％、
±
1％或
±
0.5％之内。
63.在本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形、分支或环状的，它可以包含修饰的氨基酸，修饰方式包括例如乙酰化、甲酰化、磷酸化、磺酸化、泛素化、糖基化、c端氨基酸的酰胺化或任何其他操作，并且它可以由非氨基酸隔断。
64.在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的d和l立体异构体。本发明中氨基酸及缩写和英文简称如下所示：
65.组氨酸(his，h)；丝氨酸(ser，s)；谷氨酸(glu，e)；谷氨酰胺(gln，q)；甘氨酸(gly，g)；苏氨酸(thr，t)；苯丙氨酸(phe，f)；天冬氨酸(asp，d)；酪氨酸(tyr，y)；亮氨酸(leu，l)；异亮氨酸(ile，i)；精氨酸(arg，r)；丙氨酸(ala，a)；缬氨酸(val，v)；色氨酸(trp，w)；甲硫氨酸(met，m)；天冬酰胺(asn，n)；半胱氨酸(cys，c)；赖氨酸(lys，k)；脯氨酸(pro，p)。
66.在本发明中，氨基酸缺失可指从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。
67.在本发明中，氨基酸添加可指在氨基酸序列的c端、n端或c端与n端中间的任意位置处添加1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。
68.在本发明中，氨基酸替换可指在氨基酸序列的某个位置的氨基酸被其他氨基酸替代，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。氨基酸替换可以是保守氨基酸取代，指与原有氨基酸序列相比，若干个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽(保守性变异肽)。示例性的，这些保守性变异肽可以根据下列氨基酸替换而产生：val、leu或ile对ala的取代，lys、gln、asn或his对arg的取代，gln、his、lys或arg对asn的取代，glu或asn对asp的取代，ser或ala对cys的取代，asn或glu对gln的取代，asp或gln对glu的取代，ala对gly的取代，asn、lys、gln或arg对his的取代，leu、met、ala、val、phe或正亮氨酸对ile的取代，ile、met、ala、val、phe或正亮氨酸对leu的取代，asn、gln或arg对lys的取代，ile、leu或phe对met的取代，leu、val、ile、ala或tyr对phe的取代，ala对pro的取代，thr对ser的取代，ser或val对thr的取代，phe或tyr对trp的取代，trp、phe、thr或ser对tyr的取代，及phe、ala、met、ile、leu或正亮氨酸对val的取代。氨基酸替换也可以是非保守氨基酸替换。
69.在本发明中，“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个dna分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数
×
100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。
70.在本发明中，术语“密码子优化”是指编码多肽的核苷酸序列已被配置为包含宿主细胞或生物体优选的密码子，以改善宿主细胞或生物体中的基因表达并提高翻译效率。
71.在本发明中，术语“载体”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、柯斯质粒等等。
72.在本发明中，术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(escherichia coli)或沙门氏菌(salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；链球菌(streptococcus)和流感嗜血菌(haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括cho(中国仓鼠卵巢细胞系)和ns0细胞。
73.在本发明中，“细胞的湿重”是指细胞在正常生活状态下的质量。
74.在本发明中，“纯酶”是指单一的酶物质，例如单一的酶蛋白。“粗酶”是指在酶的生产过程中经过了适当的纯化，例如通过离心等手段去除了细胞碎片等杂质，但仍含有少量其他大分子或小分子杂质的一种含有酶的物质集合。
75.在本发明中，“细胞破碎液”是指完整细胞经过外力，例如超声、研磨等方式，原有完整细胞结构被破坏后的液体混合物。示例性的，细胞破碎液中可以含有细胞碎片，细胞内容物，以及溶剂例如水或细胞培养基等物质。
76.除非另有定义，本发明所用的其他的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
77.以下对于本发明的技术方案进行详细说明：
78.本发明提供了一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，主要采用了如下技术路线：
79.第1步合成，以烟酰胺单核苷酸(nmn)和三磷酸腺苷(atp)或三磷酸腺苷盐为底物在烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)的催化下生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和焦磷酸，同时加入无机焦磷酸酶(ipp1)水解焦磷酸促进反应的正向进行；
80.第2步合成，第1步合成的nad在磷酰基供体的参与下经atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(mfnk)催化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)，具体的技术路线如图2所示。
81.在一些实施方案中，本发明提供的酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法包括如下步骤：
82.第1步反应：在反应体系i中，以烟酰胺单核苷酸(nmn)，和三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐为底物，在烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)的催化下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和焦磷酸；可选的，在无机焦磷酸酶(ipp1)的催化下水解所述焦磷酸，促进反应正向进行；
83.第2步反应：在反应体系ii中，第1步反应生成的所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在磷酰基供体的参与下，在atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(mfnk)的催化下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)。
84.在一些实施方案中，所述三磷酸腺苷盐包括三磷酸腺苷二钠盐。
85.在一些实施方案中，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(又称为烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶)(nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase，nmnat)来源于地狱甲烷球菌(methanocaldococcus infernus)，ncbi的登录号为wp_013099845。
86.在一些实施方案中，所述无机焦磷酸酶(inorganic diphosphatase，ipp1)来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)s288c菌株，ncbi的登录号为np_009565。
87.在一些实施方案中，所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(又称为poly(p)/atp-nad激酶)(inorganic polyphosphate/atp-nad kinase，mfnk)来源于黄色微球菌(micrococcus flavus)，ncbi的登录号为wp_135030347。
88.在一些实施方案中，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶选自如下(a1)～(a4)中的任一项：
89.(a1)包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；
90.(a2)具有如seq id no.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；
91.(a3)由编码(a1)或(a2)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；
92.(a4)由与seq id no.2或seq id no.3所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽。
93.在一些优选的实施方案中，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
94.在一些优选的实施方案中，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的编码核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示。
95.在一些实施方案中，所述无机焦磷酸酶选自如下(b1)～(b4)中的任一项：
96.(b 1
)包含如seq id no.4所示的氨基酸序列，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；
97.(b 2
)具有如seq id no.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；
98.(b 3
)由编码(b 1
)或(b 2
)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；
99.(b 4
)由与seq id no.5所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽。
100.在一些优选的实施方案中，所述无机焦磷酸酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
101.在一些优选的实施方案中，所述无机焦磷酸酶的编码核苷酸序列如seq id no.5所示。
102.在一些实施方案中，所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶选自如下(c1)～(c4)中的任一项：
103.(c 1
)包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽；
104.(c 2
)具有如seq id no.6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽；
105.(c 3
)由编码(c 1
)或(c 2
)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；
106.(c 4
)由与seq id no.7或seq id no.8所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽。
107.在一些优选的实施方案中，所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶的氨基酸序列如seq id no.6所示。
108.在一些优选的实施方案中，所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶的编码核苷酸序列如seq id no.7或seq id no.8所示。
109.本发明利用烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、无机焦磷酸酶和atp/多聚磷酸依赖型nad激酶三种酶合理组合，酶解催化nmn合成nadp。
110.本发明对参与反应的酶的形式不做特别限定，示例性的，烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、无机焦磷酸酶和atp/多聚磷酸依赖型nad激酶可以纯酶、粗酶液、表达其的宿主细胞或含表达其的宿主细胞的发酵液等的方式参与反应。宿主细胞可以通过离心或过滤的方式收集细胞，用于宿主细胞催化转化。
111.根据本发明提供的包含两步反应的酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法对酶的组合使用需求，可以将烟酰胺核苷腺苷酰转移酶和无机焦磷酸酶的编码核苷酸序列分别连入不同表达载体并分别导入宿主细胞进行单独表达，也可以将烟酰胺核苷腺苷酰转移酶和无机焦磷酸酶的编码核苷酸序列连入同一个表达载体并导入宿主细胞进行共表达，优选共表达策略。
112.在一些实施方案中，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、所述无机焦磷酸酶和所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶以纯酶，或粗酶，或表达其的宿主细胞破碎液，或表达其的宿主细胞的形式参与反应。在一些优选的实施方案中，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、所述无机焦磷酸酶和所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶以表达其的宿主细胞的形式参与反应。进一步地，在所述反应体系i或所述反应体系ii中，表达所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的宿主细胞、表达所述无机焦磷酸酶的宿主细胞和表达所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶的宿主细胞的湿重浓度分别独立的为5g/l～50g/l；例如，可以分别独立的为约5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l或50g/l等；优选分别独立的为15g/l～40g/l。
113.反应介质
114.在一些实施方案中，所述第1步反应和第2步反应在反应介质中进行，所述反应介质为磷酸盐缓冲溶液、tris-hcl缓冲溶液或纯水，优选以纯水作为反应介质。
115.在一些具体的实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液作为反应介质时，其浓度为20mm～100mm；例如，可以为约20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm等。
116.第1步反应
117.在一些实施方案中，所述第1步反应包括如下具体步骤：在反应介质中溶解反应底物烟酰胺单核苷酸(nmn)和三磷酸腺苷(atp)或三磷酸腺苷盐，添加二价金属离子镁离子或锰离子或镁离子与锰离子的混合物，调节反应液ph后，加入烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)和无机焦磷酸酶(ipp1)，添加曲拉通x-100，控制反应温度及合成体系ph，获得反应体系i，合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)。在反应过程中可以高效液相色谱(hplc)监测反应进程，合成结束nmn转化率为98.0％-100.0％。
118.为了控制底物浓度从而提高合成效率，在一些实施方案中，在所述反应体系i中，所述烟酰胺单核苷酸的初始浓度为50mm～400mm；例如，可以为约50mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm或400mm等；优选为150mm～300mm。
119.进一步的，在一些实施方案中，在所述反应体系i中，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐的初始摩尔比为1:1～1:1.5；例如，可以为约1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5等；优选为1:1.1～1:1.3。
120.为了促使反应的进行，在一些实施方案中，所述反应体系i中还包含二价金属离子。
121.在一些具体的实施方案中，所述二价金属离子包括镁离子和/或锰离子。
122.在一些优选的实施方案中，所述反应体系i中同时包括镁离子和锰离子。
123.本发明对于二价金属离子的添加方式不做特别限定，例如，可以以氯化物、硫酸盐、硫酸盐水合物、硝酸盐或硝酸盐水合物等形式添加。
124.在一些实施方案中，在所述反应体系i中，所述镁离子的浓度为1mm～60mm，例如，可以为约1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm或60mm等，优选为5mm～40mm；所述锰离子的浓度为0.5mm～40mm，例如，可以为约0.5mm、1.5mm、2.5mm、3.5mm、5.5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm或40mm等，优选为2.5mm～20mm。
125.在一些实施方案中，所述反应体系i中还包含曲拉通x-100。
126.在一些具体的实施方案中，在所述反应体系i中，所述曲拉通x-100的浓度为0.1％(v/v)～0.2％(v/v)，例如，可以为约0.1％(v/v)、0.12％(v/v)、0.14％(v/v)、0.16％(v/v)、0.18％(v/v)或0.20％(v/v)等。
127.在一些实施方案中，所述反应体系i的ph为7.0～10.0，例如，可以为约7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0等，优选ph为7.5～9.0。本发明对用于调节ph的物质不做特别限定，例如可以为5m的氢氧化钠。
128.在一些实施方案中，所述第1步反应的反应温度为25℃～42℃，例如，可以为约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃等，优选为30℃～37℃。
129.根据不同起始底物浓度及酶用量，在一些实施方案中，所述第1步反应的反应时间为1.0h～6.0h，例如，可以为约1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h或6.0h等，优选为2.0h～5.0h。
130.第2步反应
131.在一些实施方案中，所述第2步反应包括如下具体步骤：第1步合成反应结束后，调节第1步合成液ph及反应体系温度，添加atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(mfnk)，流加磷酰基供体，控制反应体系温度及ph，获得反应体系ii，合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)。在反应过程中可以高效液相色谱(hplc)监测反应进程，合成结束nad转化率为98.0％-99.5％。全合成转化率96.0％-99.5％。
132.为了利用第1步反应获得的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，需要在反应结束的反应体系i中添加磷酰基供体。
133.在一些实施方案中，在所述反应体系ii中，所述磷酰基供体为无机磷酸盐。
134.在一些具体的实施方案中，所述磷酰基供体为多偏磷酸盐或多聚磷酸盐，例如，可以为三偏磷酸钠、六偏磷酸钠、多聚磷酸钠、四聚磷酸钠、偏磷酸钾或三聚磷酸钾等，优选为四聚磷酸钠。
135.在一些实施方案中，以所述烟酰胺单核苷酸在所述反应体系i中的初始量为基础，所述烟酰胺单核苷酸与所述反应体系ii中的磷酰基供体的摩尔比为1:0.6～1:1.5，例如，可以为约1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5等，优选为1:0.8～1:1.1。并且，所述反应体系ii中的磷酰基供体的量是指在第1步反应结束的反应体
系i中添加的总的磷酰基供体的量。
136.在一些具体的实施方案中，在所述第2步反应中，所述磷酰基供体可以提前配制成母液，以液体流加方式加入反应体系，流加速度可控制为匀速流加或变速流加，优选匀速流加，匀速流加时间控制为1.0h～8.0h，例如，可以为约1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h、6.5h、7.0h、7.5h和8.0h等，优选1.5h～2.5h。
137.在一些实施方案中，所述反应体系ii的ph为5.0～8.0，例如，可以为约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0等，优选ph为5.5～7.0。本发明对用于调节ph的物质不做特别限定，例如可以为磷酸。
138.在一些实施方案中，所述第2步反应的反应温度为30℃～60℃，例如，可以为约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃等，优选为37℃～55℃。
139.根据不同起始底物浓度及酶用量，在一些实施方案中，所述第2步反应的反应时间为1.5h～15.0h，例如，可以为约1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h、6.5h、7.0h、8.0h、9.0h、10.0h、11.0h、12.0h、13.0h、14.0h、15.0h等，优选为2.5h～10h。
140.本发明涉及的氨基酸序列及核苷酸序列
141.nmnat的氨基酸序列(seq id no.1)：mrgllvgrfqpfhnghlnv vlsimkevdeliivvgsaekshsldnpftagerilmisktlrkynfpfyvipi kdiefnslwvsyvesltpkfdvvysgnplvrvlfkernykvkrpqmfnr kelsgeeirrrmlsgepwenlvpkevaevieeidgvnrlrsllesdkl*。
142.编码nmnat的核苷酸序列(seq id no.2)：atgagaggcttattgg ttggaagatttcaaccctttcataatggacatttaaatgttgtcttaagtataatgaaggaggttgatgagttaattatagttgttggtagtgctgagaaaagccatagcttagacaatcccttcacagctggagaaaggatattaatgatctctaaaaccttgagaaaatataatttccctttttatgtcattccaataaaggatattgaatttaactccctctgggtttcttatgtagaatctctaactcctaagtttgatgtggtctattctggaaatccattagttagggttctatttaaagagagaaactataaggttaagaggccacagatgtttaataggaaagagctttctggagaggagataaggagaagaatgctctcaggagagccttgggaaaacctagtccctaaggaagtggctgaggttatagaggagattgatggggttaatagattaagaagcctcttagagagtgataagttatga。
143.密码子优化后的编码nmnat的核苷酸序列(seq id no.3)：atgcgt ggcctgctggttggccgtttccagccgttccacaacggccacctgaacgttgttctgagcatcatgaaagaagttgatgaactgatcatcgttgttggcagcgcggaaaaaagccacagcctggataacccgttcaccgcgggcgaacgtatcctgatgatcagcaaaaccctgcgtaaatacaacttcccgttctacgttatcccgatcaaagatatcgaattcaacagcctgtgggttagctacgttgaaagcctgaccccgaaattcgatgttgtttacagcggcaacccgctggttcgtgttctgttcaaagaacgtaactacaaagttaaacgtccgcagatgttcaaccgtaaagaactgagcggcgaagaaatccgtcgtcgtatgctgagcggtgaaccgtgggaaaacctggttccgaaagaagttgcggaagttatcgaagaaatcgatggcgttaaccgtctgcgtagcctgctggaaagcgataaactg。
144.ipp1的氨基酸序列(seq id no.4)：mtyttrqigakntleykvyiek dgkpvsafhdiplyadkennifnmvveiprwtnakleitkeetlnpiiqdtkkgklrfvrncfphhgyihnygafpqtwedpnvshpetkavgdndpidvleigetiaytgqvkqvkalgimalldegetdwkviaidindplapklndiedvekyfpgllratnewfriykipdgkpenqfafsgeaknkkyaldiikethdswkqliagkssdskgidltnvtlpdtptyskaasdaippaspkadapidksidkwffisgsv*。
145.编码ipp1的核苷酸序列(seq id no.5)：atgacctacactaccaga caaattggtgccaagaacaccttggaatacaaagtttatatcgaaaaggatggtaagccagtttctgccttccacgacattcccttgtacgctgacaaggaaaacaacattttcaacatggttgttgaaattccacgttggaccaacgccaagttagaaatcaccaaggaagaaactttgaacccaatcatccaagacaccaagaagggcaagttgagatttgttagaaactgtttccctcaccatggttacattcacaactatggtgctttcccacaaacttgggaagacccaaacgtaagccacccagaaactaaggcagttggtgacaacgatccaattgatgtgttggaaattggtgaaactattgcttacactggtcaagtcaagcaagttaaggctctaggtatcatggctttattggatgaaggtgagaccgattggaaagttattgccattgatattaacgatccattagccccaaaattgaacgacattgaggatgttgagaaatacttcccaggtctgttgagggctactaacgaatggttcagaatttacaaaatcccagatggtaagccagaaaaccaatttgccttctccggtgaagctaagaacaagaagtacgctttggatatcatcaaggaaacacatgactcctggaaacaattaattgctggtaagtcttctgacagcaagggtattgatttgaccaatgttactttgcctgacaccccaacctactccaaggctgcctctgatgccatcccaccagcttctccaaaggcagatgctccaattgacaagtctattgacaagtggttcttcatctccggttctgtttaa。
146.mfnk的氨基酸序列(seq id no.6)：msetparrvlvlahtgrqdaidaalqairildeegldsvmpaadvaavraavgedpgfrplslgedcalsdvslglvlggdgsvlraadlvrghgipllavnlghvgflaesertdlhrtvkaiadeayvviermaldvvvrvdgreaartwalneasveksnrermlevvvsvddspltafgcdgvvlgtptgstayafsaggpvvwpgveallfvpisahalfarplvvgphstiavdimtrtretgvlwcdgrrtvdlppnarvevtrstepvrlarlspvpfadrlvrkfrlptegwrgpvtdedvrareatavaevetveprhagprpdvvppptsalpvltpedleryrsrdgrggdrts*。
147.编码mfnk的核苷酸序列(seq id no.7)：atgtccgagacccccgc acgccgcgtgctcgtgctcgcccacacggggcggcaggacgccatcgacgcggccctgcaggccatccgcatcctcgacgaggagggcctggacagcgtcatgcccgccgcggacgtggcggccgtgcgcgccgcagtgggggaggaccccggcttccgccccctctcgctcggcgaggactgcgcgctgtccgacgtgagcctcggactggtcctcggcggggacggctccgtcctgcgcgccgccgacctggtgcgcggccacggcatcccgctcctggcggtcaacctcggccacgtcgggttcctcgccgagtccgagcgcacggacctgcaccgcaccgtcaaggcgatcgccgacgaggcctacgtggtcatcgaacggatggcgctcgacgtcgtggtgcgcgtggacggccgggaggcggcccggacgtgggccctgaacgaggcctccgtggagaagtccaaccgggagcgcatgctggaggtcgtggtctccgtggacgactcgccgctgaccgcgttcggctgcgacggcgtggtgctgggcacccccacggggtccaccgcctacgcgttctccgcgggcggacccgtggtgtggccgggggtggaggccctgctgttcgtgcccatcagcgcgcacgcgctgttcgcccgtcccctcgtggtgggaccgcactccaccatcgccgtggacatcatgacccgcacccgcgagacgggcgtgctgtggtgcgacgggcgccgcacggtggacctcccgccgaacgcccgcgtcgaagtcacccgctccacggagccggtccgcctggcccgcctgagcccggtccccttcgcggaccgcctggtgcgcaagttccgcctgcccacggagggctggcgcggccccgtgacggacgaggacgtccgcgcgcgggaggccaccgccgtggccgaggtggagaccgtcgagccgcggcacgccggcccccggccggacgtggtgccgccgcccacctcggcgctgcccgtgctcacccccgaggacctcgagcgctaccgcagccgcgacggccggggaggggatcggacctcatga。
148.密码子优化后的编码mfnk的核苷酸序列(seq id no.8)：atgagcg aaaccccggcgcgtcgtgttctggttctggcgcacaccggtcgtcaggacgctattgatgcggcgctgcaggcgatccgtattctggatgaagaaggcctggacagcgttatgccggcggcggacgttgctgcggttcgtgctgcggttggtgaagatccgggcttccgtccgctgagcctgggcgaagattgtgctctgtctgatgtgtccctgggtctggtgctgggcggcgatggctccgtgctgcgtgcggcggatctggttcgtggccacggcatcccgctgctggcggttaacctgggccacgttggctt
cctggcagaatctgaacgtactgatctgcatcgtaccgttaaagcgattgcggatgaagcgtacgttgttatcgaacgtatggcactggacgttgttgtgcgtgttgatggtcgtgaagcggcgcgcacctgggcgctgaacgaagcgtccgttgaaaaaagcaaccgtgaacgcatgctggaagtggttgttagcgtggatgattctccgctgactgctttcggctgcgatggcgttgttctgggtaccccgaccggttccaccgcctacgcattctccgcgggcggcccggttgtgtggccgggcgttgaagcgctgctgtttgtaccgatctctgcgcacgcgctgttcgctcgcccgctggttgttggcccgcactctaccatcgcggtggacatcatgacccgtacccgtgaaaccggtgttctgtggtgcgacggccgtcgcaccgtggacctgccgccgaacgcgcgtgttgaagttactcgcagcaccgaaccggtccgtctggcgcgtctgtctccggtgccgttcgcggatcgtctggttcgtaaattccgcctgccgaccgaaggctggcgcggtccggttaccgacgaagatgttcgtgcgcgcgaagcgaccgcggtggctgaagttgaaaccgttgaaccgcgtcacgcgggcccgcgtccggatgttgttccgccgccgaccagcgcgctgccggttctgaccccggaagatctggaacgttaccgtagccgtgatggtcgtggcggtgatcgtacctct。
149.以酿酒酵母基因组dna为模板扩增ipp1目的片段的引物ipp1-f 5
’‑3’
的核苷酸序列(seq id no.9)：atgacctacactaccagac。
150.以酿酒酵母基因组dna为模板扩增ipp1目的片段的引物ipp1-r 5
’‑3’
的核苷酸序列(seq id no.10)：ttaaacagaaccggagatgaag。
151.rbs的核苷酸序列(seq id no.11)：gaaggagatatacat。
152.引物pet28a-nmnat-linear-f 5
’‑3’
的核苷酸序列(seq id no.12)：aagcttgcggccgcactcgag。
153.引物pet28a-nmnat-linear-r 5
’‑3’
的核苷酸序列(seq id no.13)：cagtttatcgctttccag。
154.以peasy-blunt e1-ipp1质粒为模板扩增ipp1目的片段的引物ipp1-f 5
’‑3’
的核苷酸序列(seq id no.14)：ctggaaagcgataaactgtgaga aggagatatacatatgacctacactaccag。
155.以peasy-blunt e1-ipp1质粒为模板扩增ipp1目的片段的引物ipp1-r 5
’‑3’
的核苷酸序列(seq id no.15)：gagtgcggccgcaagcttatgtat atctccttctcaaacagaaccggagatgaag。
156.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
157.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
158.种子培养基为lb培养基，配方为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l。发酵培养基配方为：酵母粉10g/l，硫酸铵5g/l，nacl 10g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，121℃湿热灭菌20min；600g/l葡萄糖补糖液单独配制，115℃湿热灭菌20min备用。
159.实施例1：制备nadp生产用酶
160.烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)密码子优化(针对大肠杆菌)后核苷酸序列如seq id no.3所示，经生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成，并通过ndeⅰ和hindⅲ酶切位点连接至pet28a载体，连接成功经测序正确后，将重组质粒pet28a-nmnat转入
e.coli bl21(de3)菌株并经菌落pcr验证正确，即得nmnat表达菌株。
161.无机焦磷酸酶(ipp1)核苷酸序列如seq id no.5所示，提取酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae s288c)菌株基因组dna，以其为模板，利用pcr的常规技术，在takara高保真dna聚合酶(max dna polymerase)的作用下，pcr扩增ipp1基因片段，扩增引物序列为ipp1-f 5
’‑3’
序列如seq id no.9所示；ipp1-r 5
’‑3’
序列如seq id no.10所示，使用全式金试剂盒原核表达载体-blunt e1expression kit将ipp1片段连接至peasy-blunt e1载体，连接产物即peasy-blunt e1-ipp1重组质粒，转入e.coli bl21(de3)菌株阳性克隆测序验证正确，即得ipp1表达菌株。
162.atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(mfnk)密码子优化(针对大肠杆菌)后核苷酸序列如seq id no.8所示，经生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成，并通过ndeⅰ和hindⅲ酶切位点连接至pet28a载体，连接成功经测序正确后，将重组质粒pet28a-mfnk转入e.coli bl21(de3)菌株并经菌落pcr验证正确，即得mfnk表达菌株。
163.烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)与无机焦磷酸酶(ipp1)共表达菌株构建：在重组质粒pet28a-nmnat的nmnat终止密码子序列之后以核蛋白体结合位点(rbs)序列将ipp1片段连接于pet28a-nmnat重组质粒，构成pet28a-nmnat-ipp1共表达重组质粒，连接nmnat与ipp1片段的rbs核苷酸序列如seq id no.11所示。具体操作方法为，利用pcr的常规技术，在takara高保真dna聚合酶(max dna polymerase)的作用下，以重组质粒pet28a-nmnat为模板经上下游线性化引物pcr获得线性化载体，上下游线性化引物序列分别为：pet28a-nmnat-linear-f 5
’‑3’
序列如seq id no.12所示，pet28a-nmnat-linear-r 5
’‑3’
序列如seq id no.13所示；以peasy-blunt e1-ipp1质粒为模板经ipp1片段上下游引物pcr获得ipp1目的片段，ipp1上下游引物序列分别为：ipp1-f 5
’‑3’
序列如seq id no.14所示；ipp1-r 5
’‑3’
序列如seq id no.15所示；将pet28a-nmnat线性化载体与ipp1片段通过碧云天无缝克隆试剂盒(seamless cloning kit)进行连接，连接产物即pet28a-nmnat-ipp1共表达重组质粒，连接产物转入e.coli bl21(de3)菌株并经测序验证正确，即得nmnat与ipp1共表达菌株，下文简称nmnat-ipp1共表达菌株，通过诱导表达可实现nmnat和ipp1在一个菌株中共同表达。
164.上述表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入装1l发酵培养基的2l发酵罐中，发酵过程中以氨水/氨气控制发酵液ph至6.5-7.0，根据发酵进程顺控补糖，控制残糖水平不超过5g/l，培养7小时后加入终浓度0.1mm iptg，30℃诱导15h，结束发酵，检测湿重，离心收集菌体或直接以发酵液用于后续全细胞催化合成nadp。
165.实施例2：制备nadp
166.第1步合成：以1000ml发酵罐作为反应容器，加入底物nmn 6.75g、atp 10.25g、mgso4·
7h2o 0.099g，mnso4·
h2o 0.034g，曲拉通x-100 0.8ml加入250ml去离子水中，开启搅拌300r/min，溶解底物，5m氢氧化钠溶液调节ph至7.0，向反应液中加入离心收集的nmnat-ppa1共表达菌株湿菌体2.0g，加水定容至400ml，控制反应温度25℃，维持反应体系ph 7.0，开始第1步计时反应，hplc监控反应进程，反应1.0h，nmn转化率99.2％，结束第1步合成。
167.第2步合成：以磷酸原位调节第1步合成液ph至5.0，加入mfnk表达菌株湿菌体
2.0g，称取5.64g四聚磷酸钠并配制成1m母液备用，控制反应体系温度为30℃，开始流加四聚磷酸钠母液，四聚磷酸钠母液以蠕动泵匀速流加入反应体系，控制流加时间为1.0h，维持反应体系温度及ph，开始第2步合成计时，hplc监控反应进程，反应1.5h，nad转化率99.4％，结束第2步合成，nadp产品浓度35.5g/l，全合成nmn转化率98.6％。
168.实施例3：制备nadp
169.第1步合成：以1000ml发酵罐作为反应容器，加入底物nmn 40.51g、atp 92.22g、mgso4·
7h2o 5.945g，mnso4·
h2o 2.704g，曲拉通x-100 0.8ml加入250ml去离子水中，开启搅拌300r/min，溶解底物，5m氢氧化钠溶液调节ph至10.0，向反应液中加入离心收集的nmnat-ppa1共表达菌株湿菌体20.0g，加水定容至400ml，控制反应温度42℃，维持反应体系ph 10.0，开始第1步计时反应，hplc监控反应进程，反应5.0h，nmn转化率98.1％，结束第1步合成。
170.第2步合成：原位以磷酸调节第1步合成液ph至8.0，加入mfnk表达菌株湿菌体20.0g，称取84.57g四聚磷酸钠并配制成1m母液备用，控制反应体系温度为60℃，开始流加四聚磷酸钠母液，四聚磷酸钠母液以蠕动泵匀速流加入反应体系，控制流加时间为3.0h，维持反应体系温度及ph，开始第2步合成计时，hplc监控反应进程，反应10.0h，nad转化率98.2％，结束第2步合成，nadp产品浓度148.1g/l，全合成nmn转化率96.3％。
171.实施例4：制备nadp
172.第1步合成：以1000ml发酵罐作为反应容器，加入底物nmn 20.26g、atp 33.81g、mgso4·
7h2o 0.495g，mnso4·
h2o 0.169g，曲拉通x-100 0.8ml加入250ml去离子水中，开启搅拌300r/min，溶解底物，5m氢氧化钠溶液调节ph至7.5，向反应液中加入nmnat-ppa1共表达菌发酵液31ml(发酵液菌体湿重196g/l)，加水定容至400ml，控制反应温度30℃，维持反应体系ph7.5，开始第1步计时反应，hplc监控反应进程，反应4.5h，nmn转化率98.8％，结束第1步合成。
173.第2步合成：原位以磷酸调节第1步合成液ph至5.5，加入mfnk表达菌发酵液33ml(发酵液菌体湿重182g/l)，称取22.55g四聚磷酸钠并配制成1m母液备用，控制反应体系温度为37℃，开始流加四聚磷酸钠母液，四聚磷酸钠母液以蠕动泵匀速流加入反应体系，控制流加时间为3.0h，维持反应体系温度及ph，开始第2步合成计时，hplc监控反应进程，反应7.0h，nad转化率98.5％，结束第2步合成，nadp产品浓度90.2g/l，全合成nmn转化率97.3％。
174.实施例5：制备nadp
175.第1步合成：以1000ml发酵罐作为反应容器，加入底物nmn 33.76g、atp 66.60g、mgso4·
7h2o 3.963g，mnso4·
h2o 1.352g，曲拉通x-100 0.8ml加入250ml去离子水中，开启搅拌300r/min，溶解底物，5m氢氧化钠溶液调节ph至9.0，向反应液中加入nmnat-ppa1共表达菌发酵液82ml(发酵液菌体湿重196g/l)，加水定容至400ml，控制反应温度37℃，维持反应体系ph9.0，开始第1步计时反应，hplc监控反应进程，反应4.0h，nmn转化率98.1％，结束第1步合成。
176.第2步合成：原位以磷酸调节第1步合成液ph至7.0，加入mfnk表达菌发酵液88ml(发酵液菌体湿重182g/l)，称取51.68g四聚磷酸钠并配制成1m母液备用，控制反应体系温度为55℃，开始流加四聚磷酸钠母液，四聚磷酸钠母液以蠕动泵匀速流加入反应体系，控制流加时间为5.0h，维持反应体系温度及ph，开始第2步合成计时，hplc监控反应进程，反应
8.0h，nad转化率98.4％，结束第2步合成，nadp产品浓度120.0g/l，全合成nmn转化率96.5％。
177.实施例6：制备nadp
178.第1步合成：以1000ml发酵罐作为反应容器，加入底物nmn 27.00g、atp 49.18g、mgso4·
7h2o 1.982g，mnso4·
h2o 0.676g，曲拉通x-100 0.8ml加入250ml去离子水中，开启搅拌300r/min，溶解底物，5m氢氧化钠溶液调节ph至8.0，向反应液中加入nmnat-ppa1共表达菌发酵液51ml(发酵液菌体湿重196g/l)，加水定容至400ml，控制反应温度37℃，维持反应体系ph8.0，开始第1步计时反应，hplc监控反应进程，反应3.0h，nmn转化率99.4％，结束第1步合成。
179.第2步合成：原位以磷酸调节第1步合成液ph至6.0，加入mfnk表达菌发酵液55ml(发酵液菌体湿重182g/l)，称取37.59g四聚磷酸钠并配制成1m母液备用，控制反应体系温度为45℃，开始流加四聚磷酸钠母液，四聚磷酸钠母液以蠕动泵匀速流加入反应体系，控制流加时间为4h，维持反应体系温度及ph，开始第2步合成计时，hplc监控反应进程，反应6.0h，nad转化率99.3％，结束第2步合成，nadp产品浓度109.61g/l，全合成nmn转化率98.7％。

技术特征：
1.一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：第1步反应：在反应体系i中，以烟酰胺单核苷酸(nmn)，和三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐为底物，在烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nmnat)的催化下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和焦磷酸；可选的，在无机焦磷酸酶(ipp1)的催化下水解所述焦磷酸，促进反应正向进行；第2步反应：在反应体系ii中，第1步反应生成的所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在磷酰基供体的参与下，在atp/多聚磷酸依赖型nad激酶(mfnk)的催化下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶来源于地狱甲烷球菌(methanocaldococcus infernus)，所述无机焦磷酸酶来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)s288c菌株，所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶来源于黄色微球菌(micrococcus flavus)；优选地，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶选自如下(a1)～(a4)中的任一项：(a1)包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；(a2)具有如seq id no.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；(a3)由编码(a1)或(a2)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；(a4)由与seq id no.2或seq id no.3所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的多肽；所述无机焦磷酸酶选自如下(b1)～(b4)中的任一项：(b 1
)包含如seq id no.4所示的氨基酸序列，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；(b 2
)具有如seq id no.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；(b 3
)由编码(b 1
)或(b 2
)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；(b 4
)由与seq id no.5所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有无机焦磷酸酶活性的多肽；所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶选自如下(c1)～(c4)中的任一项：(c 1
)包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽；(c 2
)具有如seq id no.6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的序列，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽；(c 3
)由编码(c 1
)或(c 2
)所示氨基酸序列的多核苷酸编码的多肽；(c 4
)由与seq id no.7或seq id no.8所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列编码的，且具有atp/多聚磷酸依赖型nad激酶活性的多肽。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶、所述无
机焦磷酸酶和所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶以纯酶，或粗酶，或表达其的宿主细胞破碎液，或表达其的宿主细胞的形式参与反应；可选地，在所述反应体系i或所述反应体系ii中，表达所述烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的宿主细胞、表达所述无机焦磷酸酶的宿主细胞和表达所述atp/多聚磷酸依赖型nad激酶的宿主细胞的湿重浓度分别独立的为5g/l～50g/l。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第1步反应和第2步反应在反应介质中进行，所述反应介质为磷酸盐缓冲溶液、tris-hcl缓冲溶液或纯水；可选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mm～100mm。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，在所述反应体系i中，所述烟酰胺单核苷酸的初始浓度为50mm～400mm；优选地，在所述反应体系i中，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐的初始摩尔比为1:1～1:1.5。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系i中还包含二价金属离子；优选地，所述二价金属离子包括镁离子和/或锰离子；优选地，在所述反应体系i中，所述镁离子的浓度为1mm～60mm，所述锰离子的浓度为0.5mm～40mm。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系i中还包含曲拉通x-100；优选地，在所述反应体系i中，所述曲拉通x-100的浓度为0.1％(v/v)～0.2％(v/v)。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系i的ph为7.0～10.0，所述第1步反应的反应温度为25℃～42℃，所述第1步反应的反应时间为1.0h～6.0h。9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，在所述反应体系ii中，所述磷酰基供体为无机磷酸盐，优选的磷酰基供体为多偏磷酸盐或多聚磷酸盐；优选地，以所述烟酰胺单核苷酸在所述反应体系i中的初始量为基础，所述烟酰胺单核苷酸与所述反应体系ii中的磷酰基供体的摩尔比为1:0.6～1:1.5；优选地，在所述第2步反应中，所述磷酰基供体以液体流加方式加入反应体系，流加时间控制为1.0h-8.0h。10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系ii的ph为5.0～8.0，所述第2步反应的反应温度为30℃～60℃，所述第2步反应的反应时间为1.5h～15.0h。

技术总结
本发明涉及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，所述方法包括如下步骤：第1步反应：在反应体系I中，以NMN，和三磷酸腺苷或三磷酸腺苷盐为底物，在NMNAT的催化下，生成NAD和焦磷酸；可选的，在IPP1的催化下水解所述焦磷酸，促进反应正向进行；第2步反应：在反应体系II中，第1步反应生成的所述NAD在磷酰基供体的参与下，在MfnK的催化下，生成NADP。本发明提供的方法底物成本适中，工艺路线短，原子经济性高，副产物少；通过优选酶源及合成条件，合成时间短，酶催化效率高，底物耐受强，合成转化率高，可满足高浓度底物高效催化合成NADP。可满足高浓度底物高效催化合成NADP。可满足高浓度底物高效催化合成NADP。


技术研发人员：陈永贵 李家龙 杨述章 任杰 范谦
受保护的技术使用者：湖南利尔生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/12