一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽的制备方法与流程

1.本发明涉及油用牡丹籽技术领域，具体涉及一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽的制备方法。


背景技术：

2.籽粕为油用牡丹榨油后的主要副产物，其中膳食纤维含量为 48.7 %，蛋白质含量为20.2 %。高蕾蕾等通过碱溶酸沉法提取牡丹蛋白，经优化后得到最佳提取条件为 3.5 h，ph 9.5，最适温度 60
ꢀº
c，料液比 1:10（g/ml），此时提取率最高达到了42.74 %，并且研究了牡丹蛋白的理化性质、功能特性（溶解度、持水性、持油性、乳化性、起泡性和凝胶形成能力）及抗氧化活性，在 dpph 自由基清除实验和羟基自由基清除实验等一系列抗氧化指标实验中，酶解产物的活性均高于谷胱甘肽，且优于牡丹蛋白。牛亚琪等人优化了从牡丹籽粕中超声提取芪类化合物和单萜苷类化合物的条件，并与大孔吸附树脂实验相结合，创建了一套快捷且实用的提取纯化低聚芪类化合物的工艺流程，可用于牡丹油产业副产物的加工利用。
3.然而，对牡丹籽粕进行回收利用仍然具有十分重要的意义，能够提供对其资源回收利用率，同时还能为其具有的生物活性发挥更大利用价值提供帮助。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽的制备方法。利用该制备方法能够从牡丹籽粕中回收得到一些调节调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽，这些小分子牡丹活性肽具有应用于调节血糖血脂的相关制剂中的应用前景。
5.本发明目的之一提供一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽，其选自如seq id no.1~3任一所述的肽。
6.本发明目的之一提供一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性糖肽，其选自如seq id no.1~3任一所述的肽进行糖基化修饰得到的化合物。
7.进一步的，所述的小分子牡丹活性糖肽，其包括如seq id no.2或3任一所述的肽进行糖基化修饰得到的化合物或其混合物。
8.本发明目的之一提供一种所述的小分子牡丹活性肽的制备方法，包括：得到去油和去糖后的牡丹籽粕；将所述去油和去糖后的牡丹籽粕进行酶解，从所述酶解液中分离纯化得到所述小分子牡丹活性肽。
9.进一步的，得到去油和去糖后的牡丹籽粕的步骤包括：将油用牡丹籽粕用粉碎后，过筛，采用水浴回流法去除所述牡丹籽粕中的油脂；将脱油后的牡丹籽粕干燥后，去除其中的多糖，即可得到所述去油和去糖后的牡丹籽粕。
10.进一步的，所述水浴回流法包括：将过筛后的牡丹籽粕粉与石油醚以1:10g/ml，50
℃反应4h，提取3次；所述“去除其中的多糖”的步骤包括：将脱油后的牡丹籽粕以1:20g/ml沸水浴回流4h。
11.进一步的，所述酶解的步骤包括：将所述去油和去糖的牡丹籽粕用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合，于ph6.5、50℃酶解4h；迅速转入100℃水浴中处理10min，使得酶失活，8000rpm离心10min；上清液继续加入胰蛋白酶，于ph2.5、37℃酶解4h，迅速转入100℃水浴中处理10min，使得酶失活，8000rpm离心10min，上清液依次经依次过5kd、3kd和1kd的超滤膜，收集5kd~3kd、3kd~1kd和1kd的3个部分的滤液，适当浓缩，冷冻干燥，即得不同分子量段的小分子牡丹活性肽。
12.本发明目的之一提供一种所述的小分子牡丹活性糖肽的制备方法，包括：配制含所述的小分子牡丹活性肽的溶液，加入半乳糖和焦磷酸，搅拌混匀后冻干，在55℃和65%相对湿度中孵育3h，在冰浴中停止反应，从反应物中分离所述小分子牡丹活性糖肽。
13.本发明目的之一提供一种降血糖、降血脂的制剂，其包含50~1000 μg/l的所述的小分子牡丹活性肽及其混合物，或者包含50~1000 μg/l的所述的小分子牡丹活性糖肽及其混合物。
14.本发明目的之一提供所述的小分子牡丹活性肽、或所述的小分子牡丹活性糖肽在制备降血糖降血脂制剂中的应用。
15.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：本发明利用油用牡丹籽粕作为原料，对其进行去油和去糖处理，再进行多个酶解处理，得到酶解液，并从酶解液中分离了3个不同分子量的小分子牡丹活性肽。进一步的，本发明还对这3个不同分子量的小分子牡丹活性肽进行了糖基化修饰，得到了3个小分子牡丹活性糖肽。
16.经过体外降血糖实验证实，此3个小分子牡丹活性肽和3个小分子牡丹活性糖肽均具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且糖基化修饰有利于葡萄糖的吸附，使得其在胃肠道中的吸收更有利。不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3对3t3-l1细胞无明显的细胞毒性。本发明提供的小分子牡丹活性糖肽1、小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3能够改善ir模型细胞摄取葡萄糖的能力以达到降低血糖血脂的效果。
17.经过体外降血压实验证实，不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3对vsmc细胞无明显的细胞毒性。本发明提供的小分子牡丹活性糖肽2、小分子牡丹活性糖肽3能够抑制angii诱导的vsmc细胞迁移，并呈现一定的浓度依赖性。本发明提供的小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3能够减轻angⅱ诱导的细胞氧化应激的程度，使细胞恢复正常水平，达到降血压作用。
18.经过体外降尿素实验证实，不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3对hk-2 细胞无明显的细胞毒性。本发明提供的小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3还具有明显的降尿酸作用。
附图说明
19.图1为小分子牡丹活性糖肽1（左）和小分子牡丹活性肽1（右）的凝胶色谱图。
20.图2为小分子牡丹活性糖肽2（左）和小分子牡丹活性肽2（右）的凝胶色谱图。
21.图3为小分子牡丹活性糖肽3（左）和小分子牡丹活性肽3（右）的凝胶色谱图。
22.图4为小分子牡丹活性肽1~3和小分子牡丹活性糖肽1~3分别对应的gdri值结果图。
23.图5为不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对3t3-l1细胞的存活率结果。
24.图6为ir模型细胞微观图。
25.图7示出了不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对ir模型细胞细胞处理后的葡萄糖含量结果图。
26.图8为不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对vsmc细胞的存活率结果。
27.图9示出了不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对高血压症模型细胞处理后的细胞迁移率结果图。
28.图10示出了不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对高血压症模型细胞处理后的细胞ros释放量结果图。
29.图11示出了不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对hk-2 细胞的存活率结果图。
30.图12示出了不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对高尿酸血症模型细胞处理后的的细胞上清液中尿酸含量结果图。
31.图13出了不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3分别对神经细胞凋亡模型处理后的存活率结果图。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
33.1、材料油用牡丹籽粕，江苏国色天香油牡丹技术开发有限公司。
34.2、原材料的预处理将油用牡丹籽粕用粉碎机粉碎，过40目筛得到粉末样品，然后放置于数显鼓风干燥箱内干燥直至质量恒定。采用水浴回流法，将牡丹籽粕中的残留的油去除干净，牡丹籽粕的质量与石油醚的体积比为1:10g/ml，提取3次，50℃反应4h。将脱油后的牡丹籽粕置于60℃烘箱中干燥，然后进一步提取脱油粉末中的多糖。提取条件：料液比为1:20g/ml，沸水浴回流4h。反应结束后离心收集沉淀物，将去糖粉末在100℃烘箱中干燥，然后置于棕色干燥器中，储存在0~4℃冷库中进行后续实验。将去油和去糖后的牡丹籽粕作为酶解多肽提取的原料。
35.3、酶解将经去油和去糖处理的牡丹籽粕40g，加入100ml蒸馏水，高温高压灭菌10min，冷却至室温后再加入100ml灭菌蒸馏水。加入60000u的胃蛋白酶（cas：9001-75-6，湖北帝柏化工有限公司）和60000u木瓜蛋白酶（cas：9001-73-4，河北创之源生物科技有限公司），用0.5mol/l的盐酸溶液调节ph6.5，50℃酶解4h，迅速转入100℃水浴中处理10min，使得酶失活，8000rpm离心10min。上清液继续加入60000u的胰蛋白酶（cas：9002-07-7，北京诺其雅盛生物科技有限公司），用0.5mol/l的盐酸溶液调ph2.5，37℃酶解4h，迅速转入100℃水浴中处理10min，使得酶失活，8000rpm离心10min，上清液依次经依次过5kd、3kd和1kd的超滤膜，收集5kd~3kd、3kd~1kd和1kd的3个部分的滤液，适当浓缩，冷冻干燥（-50℃，4~5pa），即得不同分子量段的小分子牡丹活性肽，称重，记录并计算总重，以总重为100%；其中，5kd~3kd组分占49.7%，3kd~1kd组分占35.9%，1kd组分占14.4%。
36.使用rp-hplc对5kd~3kd、3kd~1kd和1kd的3个组分进行分离纯化。色谱柱为syncronis
™ꢀ
c18 hplc 色谱柱（5.0μm，25
×
250mm，97105-259270xl，thermo scientific），紫外检测器检测波长为214nm，流动相a为含0.1%三氟乙酸（tfa）的超纯水，流动相b为含有0.1%tfa的乙腈。流动相均需通过0.22μm滤膜过滤并且使用超声脱气处理。多肽样品以50μg/l的浓度进样200μl，洗脱条件为5~60min，5~65%b（梯度洗脱），流速为5.0ml/min。收集峰尖位置，将所得溶液减压蒸馏后除去有机溶剂，产物冷冻干燥，置于-80℃以备后续实验。
37.分别收集5kd~3kd、3kd~1kd和1kd的3个组分中所得色谱峰分离度优良、峰面积最大的3个组分进行收集，浓缩，冷冻干燥，分别得到3个肽组分溶解于nano-rplc缓冲液a（含0.1％甲酸的超纯水）中，在c-18分析柱（2μm,50
×
150mm）上分离：1min，流动相b（含有0.1%甲酸的乙腈）2%-8%，23min，8-30%b，1min，30-100%，并在100%b的条件下保持8min。通过配置有纳米喷雾的qexactiveplus系统（thermofisher）采集数据，质谱（ms）以阳离子模式进行检测，质量范围：350-1800m/z，完全ms扫描分辨率设置为70k，高能碰撞解离（hcd）ms/ms扫描分辨率设置为17.5k，动态排除30s，自动增益控制（agc）目标值为105，质量分辨率为70000，隔离窗口为1.6m/z。电荷状态≥20个的最强峰被碎片化，归一化碰撞能量为28%。通过xcalibur2.2（thermofisherscientific）检测原始数据。使用peaksstudio（versionx）软件的denovo模块对nanolc-esi-ms/ms的数据进行从头测序分析，主要参数设置如下：平均局部置信度（alc）》90，母体质量误差公差（parentmasserrortolerance）。将质谱原始文件使用maxquant (1.6.2.10)软件在uniprot ( http://www.uniprot.org/)数据库和ncbi数据库中进行肽指纹图谱检索，寻找相关匹配的肽序列。
38.结果可知，从5kd~3kd组分中得到小分子牡丹活性肽1的氨基酸序列如seq id no.1所示，lrvdgvlmrlrdtrmhcvfgdsvnptilreicwre，参考序列为tip41样蛋白 [paeonia suffruticosa] anc98509.1；从3kd~1kd组分中得到小分子牡丹活性肽2的氨基酸序列如seq id no.2所示，wgahgggafsgkd，参考序列为s-腺苷甲硫氨酸合成酶[paeonia suffruticosa] anc98510.1；从1kd组分中得到小分子牡丹活性肽3的氨基酸序列如seq id no.3所示，flelsrr，参考序列为亲环素[paeonia suffruticosa]anc98512.1。
[0039]
4、糖基化修饰用含0.1％甲酸的超纯水溶解上述得到的如seq id no.1~3任一所示的小分子牡
丹活性肽1~3，使其质量浓度为1μg/l。将3mg半乳糖和3mg焦磷酸钠分别溶于3ml含小分子牡丹活性肽1~3的溶液中，搅拌混匀后冻干，在55℃和65%相对湿度中孵育3h。孵育结束后在冰浴中停止反应，使用5kda的的超滤离心管除去小分子牡丹活性肽1修饰反应物中未反应的半乳糖和焦磷酸钠，使用3kda的超滤离心管除去小分子牡丹活性肽2修饰反应物中未反应的半乳糖和焦磷酸钠，使用1kda的超滤离心管除去小分子牡丹活性肽3修饰反应物中未反应的半乳糖和焦磷酸钠。
[0040]
将小分子牡丹活性肽1~3分别被半乳糖修改后的反应液经超滤浓缩后，冷冻干燥，得到小分子牡丹活性肽1~3糖基化修饰物的冻干品（小分子牡丹活性糖肽1~3）。分别用流动相制备成1μg/l的小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液以及1μg/l的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，进行sephadex g10凝胶色谱分析，色谱柱：sephadex g10分析柱（粒度40~120
µ
m,10
×
400mm，依利特），流动相：ph6.8的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液，流量：1.5ml/min，进样体积：100μl，检测波长：uv254nm。
[0041]
图1示出了小分子牡丹活性糖肽1和小分子牡丹活性肽1的凝胶色谱图。图2示出了小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性肽2的凝胶色谱图。图3示出了小分子牡丹活性糖肽3和小分子牡丹活性肽3的凝胶色谱图。如图1~3可知，小分子牡丹活性肽1~3被成功修饰。
[0042]
体外降血糖活性的测定1、α-葡萄糖苷酶抑制率的测定用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制含有1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l和50μg/l浓度的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，以及含小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。
[0043]
取100
µ
l的样品液，加入50
µ
l使用ph=7.0pbs缓冲溶液配制的1u/ml的α-葡萄糖苷酶，在37℃的条件下孵育15min，以50
µ
l、10g/l的对硝基苯α-葡萄糖苷作为底物，混匀后于37℃进行水浴10min，最后用100
µ
l、0.1mol/l的na2co3终止反应，在405nm处测量吸光度，记为a1，将不加酶的作为对照，记为a2，不受抑制的酶作为空白，记为a3。以样品的浓度为自变量，α-葡萄糖苷酶抑制率为因变量，进行一次曲线拟合，根据拟合方程计算ic50值，其中，α-葡萄糖苷酶抑制率=（1－（a1－a2）/a3）
×
100%。
[0044]
结果可知，小分子牡丹活性肽1~3分别对α-葡萄糖苷酶抑制率的ic50值分别为20.47
±
3.54μg/l、2.35
±
0.63μg/l和1.64
±
0.43μg/l。小分子牡丹活性糖肽1~3分别对α-葡萄糖苷酶抑制率的ic50值分别为12.28
±
2.09μg/l、0.78
±
0.15μg/l和0.29
±
0.07μg/l。由此说明，小分子牡丹活性肽2和小分子牡丹活性肽3具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制率，并且进行糖基修饰后，其α-葡萄糖苷酶抑制率进一步提升。
[0045]
2、葡萄糖透析延迟指数(gdri)的测定用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制含有不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，以及含小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。
[0046]
在10ml、100mmol/l的葡萄糖溶液中加入1ml样品，在37℃下恒温连续振荡1h，之后转移至截留分子量为7000的透析袋中，将透析袋放入盛有150ml去离子水的烧杯中，在37℃下恒温连续振荡1h，每隔30min吸取2ml样液，使用下述pmp衍生法的测定其中葡萄糖含量。样品对空肠营养吸收的的影响用gdri来表示，gdri =（1－c1/c2）
×
100%；式中c1为样品中葡萄糖含量，g/l；c2为对照葡萄糖含量，g/l。
[0047]
葡萄糖含量的检测方法：分别称取葡萄糖0.0180g、0.0360g、0.0540g、0.0720g溶
于5ml氨水中，取该溶液100
µ
l与100
µ
l的pmp/甲醇溶液(0.5mol/l)混合，在70℃下反应30min。取出后冷却至室温，加入1.5ml纯水，真空干燥，重复2次。干燥后的物质用lml纯水及lml氯仿溶解，充分振荡后除去有机相，重复3次。水相溶液经13000r/min高速离心2min后，用水稀释20倍，进行hplc分析流动相：ph5.5、100mm醋酸铵缓冲溶液/乙睛(体积比为78:2)，等度洗脱，流速：1ml/min，紫外检测波长:245nm，进样量:10
µ
l，柱温:室温。
[0048]
图4示出了小分子牡丹活性肽1~3和小分子牡丹活性糖肽1~3组别分别对应的gdri值在透析30min后，均超过了50%，并且小分子牡丹活性肽2、小分子牡丹活性肽3高于小分子牡丹活性肽1，糖基化修饰后其gdri值进一步升高。由此说明，糖基化修饰有利于葡萄糖的吸附，使得其在胃肠道中的吸收更有利。
[0049]
3、体外降血糖生物活性测定（1）试剂配制用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制含有50~1000 μg/l的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，以及含小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。
[0050]
完全培养基：dmem，10%fbs（v/v），1%抗生素（v/v）。
[0051]
诱导分化培养基1：dmem，10%ncs（v/v），1%抗生素（v/v），0.5mmol/l ibmx，1μmol/ml地塞米松，10μg/ml胰岛素。
[0052]
诱导分化培养基2：dmem，10%fbs（v/v），1%抗生素（v/v），10μg/ml胰岛素。
[0053]
3t3-l1细胞培养（品牌：抚生，规格：1
×
106cells，货号x120337）复苏后，细胞完全培养基中培养，放入 37 ℃、5% co2的培养箱中静置培养，当细胞长至对数期时进行传代。
[0054]
（2）3t3-l1细胞毒性实验将细胞培养至对数期，以每毫升1
×
105个细胞的密度接种至96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，放入培养箱中培养48h。弃去旧培养基，加入 100 μl 浓度为 50~1000 μg/l 的样品，样品用完全培养基溶解，0.22 μm 滤头过滤后稀释。同时设置不添加样品的对照组、不添加样品和细胞的调零组，每组设置6个复孔。继续培养 24 h 后，每孔加入 10
ꢀµ
l 的 cck-8 染色液，将培养板放入培养箱中孵育2 h。置于酶标仪上于 450 nm 处测定各孔光密度（od）值，根据每孔od 值，计算样品干预后细胞存活率=(od1－od2)/(od3－od2)
×
100%。其中，od1为样品孔的吸光值，od2为调零孔的吸光值，od3为对照孔的吸光值。结果如图5所示，不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3对3t3-l1细胞无明显的细胞毒性。
[0055]
4、3t3-l1细胞ir模型的建立及分组实验使用“鸡尾酒”法诱导3t3-ll细胞分化，先使用完全培养基将3t3-ll细胞以每毫升1
×
105个细胞的密度接种于12孔板，每孔1ml。细胞融合48h后，更换诱导分化培养基1刺激分化。48h后更换诱导分化培养基2，之后更换成完全培养基继续培养2~4天，当细胞呈现“指环状”脂肪细胞时，表明ir模型建立成功。如图6所示，ir模型细胞成“指环状”的油滴，对葡萄糖的摄取能力会降低。
[0056]
实验分为模型组、阳性组、样品组和对照组。模型组为上述ir模型细胞。阳性组是向上述ir模型细胞加10
µ
m的阳性药物地黄寡糖(依据cn1900100a公开的方法制得)，样品组加入用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制的含有50、100、200 μg/l的小分子牡丹活性肽1~3的样品液、或者含50、100、200 μg/l小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。处理48h后，收集培养
基，检测其中葡萄糖含量（检测方法同上）。
[0057]
图7示出了各组细胞处理后的葡萄糖含量。对照组、阳性组的葡萄糖浓度均显著低于模型组，说明模型建立成功。样品组中，小分子牡丹活性肽1~3分别处理ir模型细胞后，其葡萄糖含量低于模型组，小分子牡丹活性糖肽1、小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3处理细胞后葡萄糖含量也低于模型组，且对应对于小分子牡丹活性肽1~3，说明本发明提供的小分子牡丹活性糖肽1、小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3能够改善ir模型细胞摄取葡萄糖的能力以达到降低血糖的效果。就细胞水平而言，3t3-l1细胞ir模型摄取葡萄糖能力降低是由于细胞的葡萄糖转运蛋白表达减少，囊泡转运受阻；而采用本发明提供的小分子牡丹活性糖肽1~3对模型细胞进行处理后，其对葡萄糖摄取和吸收能力增强。
[0058]
体外降血压活性的测定1、试剂配置基础培养基：dmem。完全培养基：dmem，10% fbs（v/v，1%抗生素（v/v）。模型培养基：dmem，1% fbs（v/v），1%抗生素（v/v）。
[0059]
vsmc 细胞培养：ha-vsmc细胞（上海弘顺生物科技有限公司）复苏后，细胞完全培养基中培养，放入 37 ℃、5% co（2 v/v）的培养箱中静置培养，当细胞长至对数期时进行传代。
[0060]
2、细胞毒性试验用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制含有不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，以及含小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。
[0061]
将细胞培养至对数期，以每毫升1
×
105个细胞的密度接种至96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，放入培养箱中培养48h。弃去旧培养基，加入 100 μl 浓度为 50~1000 μg/l 的样品，样品用完全培养基溶解，0.22 μm 滤头过滤后稀释。同时设置不添加样品的对照组、不添加样品和细胞的调零组，每组设置6个复孔。继续培养 24 h 后，每孔加入 10
ꢀµ
l 的 cck-8 染色液，将培养板放入培养箱中孵育 2 h。置于酶标仪上于 450 nm 处测定各孔光密度（od）值，根据每孔od 值，计算样品干预后细胞存活率=(od1－od2)/(od3－od2)
×
100%。其中，od1为样品孔的吸光值，od2为调零孔的吸光值，od3为对照孔的吸光值。结果如图8所示，不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3对vsmc细胞无明显的细胞毒性。
[0062]
3、划痕试验先用记号笔在 6 孔板背面做好标记，每孔间隔相等距离（0.5~1 cm）水平横向画线，每孔至少穿过 3条线。选对数生长期的细胞调整浓度为 1
×
10
5 个/ml均匀接种于 6 孔板中，细胞铺满板底后，更换模型培养基继续培养 24 h。按标记线以垂直方向平均相等距离使用无菌 200
ꢀµ
l 枪头快速划下，pbs 漂洗，去除漂浮细胞，然后加入含有终浓度为 1μmol/l 的 ang
‑ⅱ
和 100、200 μg/ml 样品的样品组，同时设置 1 μmol/l angⅱ的模型组、不做处理的对照组。使用倒置显微镜观察细胞迁移程度并拍照，即 0 h细胞迁移状态。再将细胞放入培养箱中培养 24 h 后取样拍照记录。以上均用显微镜在 4 倍镜下记录细胞迁移状态，采用 image j 软件对迁移距离进行分析，计算细胞划痕率=(l1－l2)/l1
×
100%，式中，l1为 0h 划痕宽度，l2为 24 h 划痕宽度。
[0063]
高血压症大多数是由vsmc细胞的迁移和侵袭所造成，而angii作为调节血管的关键活性物质可以诱导细胞迁移，因而抑制angii诱导的vsmc细胞过度迁移是预防心血管相关疾病发生和发展的重要途径之一。图9示出了各组细胞迁移率。相对于对照组，模型组的细胞迁移率显著增加，说明采用angii能够诱导细胞迁移。而小分子牡丹活性糖肽2、小分子牡丹活性糖肽3分别在100μg/ml时对angii诱导的细胞迁移具有显著抑制作用，而且细胞迁移率均降低了至少10%，而小分子牡丹活性肽1~3、小分子牡丹活性糖肽1和小分子牡丹活性糖肽2则无明显的降低细胞迁移率的效果。由此说明，本发明提供的小分子牡丹活性糖肽2、小分子牡丹活性糖肽3能够抑制angii诱导的vsmc细胞迁移，并呈现一定的浓度依赖性。
[0064]
4、样品对vsmc细胞ros释放量的影响将vsmc细胞培养至对数期，以每毫升1
×
105个细胞的密度接种至96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，放入培养箱中培养过夜。弃去96孔板中培养基，将培养基换成模型培养基培养24h。再分别加入100μl含有终浓度为1μmol/l的ang
‑ⅱ
和50、100或200μg/ml样品的培养基，继续培养24h。去除细胞培养基，加入100μmol/l的dcfh-da探针（cas：4091-99-0，99.81%，medchemexpress），于培养箱内孵育20min。用基础培养基洗涤细胞三次，于488nm激发波长，525nm发射波长荧光酶标仪测定。
[0065]
当机体处于氧化应激状态时，细胞受到损伤，大量的 ros 的积累会导致 vsmc 细胞的不正常增殖和迁移，从而逐步诱发高血压症。因此，调节细胞活性氧的释放量有助于调节高血压症。图10示出了各组细胞的ros释放量。模型组的ros 释放量较对照组显著增多，说明造模成功。小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3分别在50、100和200 μg/ml浓度时对 angⅱ诱导的细胞 ros 释放量均有抑制作用，且200 μg/ml 浓度时极显著抑制。而小分子牡丹活性肽1~3以及小分子牡丹活性糖肽1在不同浓度下对angⅱ诱导的细胞 ros 释放量的抑制作用有限。由此说明，本发明提供的小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3能够减轻angⅱ诱导的细胞氧化应激的程度，使细胞恢复正常水平，达到降血压作用。
[0066]
体外降尿素生物活性1、试剂配置基础培养基：rpmi 1640。完全培养基：rpmi 1640，10% fbs（v/v），1%抗生素（v/v）。
[0067]
用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制含有50~1000 μg/l的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，以及含小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。
[0068]
2、细胞培养hk-2 细胞（货号kl096h，康朗生物）复苏后，细胞完全培养基中培养，放入 37 ℃、5% co2的培养箱中静置培养，当细胞长至对数期时进行传代。
[0069]
3、细胞毒性试验将细胞培养至对数期，以每毫升 1
×
10
5 个细胞的密度接种至 96 孔板，每孔加入100
ꢀµ
l细胞悬液，放入培养箱中培养过夜。弃去旧培养基，加入 100 μl 浓度为 50~1000 μg/l 的样品，样品用完全培养基溶解，0.22 μm 滤头过滤后稀释。同时设置不添加样品的对照组、不添加样品和细胞的调零组，每组设置6个复孔。继续培养 24 h 后，每孔加入 10
ꢀµ
l 的 cck-8 染色液，将培养板放入培养箱中孵育 2 h。置于酶标仪上于 450 nm 处测定各孔光密度（od）值，根据每孔od 值，计算样品干预后细胞存活率=(od1－od2)/(od3－od2)
×
100%。其中，od1为样品孔的吸光值，od2为调零孔的吸光值，od3为对照孔的吸光值。结果
如图11所示，不同浓度的小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3对hk-2 细胞无明显的细胞毒性。
[0070]
4、hk-2细胞高尿酸血症模型的建立及分组实验腺苷是尿酸的前提物质，配合黄嘌呤氧化酶培养hk-2细胞，能够促进细胞持续显著产生尿酸。将 hk-2 细胞用完全培养基在细胞培养箱培养，取处于对数生长期的细胞按照每毫升 1
×
10
5 个细胞的密度接种在 24 孔板上，细胞培养箱培养 24 h。24 h后弃去培养基，pbs 洗涤 3 次，对照组、模型组加入新的基础培养基，阳性对照组加入30 μmol/l 非布司他片溶液（用ph=7.0 pbs缓冲溶液，西安维珍生物），给药组加入样品，放入培养箱中培养。24 h 后pbs 洗涤 3 次，模型组和给药组加入用基础培养基配 制的浓度为 2.5 mmol/l 的腺苷溶液，培养箱中孵育30 h。再在 24 孔板中各孔加入浓度为 0.005 u/ml 的xod 溶液（cas：9002-17-9，上海宝曼生物科技），孵育 8 h 后收集上清液，液相检测其中尿酸含量。
[0071]
尿酸检测方法：色谱柱:varian microsorb-mv c18柱(150mm
×
4.6 mm，5
µ
m)；流动相a: 0.2 mol/l kh2po4，0.52 mmol/l戊烷磺酸钠，ph 4.0；流动相b: 0.2 mol/l kh2po4，0.52 mmol/l戊烷磺酸钠，10%乙睛，ph 4.0；柱温35℃，检测波长254 nm，进样量20
µ
l，流速1ml/min。
[0072]
取细胞上清液1 ml，过膜(0.22
µ
m)，hplc分上清液中物质的含量，用尿酸标曲定量。
[0073]
图12示出了各组hk-2 细胞经实验后的细胞上清液中尿酸含量，模型组尿酸含量显著高于对照组，说明造模成功。采用阳性药物非布司他片进行干预后，尿酸含量下降至低于模型组，甚至低于对照组，说明非布司他片对能够极显著降低细胞模型尿酸含量，该模型是可行。
[0074]
用浓度为50、100、200 μg/ml 的样品液（小分子牡丹活性肽1~3或小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液）干预细胞后，降尿酸结果如图12所示。小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3分别在100和200 μg/ml时与未加样品的 control 组相比，尿酸含量均呈现不同程度的下降，并且在200 μg/ml浓度下，尿酸含量下降至与对照组相当，说明本发明提供的小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3具有明显的降尿酸作用。
[0075]
5、cck-8法检测不同浓度人参糖肽与ａβ25-35处理pc12细胞的存活率用ph=7.0 pbs缓冲溶液分别配制含有50μg/l的小分子牡丹活性肽1~3的样品液，以及含小分子牡丹活性糖肽1~3的样品液。
[0076]
选择生长期的pc12细胞(武汉普诺赛) 接种于96孔板上，培养过夜，弃去培养基，分为对照组（不加入其他干预样品）、模型组（加入100μｌ、50μm的ａβ25-35，sigma-aldrich公司，用双蒸水配成浓度为1mm的溶液，预先老化7天），以及给药组（加入100μｌ、50μm的ａβ25-35，以及100、50μg/l的样品液）。培养4h，每组设3个复孔，置培养箱中培养48h，计算各组细胞存活率＝模型组或给药组ａ值/对照组ａ值
×
100％。
[0077]
图13示出了各组细胞存活率结果。由图13可知，相对于对照组，模型组pc12细胞的存活率显著降低，说明ａβ25-35能够作用pc12细胞促使其凋亡，说明ａβ25-35诱导的神经细胞凋亡模型建立成功。而在与不同浓度的小分子牡丹活性糖肽2和小分子牡丹活性糖肽3共同孵育后，pc12细胞的存活率得以提升，并且呈现剂量依赖性。由此说明，本发明提供的
表明糖肽不仅能够抑制细胞凋亡，还能促进细胞增殖，而人参糖肽改善学习记忆功能的作用可能与保护神经元、减少细胞凋亡有直接关联。
[0078]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽，其选自如seq id no.1~3任一所述的肽。2.一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性糖肽，其选自如seq id no.1~3任一所述的肽进行糖基化修饰得到的化合物。3.根据权利要求2所述的小分子牡丹活性糖肽，其包括如seq id no.2或3任一所述的肽进行糖基化修饰得到的化合物或其混合物。4.一种如权利要求1所述的小分子牡丹活性肽的制备方法，其特征在于，包括：得到去油和去糖后的牡丹籽粕；将所述去油和去糖后的牡丹籽粕进行酶解，从所述酶解液中分离纯化得到所述小分子牡丹活性肽。5.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，得到去油和去糖后的牡丹籽粕的步骤包括：将油用牡丹籽粕用粉碎后，过筛，采用水浴回流法去除所述牡丹籽粕中的油脂；将脱油后的牡丹籽粕干燥后，去除其中的多糖，即可得到所述去油和去糖后的牡丹籽粕。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述水浴回流法包括：将过筛后的牡丹籽粕粉与石油醚以1:10g/ml，50℃反应4h，提取3次；所述“去除其中的多糖”的步骤包括：将脱油后的牡丹籽粕以 1:20g/ml沸水浴回流4h。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的步骤包括：将所述去油和去糖的牡丹籽粕用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合，于ph6.5、50℃酶解4h，；迅速转入100℃水浴中处理10min，使得酶失活，8000rpm离心10min；上清液继续加入胰蛋白酶，于ph2.5、37℃酶解4h，迅速转入100℃水浴中处理10min，使得酶失活，8000rpm离心10min，上清液依次经依次过5kd、3kd和1kd的超滤膜，收集5kd~3kd、3kd~1kd和1kd的3个部分的滤液，适当浓缩，冷冻干燥，即得不同分子量段的小分子牡丹活性肽。8.一种如权利要求2或3所述的小分子牡丹活性糖肽的制备方法，其特征在于，包括：配制含权利要求1所述的小分子牡丹活性肽的溶液，加入半乳糖和焦磷酸，搅拌混匀后冻干，在55℃和65%相对湿度中孵育3h，在冰浴中停止反应，从反应物中分离所述小分子牡丹活性糖肽。9.一种降血糖、降血脂的制剂，其包含50~1000 μg/l的如权利要求1所述的小分子牡丹活性肽及其混合物，或者包含50~1000 μg/l的如权利要求2或3所述的小分子牡丹活性糖肽及其混合物。10.权利要求1所述的小分子牡丹活性肽、或权利要求2或3所述的小分子牡丹活性糖肽在制备降血糖降血脂制剂中的应用。

技术总结
本发明涉及牡丹籽技术领域，具体涉及一种调节血糖血脂的小分子牡丹活性肽的制备方法。利用油用牡丹籽粕作为原料，对其进行去油和去糖处理，再进行多个酶解处理，得到酶解液，并从酶解液中分离了3个不同分子量的小分子牡丹活性肽。体外实验证实了这些小分子牡丹活性肽具有调节血糖血脂的作用。有调节血糖血脂的作用。有调节血糖血脂的作用。


技术研发人员：张跃忠
受保护的技术使用者：山东牡丹爱生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.03
技术公布日：2023/7/12