能够高效表达的嵌合抗原受体及分泌功能刺激因子IL-15的CAR-NK细胞的构建和应用的制作方法

能够高效表达的嵌合抗原受体及分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞的构建和应用
技术领域
1.本发明涉及细胞治疗技术领域，尤其涉及一种能够高效表达的嵌合抗原受体及分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞。


背景技术：

2.癌症是全球第二大死因，给社会造成沉重的伤害。一直以来，科学界一直致力于攻克癌症的研究，也在这方面取得了不错的成就。然而，肿瘤治疗的复杂性使得传统的小分子抑制剂、双抗以及单抗药物治疗在大部分肿瘤治疗上出现了瓶颈，因此急需开发先进有效的抗肿瘤药物来攻克这一难关。在这样的背景下，表达嵌合抗原受体（car）的t细胞免疫疗法就应运而生，并在临床治疗肿瘤方面发挥了巨大的前景，但是car-t细胞在治疗肿瘤方面存在很多不足之处，无法从患者体内获得足够量的t细胞、制造成本高昂、t细胞产生细胞因子风暴、对实体瘤的有效性并不理想以及对患者产生严重的毒副作用，严重限制了car-t细胞在临床肿瘤治疗方面的作用。
3.针对以上用t细胞进行免疫疗法的不足，科学界又将眼光放在了自然杀伤（nk）细胞身上，希望能用nk细胞制造car-nk细胞以此来替代car-t免疫疗法，考虑用nk细胞代替t细胞的原因主要包括：首先，与t细胞相比较nk细胞首先不会产生移植物抗宿主病，这就避免了因t细胞产生的抗宿主风险，由此大大提高了免疫疗法的安全性；其次，nk细胞不会分泌引起细胞因子释放综合征的炎症因子，如il-i、il-6等，这就降低了诱发患者发生细胞因子风暴和神经毒性等危及生命的不良可能事件。但与此同时，用nk细胞代替t细胞进行肿瘤免疫疗法也显现出了一些不足之处，比如经扩增的自体nk细胞的转移对于一些如转移性黑色素瘤、肾细胞或晚期胃肠道癌的实体肿瘤显示不出积极的临床效应，这主要归因于实体瘤患者过继输注nk细胞后nk细胞向肿瘤部位的运输和浸润减少、肿瘤微环境中抑制信号以及肿瘤细胞免疫原性的改变使得肿瘤细胞对nk细胞毒性缺乏敏感性以及抑制性免疫细胞改变nk细胞功能，以及未修饰的自体或异体细胞在循环中没有进一步的体外或体内刺激的情况下通常表现出弱的抗肿瘤细胞毒性等诸多因素使得肿瘤部位的nk细胞浸润和活化不良。因而，通过提高nk细胞定向肿瘤部位的浸润并加强nk细胞的杀瘤活性是提高nk细胞过继免疫治疗效果的根本途径。
4.基于nk细胞显现出的一些缺陷，又有了用白介素刺激nk细胞的扩增活化，将白介素与nk细胞联合用于治疗肿瘤的想法。也有研究用il-2刺激了nk-92细胞并用于治疗晚期肺癌，产生了较好的临床效应，但il-2会诱发调节性t细胞的刺激激活，这说明il-2并不能作为一种最优的刺激因子去刺激nk细胞活化并在肿瘤治疗中发挥作用。il-15作为趋化因子家族中的一员，是近几年发现的一种因子，可由活化的单核巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生，它与il-2在结构上有许多相似之处，可以利用il-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似il-2的生物学活性，它相较于il-2来说一个最大的特点就是不会
诱发调节性t细胞的激活；另外它能诱导b细胞增殖和分化，能够刺激t细胞和nk细胞增殖，诱导lak细胞活性，还能与il-12协同刺激nk细胞产生ifn-γ。正是由于il-15的这些特点，它走进了科学家的视线里，并且已经有研究证实了il-15对刺激nk细胞的作用并增强了nk细胞在杀伤肿瘤方面的功能，如经il-15刺激nk细胞在治疗急性髓性白血病、晚期非小细胞肺癌和小儿难治性实体瘤等多种症状中具有良好的可行性。正当人们看到了il-15刺激nk细胞在肿瘤治疗方面的希望时，又有研究发现打破了这一希望，有证据表明持续使用il-15作为外源性刺激因子刺激nk细胞会导致nk细胞发生功能性衰竭，这就大大限制了nk细胞在抗肿瘤治疗方面的功能作用。基于上述现有技术的缺陷，因此，只有找到更有效地促进nk细胞增殖，又能让nk细胞保持其持久的功能活性或者让nk细胞发挥更大的功能特点的方法，是nk细胞免疫疗法发挥出抗肿瘤效应的当务之急。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种能够高效表达的嵌合抗原受体及分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞的构建和应用，本发明基于嵌合抗原受体t细胞和nk细胞疗法的现状以及不足，提供能够高效表达的car-cd19分子并自分泌功能刺激分子il-15的、基于诱导多能干细胞（ips）分化的car-cd19-ips-ink细胞，这既克服了免疫疗法中的细胞来源不足问题，又能使car分子在nk细胞中高效稳定表达，且表达car-cd19分子的nk细胞通过分泌il-15使得细胞在杀伤肿瘤方面保持足够的细胞活力以及发挥持久的功能效应。
6.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：首先，本发明提供一种能够同时高效表达靶向cd19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为从n端到c端的氨基酸序列，这段序列包括：ef1a的启动子区域、cd8asp信号肽，胞外抗体结合结构域fmc63scfv、cd8铰链区、cd28tm跨膜结构域、胞内共刺激结构域cd28和4-1bb和cd3ζ三联体、p2a自剪切结构以及il-15原件序列。
7.优选地，所述信号肽区域为cd8asp信号肽，其优化氨基酸序列如seq id no：1所示，其编码核苷酸序列如seq id no：2所示。
8.优选地，所述胞外抗体结合结构域为fmc63scfv且包括重链可变区和轻链可变区以及linker，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：3所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：5所示，所述linker的氨基酸序列如seq id no：7所示，所述轻链可变区编码核苷酸序列如seq id no：4所示；所述重链可变区编码核苷酸序列如基因序列如seq id no：6所示；所述linker编码核苷酸如seq id no：8所示。
9.优选地，所述胞内铰链区与跨膜结构域为cd8铰链区组合cd28tm，所述cd8的优化氨基酸序列如seq id no：9所示，所述cd28tm的优化氨基酸序列如seq id no：11所示，所述cd8的编码核苷酸序列如seq id no：10所示，所述cd28tm的编码核苷酸序列如seq id no：12所示。
10.优选地，所述胞内共刺激结构域包括依次连接的cd28和4-1bb和cd3ζ信号转导结构域，其中，优化的cd28、4-1bb的氨基酸序列分别如seq id no：13所示和seq id no：15所示；编码核苷酸序列如seq id no：14所示和seq id no：16所示；所述cd3ζ信号转导结构域
的优化氨基酸序列如seq id no：17所示，其编码核苷酸序列如seq id no：18所示。
11.优选地，所述嵌合抗原受体表达功能刺激因子il-15，且所述il-15编码核苷酸序列经过优化设计的，其优化氨基酸序列如seq id no：19所示，编码核苷酸序列如seq id no：20所示。
12.优选地，所述嵌合抗原受体包含p2a自剪切结构，所述p2a自剪切结构的优化氨基酸序列如seq id no：21所示，编码核苷酸序列如seq id no：22所示。
13.第二方面，本发明还提供分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞，其为以免疫细胞定向分化的ips-ink细胞为靶细胞，在此靶细胞中转导上述第一方面提供的嵌合抗原受体，从而获得的一种集成多种功能的新型肿瘤杀伤细胞car-cd19-ips-ink。
14.第三方面，本发明还提供上述第二方面提供的分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞的构建，即：采用上述第一方面提供的能够高效表达的嵌合抗原受体转导免疫细胞获得，所述免疫细胞是nk细胞、人胚胎干细胞、造血干细胞或ipsc细胞中的任意一项，且优选为ipsc细胞。
15.第四方面，本发明还提供一种上述第一方面提供的能够高效表达的嵌合抗原受体、或上述第二方面提供的分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞在制备预防、诊断或治疗抗血液肿瘤药物或细胞杀伤剂中的应用。
16.优选地，所述血液肿瘤包括急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤或浆细胞样树突细胞肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
17.以上的总结无意描述本发明的每个公开的实施方式或者每种实践。以下的说明书更具体地例举了阐释性实施方式。在该申请的若干处，通过列出实施例来提供指导，这些实施例可以以各种组合使用。每种情形下，所给出的列表仅用作代表性组，而不应解释为排他性列举。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果为：针对嵌合抗原受体-nk细胞疗法在治疗肿瘤的临床试验中的缺陷及不足：1、成体nk细胞来源不足；2、car分子在成体细胞中转导不均，产品功能不稳定；3.传统car-nk细胞在输注后因为有效刺激缺陷而功能低存活期短。为解决上述nk细胞疗法在临床上的关键障碍，本发明提供能够高效表达的car分子及自分泌功能刺激分子il-15的、基于诱导多能干细胞（ips）分化的car-cd19-ips-ink细胞，这既克服了免疫疗法中的细胞来源不足问题，又能使car分子在nk细胞中高效稳定表达，且表达car分子的nk细胞通过分泌il-15使得细胞在杀伤肿瘤方面保持足够的细胞活力以及发挥持久的功能效应。
附图说明
19.图1为本发明的实施例1提供的一种嵌合抗原受体及主要元件组成示意图；图2为本发明的实施例2提供的构建高表达il-15的car-nk细胞的流程图；图3为本发明的实施例2提供的对carcd19-ipsc细胞的多能性鉴定实验结果；图4为本发明的实施例2提供的诱导carcd19-ipsc细胞向造血祖细胞定向分化的检测结果；图5为本发明的实施例2提供的造血祖细胞定向分化为carcd19-nk细胞的检测结
果；图6为本发明实施例3提供的carcd19在nk细胞中的表达检测结果；图7为本发明实施例3提供的carcd19-nk细胞的il-15分泌量检测；图8为carcd19-nk细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性检测结果。
具体实施方式
20.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
21.本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
22.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
23.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
24.实施例1请参阅图1，本实施例提供一种容易在免疫细胞中表达的嵌合抗原受体car-cd19分子及其制备方法。
25.图1为本发明提供的一种改造后的嵌合抗原受体car-cd19的主要元件组成示意图，更具体地，本实施例提供的一种嵌合抗原受体从n端到c端依次包括：ef1a的启动子区域、cd8asp信号肽，胞外抗体结合结构域fmc63scfv、cd8铰链区、cd28tm跨膜结构域、胞内共刺激结构域cd28和4-1bb和cd3ζ三联体、p2a自剪切结构以及il-15元件，具体地，组成该嵌合抗原受体的各元件序列如下：cd8asp的信号肽区域的序列如seq id no：1所示，编码核苷酸序列如seq id no：2所示；胞外抗体结合结构域fmc63vl包括轻链可变区、重链可变区以及linker，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：3所示，编码核苷酸序列如seq id no：4所示；所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：5所示，编码核苷酸序列如seq id no：6所示；所述linker的氨基酸序列如seq id no：7所示，编码核苷酸序列如seq id no：8。
26.所述铰链区为cd8stalk，其氨基酸序列如seq id no：9所示，编码核苷酸序列如seq id no：10所示；所述跨膜结构域为cd28tm，其氨基酸序列如seq id no：11所示，编码核苷酸序列
如seq id no：12所示；所述胞内共刺激结构域包括依次连接的cd28和4-1bb，其中，cd28、4-1bb的氨基酸序列分别如seq id no：13和seq id no：15所示，编码核苷酸序列如seq id no：14和seq id no：16所示；所述cd3ζ信号转导结构域的氨基酸序列如seq id no：17所示，编码核苷酸序列如seq id no：18所示；所述p2a自剪切结构的氨基酸序列如seq id no：21所示，编码核苷酸序列如seq id no：22所示；所述il-15元件的氨基酸序列如seq id no：19所示，编码核苷酸序列如seq id no：20所示。
27.此外，本实施例还进一步对本发明改造后的car-cd19分子与传统car分子的dna二级结构通过rna folder web serverrnafold web server (univie.ac.at)网站进行预测，从二级结构预测及分析结果可知，本发明改造后的car-cd19分子二级结构与传统car分子有明显不同，网站分析后可知，本专利发明的carcd19分子更容易在细胞中得到表达。
28.实施例2本实施例提供一种可高表达il-15的car-nk细胞，请参阅图2，其构建流程如下：s1：载体构建根据制造商的建议将实施例1合成的嵌合抗原受体转入piggybac转座子载体中，构建出car cd19-piggybac载体，构建出的car cd19-piggybac载体用于后续转导ipsc细胞；s2：ipsc细胞转导将ipsc细胞铺在6孔板中培养，当ipsc细胞密度达到80%用于转导。
29.用lipofectamine2000转染的方式将car cd19-piggybac载体转染至ipsc细胞中，72h后用嘌呤霉素筛选转染后的ipsc细胞，获得carcd19-ipsc细胞。
30.s3:单克隆细胞测序鉴定挑选单克隆细胞进行测序鉴定，送擎科生物有限公司进行测序，测序过程中生成测序结果，carcd19嵌合抗原受体在carcd19-ipsc细胞中的测序鉴定结果如seq id no：23所示。
31.上述测序结果经过blasta比对分析后发现，与事先设计好的carcd19序列一致，可确定carcd19已经被成功转导进ipsc细胞中，carcd19-ipsc细胞构建成功，可继续用于后续的分化研究。
32.s4：免疫荧光染色及核型分析鉴定carcd19-ips的多能性s41：免疫荧光分析按照每孔30万的数量将细胞接种至铺有metragel基质胶的6孔板中，并放于含有5%co2和37
°
c的培养箱中培养，期间每天换液。当细胞融合度达到80%时候用pbs清洗细胞3次， 随后在室温下用1ml 4%多聚甲醛固定细胞10-20 min，随后用渗透液渗透细胞 15min，渗透结束后用1ml pbs清洗细胞3次，每次3-5min，常温下用bsa封闭细胞1h，并加入oct4一抗4
°
c过夜孵育。孵育结束后用pbs清洗细胞3次，每次5min。加入二抗及1ul dapi在常温下避光孵育1h，孵育结束后用pbs清洗细胞3次后用应该显微镜拍照并分析oct4的表达，实验
结果如图3所示。
33.上述图3结果显示：oct4在ipsc细胞核中稳定表达，在荧光照射下细胞核被染成绿色，经dapi复染后在绿色荧光相同的位置还能看到细胞核被染成蓝色，说明carcd19-ips细胞构建成功，且ipsc细胞能保持其多能性。
34.s42：遗传学分析用0.1 μg/ml colcemid在37
°
c下处理细胞1 h，在中期捕获指数期的细胞，并按标准方法采集。用0.075 m kcl溶液在室温下进行低渗处理20分钟。将固定细胞的载玻片进行胰蛋白酶-吉姆萨带法鉴定单个中期染色体。获得具有代表性的染色体组图像进行核型分析。
35.根据对ipsc细胞的核型分析发现，转导了carcd19的ipsc细胞仍然显示出正常的染色体核型，为二倍体核型状态，没有出现染色体异常情况的出现。由此证实转导carcd19对ipsc细胞的核型没有影响。
36.通过免疫荧光和核型分析实验证实了carcd19的转导不影响ipsc细胞的多能性及核型改变，能保留ipsc细胞的功能。
37.s5：carcd19-ipsc细胞诱导分化将获得的carcd19-ipsc细胞进行扩增培养，随后诱导其先分化为造血祖细胞，后将其定向分化为carcd19-nk细胞。
38.s51: 诱导carcd19-ipsc细胞向造血祖细胞定向分化以20万/孔的数量接种carcd19-ipsc细胞。待细胞生长至80%汇合度时，吸弃培养基，用1ml pbs清洗细胞一次，然后添加0.5ml消化液在37℃的条件下孵育5分钟，消化完成后添加0.5ml完全培养基终止消化，然后使用1 ml移液枪小心地将细胞聚集体分离为单个细胞，用微量移液管将细胞移到15毫升的锥形管中, 添加额外5 ml完全培养基,通过70μm滤网去除细胞聚集体。300g，5 min 离心细胞，去除上清液，5ml pbs清洗细胞一次,后再次300g，5 min 离心细胞，去除上清液后使用1 ml apel培养基重悬细胞。
39.细胞计数后使用含细胞因子的apel培养基（scf： 40 ng/ml， bmp4： 20 ng/ml，vegf：20 ng/ml；10 μm rocki (y-27632）将细胞重悬至80000 cells/ml，随后将细胞接种至圆底96孔板中，每孔100μl（8000个细胞）。300 g，5分钟离心96孔板，然后将96孔板转移至37℃、5%co2培养箱中培养6天。6天后取出培养板，收集部分细胞进行cd34，cd43流式检测，检测结果如图4所示，剩余eb用于后续nk分化实验，以制备carcd19-nk细胞。
40.s52:造血祖细胞定向分化为carcd19-nk细胞使用0.1%的明胶铺6孔板，放到培养箱4小时。按照如下成分及添加比列配置诱导分化培养基：56.6%dmem+glutamax-1,28.3%f12+glutamax-1,15%人ab血清，1%p/s双抗，2mm l-gluta-mine 左旋谷酰胺，1um p-mercaptoethanol p-巯基乙醇，5ng/ml sodium selenite 亚硒酸钠，50um ethanolamine(mp) 氨基乙醇，2mg/l ascoribe acid 抗坏血酸，5ng/ml il-3,20ng/ml scf,20ng/ml il-7,10ng/ml，il-15,10ng/mlflt3l。培养基配置好后将96孔里面的eb细胞挑到一个未铺明胶的孔里，用3-5ml配好的诱导分化培养基清洗细胞两遍。吸弃明胶，再加入2ml诱导分化培养基，然后将清洗好的eb细胞一个一个的挑到6孔板里面，随后放入培养箱培养中培养。细胞培养至7天后，撤出il-3并换液，随后每隔3-5天进行换液，
期间对分化细胞状态进行拍照并保存，实验结果如图5所示。此外，当细胞培养至32天时，收集部分细胞进行cd56流式检测，同时换液，继续培养至第39天后收获分化后的细胞进行cd56流式检测，其实验结果表明carcd19-nk制备成功。
41.实施例3本实施例进一步对上述实施例2获得的carcd19-nk细胞进行检测，包括对carcd19在nk细胞中的表达进行检测及对carcd19-nk细胞的il-15分泌量进行检测。
42.3.1 carcd19在nk细胞中的表达检测分化后carcd19-nk细胞用流式细胞术检测carcd19的表达：收集并洗涤细胞，然后将分化后的细胞制备成细胞悬液，向每个15ml离心管中添加 100 μl 细胞悬液，随后添加 0.1-10 μg/ml 的cd19抗体，在室温下避光孵育30 分钟，随后用pbs清洗细胞三次，并以 400 g 的速度离心 5 分钟，最后用1ml pbs重悬细胞，并在流式细胞仪中检测cd19的表达量，实验结果如图6所示。
43.以上实验结果表明，cd19在carcd19-nk细胞中高度表达，这就保证了分化后的carcd19-nk细胞能够靶向以cd19为抗原的肿瘤细胞。
44.3.2 carcd19-nk细胞il-15表达量检测收集细胞样品，离心取上清液用于il-15检测，按照试剂盒说明书制备处理样品，最终在450nm波长下测量吸光度od值，并计算il-15的表达量，实验结果如图7所示。
45.以上实验结果显示，第一代carcd19-nk分泌的il-15与没有进行carcd19的nk细胞分泌的il-15量相当且分泌量都很少，第二代carcd19-nk分泌的il-15较正常组细胞显著升高，第三代carcd19-nk分泌的il-15的量又较第二代carcd19-nk分泌的量显著升高。
46.实施例4在96孔板中接入1x10
^4
个带有荧光标记的k562细胞，并放于含有5%co2、37
°
c的培养箱中培养4个小时让k562细胞贴壁。随后按照不同的效靶比接入carcd19-nk细胞，按照1：1、5：1、10：1、20：1的效靶比计算则分别加入1x10
^4
、5x10
^4
、10x10
^4
、20x10
^4
个carcd19-nk细胞。加入carcd19-nk细胞后24h后用细胞计数仪对带有荧光的k562细胞进行计数。
47.实验结果如图8所示，并根据计数结果进行统计分析。
48.计数结果显示，carcd19-nk细胞对k562细胞具有显著的杀伤效应，且随着效靶比的增大杀伤效应越好，当效靶比为10:1和20:1时杀伤效果最好，且两种效靶比的杀伤效应相当。
49.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

技术特征：
1.能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体为从n端到c端的氨基酸序列，这段序列包括：ef1a的启动子区域、cd8asp信号肽，胞外抗体结合结构域fmc63scfv、cd8铰链区、cd28tm跨膜结构域、胞内共刺激结构域cd28和4-1bb和cd3ζ三联体、p2a自剪切结构以及il-15原件序列。2.如权利要求1所述的能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号肽区域为cd8asp信号肽，其优化氨基酸序列如seq id no：1所示，其编码核苷酸序列如seq id no：2所示。3.如权利要求1所述的能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞外抗体结合结构域为fmc63scfv且包括轻链可变区和重链可变区以及linker，所述轻链可变区优化氨基酸序列如seq id no：3所示，所述重链可变区优化氨基酸序列如seq id no：5所示，所述linker优化氨基酸序列如seq id no：7所示；所述轻链可变区编码核苷酸序列如seq id no：4所示，所述重链可变区编码核苷酸序列如seq id no：6所示，所述linker编码核苷酸序列如seq id no：8所示。4.如权利要求1所述的能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内铰链区与跨膜结构域为cd8铰链区组合cd28tm，所述cd8的优化氨基酸序列如seq id no：9所示，所述cd28tm的优化氨基酸序列如seq id no：11所示，所述cd8的编码核苷酸序列如seq id no：10所示，所述cd28tm的编码核苷酸序列如seq id no：12所示。5.如权利要求1所述的能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内共刺激结构域包括依次连接的cd28和4-1bb和cd3ζ信号转导结构域，其中，优化的cd28、4-1bb的氨基酸序列分别如seq id no：13所示和seq id no：15所示；编码核苷酸序列如seq id no：14所示和seq id no：16所示；所述cd3ζ信号转导结构域的优化氨基酸序列如seq id no：17所示，其编码核苷酸序列如seq id no：18所示。6.如权利要求1所述的能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体表达nk细胞功能刺激因子il-15，所述il-15基因序列经过优化设计的，其优化氨基酸序列如seq id no：19所示，编码核苷酸序列如seq id no：20所示。7.如权利要求1所述的能够高效表达的嵌合抗原受体，其特征在于：包含p2a自剪切结构, 所述p2a自剪切结构的优化氨基酸序列如seq id no：21所示，编码核苷酸序列如seq id no：22所示。8.分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞，其特征在于：其为以免疫细胞定向分化的ips-ink细胞为靶细胞，在此靶细胞中转导如权利要求1～7任意一项所述的嵌合抗原受体，从而获得的一种集成多种功能的新型肿瘤杀伤细胞car-cd19-ips-ink。9.如权利要求8所述的分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞的构建，其特征在于，采用如权利要求1～7任意一项所述的能够高效表达的嵌合抗原受体转导免疫细胞获得，所述免疫细胞是nk细胞、人胚胎干细胞、造血干细胞或ipsc细胞中的任意一项。10.如权利要求1～7任意一项所述能够高效表达的嵌合抗原受体、或权利要求8所述的分泌功能刺激因子il-15的car-nk细胞在制备预防、诊断或治疗抗血液肿瘤药物或细胞杀伤剂中的应用。

技术总结
本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及一种能够高效表达的嵌合抗原受体及分泌功能刺激因子IL-15的CAR-NK细胞的构建和应用。本发明基于嵌合抗原受体-NK细胞疗法在治疗肿瘤的临床试验中的缺陷及不足：1、成体NK细胞来源不足；2、CAR分子在成体细胞中转导不均，产品功能不稳定；3.传统CAR-NK细胞在输注后因为有效刺激缺陷而功能低存活期短。为解决上述NK细胞疗法在临床上的关键障碍，本发明提供能够高效表达的CAR分子及自分泌功能刺激分子IL-15的、基于诱导多能干细胞分化的CAR-CD19-IPS-iNK细胞，这既克服了免疫疗法中的细胞来源不足问题，又能使CAR分子在NK细胞中高效稳定表达，且表达CAR分子的NK细胞通过分泌IL-15使得细胞在杀伤肿瘤方面保持足够的细胞活力以及发挥持久的功能效应。持久的功能效应。持久的功能效应。


技术研发人员：邵开峰 李健峰 刘红岩
受保护的技术使用者：云南赛元生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/7/12