一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法。


背景技术：

2.三磷酸腺苷(adenosine triphosphate、atp)是一种高能磷酸化合物，在细胞中，它能与adp相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应。在细胞外，可以为atp依赖酶的催化过程提供能量从而生产高值化合物，如醛类、酰胺类和芳香氨基糖苷类等。在工业生产过程中，直接使用atp，不但成本过高，而且反应过程中形成的副产物adp或amp会对反应产生抑制。所以采用一定的技术手段使反应系统中atp再生，以实现atp的循环利用很有必要。
3.目前，已经报道了几种不同类型的atp再生系统，例如，磷酸烯醇式丙酮酸/丙酮酸激酶、乙酰磷酸/乙酸激酶、多聚磷酸盐/多聚磷酸激酶等。其中多聚磷酸盐(polyphosphate，polyp)是一种通过酸酐连接磷酸盐残基的无机聚合物，其合成工艺成熟，价格低，纯度高，并且在广泛的温度、ph和氧化剂范围都是稳定的，所以基于多聚磷酸盐/多聚磷酸激酶的atp再生系统成本优势明显。
4.多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ppk)是一类以多聚磷酸盐作为磷酸供体，催化adp或amp生成atp的酶。ppk被分为ppk1和ppk2两类，ppk1偏好以atp为底物，进行atp的降解；ppk2家族又可以进一步被分为三类，ppk2-i偏好以adp为底物生成atp，ppk2-ii偏好以amp为底物生成adp，ppk2-iii既以adp为底物又以amp为底物生成atp。因此，这类酶可用于atp的合成。
5.已有文献报道多聚磷酸激酶在atp再生系统中的应用，例如，来源于细长嗜热聚球藻菌的多聚磷酸激酶应用于生产d-氨基酸二肽、来源于类球红细菌的多聚磷酸激酶应用于生产l-茶氨酸。
6.目前基于多聚磷酸激酶的atp再生系统中所报道的多聚磷酸激酶还存在活性不够高、热稳定性不够好等问题。因此开发新的多聚磷酸激酶对能够利用廉价poly p原料进行atp再生具有较大经济价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法。
8.本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
9.一种多聚磷酸激酶，所述多聚磷酸激酶来源于大不里士杆菌(tabrizicolasp.)，因此简称为tappk，其氨基酸序列选自以下其中一种：
10.(1)如seq id no.1所示的氨基酸序列；
11.(2)对seq id no.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；
12.(3)与seq id no.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
13.本发明还提供一种多聚磷酸激酶的编码基因，编码基因编码多聚磷酸激酶，其天然的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.本发明还提供所述多聚磷酸激酶tappk的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)构建包含多聚磷酸激酶tappk的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，得到重组菌；
16.(2)培养重组菌株使其发酵，诱导多聚磷酸激酶tappk表达；
17.(3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；
18.(4)对收集的上清液的进行纯化，获得多聚磷酸激酶tappk。
19.优选地，所述步骤4)中上清液的的纯化方式为硫酸铵沉淀法，用10％饱和度的硫酸铵对其上清液进行两轮沉淀。
20.本发明检测了上述多聚磷酸激酶tappk的酶学性质，包括最适温度、最适ph、最适金属离子、最适金属离子浓度、温度稳定性、ph稳定性、表观动力学参数等，证实其具有良好的催化活性和稳定性。
21.与现有技术相比，本发明的有益成果为：
22.本发明的多聚磷酸激酶tappk是一种新的高活性多聚磷酸激酶，该多聚磷酸激酶可以利用廉价且稳定性高的多聚磷酸盐进行atp再生，具有广泛的应用前景，且其具有良好的催化活性和稳定性
附图说明
23.图1为本发明实施例2中多聚磷酸激酶tappk的sds-page结果。
24.图2为本发明实施例4中温度对多聚磷酸激酶tappk催化活性的影响。
25.图3为本发明实施例4中ph对多聚磷酸激酶tappk催化活性的影响。
26.图4为本发明实施例4中金属离子对多聚磷酸激酶tappk催化活性的影响。
27.图5为本发明实施例4中mg
2+
浓度对多聚磷酸激酶tappk催化活性的影响。
28.图6为本发明实施例4中多聚磷酸激酶tappk在不同温度条件下的稳定性。
29.图7为本发明实施例4中多聚磷酸激酶tappk在不同ph条件下的稳定性。
30.图8为本发明实施例4中多聚磷酸激酶tappk的动力学曲线。
具体实施方式：
31.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
32.本发明中的载体(vector)是指能够将dna片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状dna分子。
[0033]“同源性”或“同源性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对。
[0034]
实施例1多聚磷酸激酶tappk表达菌株的构建
[0035]
将tappk与文献中活性较好的来源于类球红细菌(rhodobactersphaeroides)的rhppk(序列号：wp_011338472)进行氨基酸序列比对，比对结果发现：tappk与rhppk具有80％的氨基酸序列同源性。tappk的氨基酸序列如seq id no.1所示，含有323个氨基酸，预测蛋白分子量为37kda。
[0036]
为了保证目的基因能在大肠杆菌中高效表达，对目的基因进行密码子优化(dna序列见seq id no.2)，委托金斯瑞生物科技公司合成和并克隆于pet28a的ndei和bamh i位点之间，将表达质粒导入感受态大肠杆菌bl21(de3)中，获得重组菌株。
[0037]
实施例2多聚磷酸激酶tappk的表达、纯化
[0038]
(1)将实施例1得到的重组菌株，挑取单菌落接种到5ml含有kan抗性的液体lb培养基中，37℃，220rpm，培养12h。再将菌液接种到100ml含kan抗性的液体tb培养基中，37℃，220rpm培养至od600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mm的iptg，30℃，200rpm诱导表达16-18h。9000rpm离心，收集菌体。
[0039]
(2)将收集的菌体悬浮到破胞缓冲液(ph7.4)中进行超声破碎，12000rpm离心收集上清液。
[0040]
(3)使用硫酸铵沉淀法对上述收集的上清液进行纯化，10％饱和度的硫酸铵对其上清液进行两轮沉淀，获得目标蛋白多聚磷酸激酶tappk，纯化后蛋白电泳结果见图1。
[0041]
实施例3多聚磷酸激酶tappk的酶活测定方法
[0042]
酶活测定：反应体系组成及反应条件：1ml反应体系：加入终浓度为5mm adp，50mm六偏磷酸钠，100mm mgcl2·
6h2o，50mm tris-hcl(ph8.0)，3.1μgtappk，37℃，999rpm反应10min后，加入1ml浓度为1m的盐酸终止反应。
[0043]
hplc检测，具体条件：a为ph为6.5的0.5m的磷酸盐缓冲液，b为甲醇。洗脱条件为a:b＝95:5，流速为0.6ml/min，检测温度为30℃，检测波长为254nm。经计算tappk的比酶活为676u/mg。
[0044]
实施例4多聚磷酸激酶tappk的酶学性质
[0045]
(1)温度对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，将反应体系分别放在不同温度(18℃、26℃、45℃、50℃、60℃)下反应。考察温度对催化活性的影响，如图2所示，酶反应最适温度为37℃。
[0046]
(2)ph对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，将反应体系分别放在不同ph(5.5、7.5、8.5、9.5)反应。考察ph对催化活性的影响，如图3所示，酶反应最适ph为7.5。
[0047]
(3)金属离子对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，在反应体系中分别加入不同金属离子(ni
2+
、zn
2+
、co
2+
、mn
2+
、te
2+
、cu
2+
、ca
2+
)反应。考察金属离子种类对催化活性的影响，如图4所示，酶反应最适金属离子为mg
2+
。
[0048]
(4)mg
2+
浓度对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，将反应体系在不同mg
2+
浓度(10mm、25mm、50mm、75mm、125mm、150mm)反应。考察mg
2+
浓度对催化活性的影响，如图5所示，酶反应最适mg
2+
浓度为100mm。
[0049]
(5)温度稳定性：1ml反应体系：加入终浓度为5mm adp，50mm六偏磷酸钠，100mm mgcl2·
6h2o，50mm tris-hcl(ph8.0)，3.1μg经不同温度(4℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃)
孵育1h的tappk，37℃，999rpm反应10min后，加入1ml浓度为1m的盐酸终止反应。考察酶在不同温度下的稳定性，如图6所示，酶在45℃下孵育1h保留80％以上的活性。
[0050]
(6)ph稳定性：根据实施例3所示方法，1ml反应体系：加入终浓度为5mm adp，50mm六偏磷酸钠，100mm mgcl2·
6h2o，50mm tris-hcl(ph8.0)，3.1μg经不同ph(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)孵育(1h、6h、12h)的tappk，37℃，999rpm反应10min后，加入1ml浓度为1m的盐酸终止反应。考察酶在不同ph条件下的稳定性，如图7所示，酶在弱酸、弱碱条件下孵育12h后保留70％以上活性。
[0051]
(7)表观动力学参数：根据实施例3所示方法，将酶在不同底物浓度下反应。直至底物浓度不再影响反应速率。测定酶的表观动力学参数，结果见图8、表1。
[0052]
表1tappk的表观动力学参数
[0053]

技术特征：
1.一种多聚磷酸激酶，其特征在于，所述多聚磷酸激酶来源于大不里士杆菌(tabrizicolasp.)，其氨基酸序列选自以下其中一种：(1)如seq id no.1所示的氨基酸序列；(2)对seq id no.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；(3)与seq id no.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。2.一种多聚磷酸激酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的多聚磷酸激酶。3.一种如权利要求1所述的多聚磷酸激酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建包含多聚磷酸激酶的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，得到重组菌；(2)培养重组菌株使其发酵，诱导多聚磷酸激酶表达；(3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；(4)对收集的上清液进行纯化，获得多聚磷酸激酶。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤4)中上清液的的纯化方式为硫酸铵沉淀法，用10％饱和度的硫酸铵对其上清液进行两轮沉淀。

技术总结
本发明公开了一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法，该酶来源于大不里士杆菌(Tabrizicolasp.)，该酶在大肠杆菌里具有很高的表达量，且表现出良好的催化活性和稳定性，可用于酶催化的ATP再生系统。可用于酶催化的ATP再生系统。可用于酶催化的ATP再生系统。


技术研发人员：柳鹏福 鲍云云 储消和 陈艳
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/12