一组快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合及其应用的制作方法

1.本发明涉及一组快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合及其应用，属于分子生物学领域。


背景技术：

2.桃(prunus persica(l.)batsch)原产中国，是蔷薇科中重要果树之一。桃的基因组比较小，适合进行遗传学研究，为多年生果树中的模式种类。桃生长发育周期长，利用传统的育种方法培育一个桃新品种通常需耗时多年，而应用分子标记辅助育种技术则可以有效缩短育种周期，降低成本。
3.目前，涉及桃重要经济性状分子标记研发工作主要集中在质量性状上，而针对果实形状、大小、成熟期、风味等重要数量性状的分子标记开发相关研究报道较少，遗传情况较质量性状要复杂的多，其开发难度相对较大。相关研究表明，桃果实成熟期属于受多基因控制的数量性状，其分子标记方面的进展缓慢。仅有的关于桃果实成熟期的分子标记文献报道主要依赖前期开发的少量ssr、rapd等分子标记对桃杂交群体或自然群体成熟期的多态性评价，然后介由其连锁性关联度转化而来。其受限于上述分子标记基因组位点与性状调控实际遗传位点距离影响，且整体使用标记数量较少，很难实现全基因组覆盖，具有一定的片面性和局限性。此外，目前仅有的与桃成熟期性状连锁的分子标记研究相关报道存在着标记位点数量少、研究群体小、成熟期跨度小的问题。
4.随着基因组测序技术的迅猛发展，相关学者采用大规模重测序以及比较基因组学手段获得海量的snp位点可为桃育种过程中预先选择位点提供了有力依据。本发明中桃果实成熟期性状特异位点是经过桃现有主栽品种大群体dna重测序结果，并展开gwas(全基因组关联分析)获得，其依据覆盖全基因的海量snp位点进过多次反复筛选，最后经过桃自然群体验证，其鉴定准确性较为可靠。总之，本发明利用与桃果实成熟期相关的特异dna分子标记可以在短时间内对桃育种材料的果实成熟期进行早期鉴定，从而可以大大加速育种的进程。在今后的研究工作中应加大对桃分子标记辅助育种等现代技术的研究应用，特别是在分子辅助早期选择方面。此外，由于多年生果树果实成熟期是多基因控制的数量性状，对其进行分子标记及基因定位难度较大，国内外学者对其研究较少，应作为重点研究课题之一。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一组可用于快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一组快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合，包括pp4.3.3-f和pp4.3.3-r，具体序列为：
7.pp4.3.3-f：5
’‑
tacttatactcataaatatgcacttgtaacaatattg-3’，
8.pp4.3.3-r：5
’‑
gatggattgaattaccctatatgtgattcgattc-3’。
9.本发明还公开了上述的分子标记引物组合在快速鉴定桃果实成熟期性状中的应用。
10.其步骤包括：
11.(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组合pp4.3.3-f和pp4.3.3-r；
12.(2)dna的提取：提取桃叶片的基因组dna；
13.(3)pcr扩增：基于上述桃叶片基因组dna，使用步骤(1)合成的引物组合pp4.3.3-f和pp4.3.3-r进行pcr扩增，预先加入至少一个已确定桃果实成熟期性状类型为早熟型的样本dna作为内参；
14.(4)扩增产物检测与分析：对pcr产物进行基因型检测分析，若有pcr扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即视为同一成熟期性状类型，即为早熟桃种质；其余情况例如没有任何pcr扩增产物出现者则视为中或晚熟桃种质。亦可采用琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分型检测，若出现与内参样本大小及亮度一致的pcr扩增产物片段者即视为同一成熟期性状类型，即为早熟桃种质；同理，其余情况例如没有任何pcr扩增产物出现者则视为中或晚熟桃种质。
15.其详细步骤为：
16.(1)引物合成：委托生物技术公司合成桃成熟期判定引物pp4.3.3；
17.(2)dna的提取：
18.a、用液氮研磨0.2g左右的桃幼叶成粉末状置于2ml离心管中；
19.b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spin column plant genomic dna purification kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；
20.c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；
21.(3)pcr扩增反应体系为：样品基因组dna模板1.0μl(10ng/μl)，2
×
sg fast qpcr master mix(low rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl即可。
22.(4)pcr扩增产物检测与分析：pcr扩增为三步法程序，即95℃3min，(95℃3s，56℃30s，72℃30s)30个循环；待pcr反应结束后可直接由abi q6 flex实时荧光定量pcr系统平台genotyping功能模块自动分析结果(allelic discrimination plot)便知样本果实成熟期性状，无需其他流程；其中，若有pcr扩增产物出现(加入1个已确定为“早熟”的桃种质样本作为内参)且与内参样本聚集为一组者即视为同一成熟期性状，即为早熟型桃；相反，其余情况例如没有任何pcr扩增产物出现者则视为中或晚熟类型桃种质。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
24.本发明中分子标记引物pp4.3.3扩增产物片段长度仅为136bp，基于桃不同成熟期群体中基因组dna中特异snp位点开发而成，稳定性及适用性较好，尤其适用于荧光定量pcr仪等高通量分型检测平台，其应用过程中的pcr扩增耗时短，循环数仅为30个；从pcr扩增到最终分型结果数据的获取为全程闭管操作，无需再进行后续凝胶电泳检测，实现零污染；同时，样品基因组dna模板量仅需20ng即获得分型检测结果，具有快速、高通量和高灵敏度及
准确性高的特点。
附图说明
25.图1为桃种质资源dna样本的pp4.3.3引物在荧光定量pcr仪平台上的分型效果(阳性群体即为早熟桃种质，而阴性群体则为中晚熟桃种质)。
26.图2为桃种质资源dna样本的pp4.3.3引物组合pcr扩增产物琼脂糖电泳图(第9和10泳道为内参样本)。
具体实施方式
27.下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
28.实施例1
29.一组鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合及其应用，其详细步骤为：
30.(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物pp4.3.3；
31.表1桃成熟期判定引物pp4.3.3序列信息
[0032][0033]
(2)待测桃种质资源样品叶片dna的提取：
[0034]
a、用液氮研磨0.2g左右的桃幼叶成粉末状置于2ml离心管中；
[0035]
b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spin column plant genomic dna purification kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；
[0036]
c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；
[0037]
(3)pcr扩增反应体系为：样品基因组dna模板2.0μl(10ng/μl)，2
×
sg fast qpcr master mix(low rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl即可。
[0038]
(4)pcr扩增产物检测与分析：pcr扩增为三步法程序，即95℃3min，(95℃3s，56℃30s，72℃30s)30个循环；待pcr反应结束后可直接由abi q6 flex实时荧光定量pcr系统平台genotyping功能模块自动分析结果(allelic discrimination plot)便知样本果实成熟期性状，无需其他流程；其中，若有pcr扩增产物出现(预先加入2个已确定为早熟型桃种质样本dna作为内参)且与内参样本聚集为一组者即视为同一果实成熟期类型，为阳性，以“+”标记，即判定为早熟型桃种质；相反的，若没有任何pcr扩增产物出现或者为其他基因型者均视为其他类型，为阴性，以
“‑”
标记，即判定为中或晚熟类型桃种质。最后，使用表格记录所有桃种质样品果实成熟期鉴定结果(表2)，后续经过结果期观察确定其真实果实成熟期性状，仅有9份桃种质果实成熟期鉴定错误，因此，最终的桃果实成熟期性状鉴定准确率约
为88.89％，具体分型效果见图1。同时，也可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于桃果实成熟期的早期辅助鉴定。
[0039]
本实例中荧光定量平台96孔加热模块可根据需要进行更换为384孔以及流体芯片等，以满足更高通量分型检测需求。
[0040]
表2本发明实例中所用到的81份桃种质资源果实成熟期性状鉴定结果
[0041]
[0042]
[0043][0044]
注：*分型结果图中与“早熟型”桃果实内参样品聚为一类者用“+”，即判定为早熟型桃种质；其余样品均用
“‑”
表示，则判定为中或晚熟型桃种质。本实例中考虑分子标记使用便捷及适用性，并参照《桃种质资源数据质量控制规范》中果实成熟期的相关描述，暂将桃果实成熟期简化划分为早熟(5～6月份)、中熟(7月份)和晚熟(8～9月份)三类。
[0045]
实施例2
[0046]
一组鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合及其应用，其详细步骤为：
[0047]
(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物pp4.3.3；
[0048]
表1桃成熟期判定引物pp4.3.3序列信息
[0049][0050]
(2)待测桃种质资源样品叶片dna的提取：
[0051]
a、用液氮研磨0.2g左右的桃幼叶成粉末状置于2ml离心管中；
[0052]
b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spin column plant genomic dna purification kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；
[0053]
c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；
[0054]
(3)pcr扩增产物检测与分析：使用不含染料的2
×
taq pcr mix预混液(2
×
taq pcr master mix，without dye，上海生工生物工程股份有限公司)构建pcr反应体系，其中，基因组dna模板2.0μl，2
×
taq pcr master mix 5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl；扩增pcr程序为：94℃4m，30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃30s)；待pcr反应结束后将产物采用常规琼脂糖凝胶电泳平台进行检测(见图2)，若有长度为136bp的pcr扩增产物出现且与内参样本片段大小且亮度一致(预先加入2个已确定表型为早熟类型的桃种质样本dna作为内参)即可视为早熟桃种质类型(见图2)，若无此片段大小及亮度的pcr扩增产物出现即可视为中或晚熟桃种质类型，可将最终结果用表格形式进行记录。亦可将pp4.3.3-f的5’端添加荧光基团(fam、hex等)后的pcr反应产物置于荧光毛
细管电泳平台进行str分型检测，种质成熟期判定方法同琼脂糖电泳，以达到更高通量分型检测需求。最终，使用表格记录所有桃种质样品果实成熟期鉴定结果(表2)，后续经过结果期观察确定其真实果实成熟期性状，仅有2份桃种质果实成熟期鉴定错误，因此，最终的桃果实成熟期性状鉴定准确率为90％。
[0055]
表2本发明实例中所用到的20份桃种质资源果实成熟期性状鉴定结果
[0056][0057]
注：*电泳鉴定结果图中出现与“早熟型”桃果实内参样品同等大小及亮度的条带者用“+”，即判定为早熟型桃种质；其余样品均用
“‑”
表示，则判定为中或晚熟型桃种质。表中编号即为图2电泳结果中的泳道编号。本实例中考虑分子标记使用便捷及适用性，并参照《桃种质资源数据质量控制规范》中果实成熟期的相关描述，暂将桃果实成熟期简化划分为早熟(5～6月份)、中熟(7月份)和晚熟(8～9月份)三类。

技术特征：
1.一组快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合，其特征在于所述引物组合包括pp4.3.3-f和pp4.3.3-r，具体序列为：pp4.3.3-f：5
’‑
tacttatactcataaatatgcacttgtaacaatattg-3’，pp4.3.3-r：5
’‑
gatggattgaattaccctatatgtgattcgattc-3’。2.权利要求1所述的分子标记引物组合在快速鉴定桃果实成熟期性状是否为早熟类型的应用。3.一种快速鉴定桃果实成熟期性状的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的分子标记引物组合。4.一种快速鉴定桃果实成熟期性状的方法，其步骤包括：(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组合pp4.3.3-f和pp4.3.3-r；(2)dna的提取：提取待测桃叶片中的基因组dna；(3)pcr扩增：基于上述桃基因组dna，使用引物pp4.3.3-f和pp4.3.3-r进行pcr扩增，预先加入至少一个已确定桃果实成熟期性状为早熟品种的样本基因组dna作为内参；(4)扩增产物检测与分析：对pcr产物进行基因型检测分析，若有pcr扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即视为同一成熟期性状类型，即为早熟桃种质；其余情况则为中熟或晚熟桃种质。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中pcr扩增的体系为：10ng/μl的样本基因组dna模板1.0μl，2
×
sg fast qpcr master mix 5μl，10μm的pp4.3.3-f引物0.5μl，10μm的pp4.3.3-r引物0.5μl，ddh2o补足至10μl；扩增pcr程序如下：95℃3min，然后运行30个循环反应，每个循环为95℃3s，56℃30s，72℃30s。6.一种快速鉴定桃果实成熟期性状的方法，其步骤包括：(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组合pp4.3.3-f和pp4.3.3-r；(2)dna的提取：提取待测桃叶片中的基因组dna；(3)pcr扩增：基于上述桃基因组dna，使用引物pp4.3.3-f和pp4.3.3-r进行pcr扩增，预先加入至少一个已确定桃果实成熟期性状为早熟品种的样本基因组dna作为内参；(4)扩增产物检测与分析：采用琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分型检测，若出现与内参样本大小及亮度一致的pcr扩增产物片段者即视为同一成熟期性状类型，即为早熟桃种质；其余情况则为中熟或晚熟桃种质。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中pcr扩增的体系为：10ng/μl的样本基因组dna模板2.0μl，2
×
taq pcr master mix 5μl，pp4.3.3-f引物0.5μl，pp4.3.3-r引物0.5μl，ddh2o补足至10μl；扩增pcr程序为：94℃4m，然后运行30个循环反应，每个循环为94℃30s，56℃30s，72℃30s；其中pp4.3.3-f引物、pp4.3.3-r引物的浓度均为10μm。

技术总结
本发明公开一组快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合及其应用，以期应用于桃果实成熟期早晚性状分子标记早期辅助筛选及相关定向育种工作。本发明提供一组可以快速鉴定桃成熟期性状的分子标记引物组合，为PP4.3.3，适用于包括常规PCR分型检测以及荧光定量PCR仪等高通量分型检测平台，灵敏度高，可用于桃成熟期性状的早期快速鉴定。本发明基于桃全基因组重测序与GWAS，筛选特异性SNP位点开发的引物组合可用于辅助筛选特定成熟期桃种质资源，在桃成熟期性状表型预测上有重要的指导意义，具有高效快速、操作便捷和成本低等优点。优点。优点。


技术研发人员：焦云 陈妙金 孙奇男 陈克明
受保护的技术使用者：宁波市农业科学研究院
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/7/12