烟草转录因子NtbHLH68及其编码蛋白在烟碱合成代谢中的应用的制作方法

烟草转录因子ntbhlh68及其编码蛋白在烟碱合成代谢中的应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一个烟草转录因子ntbhlh68及其编码蛋白在烟碱合成代谢中的应用。


背景技术：

2.生物碱是植物体内除萜类物质外最广泛存在的一类次生代谢物，一般呈碱性。在自然界，烟碱存在于主要的茄科植物中，其生物学功能主要是抗虫。在烟草中，主要存在4种生物碱：尼古丁、去甲尼古丁、新烟碱及假木贼碱。其中烟碱是最主要的烟草生物碱，占栽培烟草中总生物碱含量的90％～95％。因此，长期以来有关烟碱生物合成及调控的研究一直是次生代谢研究领域的焦点之一。目前对烟碱生物合成途径有了较为明晰的认识：即鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,odc)催化鸟氨酸或由精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,adc)催化精氨酸生成腐胺，腐胺经腐胺-n-甲基转移酶(putrescine n-methyltransferase,pmt)的催化生成n-甲基腐胺，n-甲基腐胺在n-甲基腐胺氧化酶(n-methylputrescine oxidase,mpo)的催化作用下生成4-甲基丁醛；经天冬氨酸途径形成的烟酸或衍生物可以形成吡啶环；吡啶环与4-甲基丁醛自然环化形成的吡咯烷环缩合成烟碱。但在烟碱生物合成的分子调控方面一直没有突破性进展，除了植物激素，烟草自身存在的调控烟碱合成的位点的角色还有待于进一步研究。
3.为了进一步研究烟草自身存在的调控烟碱合成的位点，提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一个与烟草烟碱合成代谢相关基因ntbhlh68，从而为烟草及其他植物的烟碱含量调控分子育种提供新的策略和路径。
5.本技术所采取的技术方案详述如下：
6.本发明第一方面提供了一种烟草转录因子ntbhlh68，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.本发明第二方面提供了一种第一方面所述转录因子ntbhlh66所编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
8.本发明第三方面提供了一种第一方面所述烟草转录因子ntbhlh68在烟草中的应用，烟草转录因子ntbhlh68与烟草烟碱合成代谢相关，将该基因沉默后，苗期烟草叶片的烟碱含量降低。
9.优选地，用于沉默ntbhlh68的pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai载体的构建方法为：以ntbhlh68中第200-399位核苷酸作为rnai的引导序列，将此核酸片段按照正反方向依次插入pbwa(v)hs空载体中，构建获得pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai载体。
10.优选地，所述沉默的具体方法为：利用农杆菌介导的叶盘转化方法，将rnai载体pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai转化栽培烟草k326，通过筛选、鉴定获ntbhlh68基因沉默植株，
所述ntbhlh68基因沉默植株其表型为，基因沉默的转基因植株苗期烟碱含量明显降低。
11.优选地，本发明提供的烟草烟碱合成代谢相关基因ntbhlh68，来源于烟草(nicotiana tabacum l.)。
12.优选地，本发明提供的烟草烟碱合成代谢相关基因ntbhlh68，来源于烟草(nicotiana tabacum l.)，编码下述蛋白质(i)或(ii)：
13.(i)序列表中的seq id no：2所示氨基酸序列的蛋白质；
14.(ii)序列表中的seq id no：2所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺少或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)所述蛋白质相同的功能。
15.优选地，本发明的烟草ntbhlh68基因可以是cdna序列，也可以是基因组dna序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的dna序列。
附图说明
16.图1 ntbhlh68基因的pcr产物电泳图；
17.m，marker；1，正向序列pcr产物；2，反向序列pcr产物；
18.图2 rnai干扰载体pbwa(v)hs-rnai图谱；
19.图3 pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai酶切图谱；
20.m，marker；1，酶切条带；
21.图4 ntbhlh68-rnai转基因株系基因表达分析；
22.图5 ntbhlh68-rnai转基因株系与对照k326的生物碱含量分析。
具体实施方式
23.下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
24.本发明所述烟草转录因子ntbhlh68包含的核苷酸序列如seq id no：1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中seq id no：1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中seq id no：1限定的dna序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。
25.本发明所述的烟草转录因子ntbhlh68编码烟碱合成代谢相关的蛋白质，所述蛋白包含的氨基酸序列如seq id no：2所示。所述蛋白质还可能为由seq id no：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有影响烟草重金属转运表型的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
26.本发明所述烟草转录因子ntbhlh68的应用为在烟草植株体内抑制所述ntbhlh68基因的表达，可改变苗期烟草叶片烟碱的含量。可通过由rna介导的多种方法抑制ntbhlh68基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化rnai干扰载体、优化修改基因编码框、优化基因启动子等方法。本发明所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制ntbhlh68表达即可。
27.本发明的ntbhlh68基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(gus基因、荧光素酶基因等)或
具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。携带有本发明ntbhlh68基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
28.本发明的烟草烟碱合成代谢相关基因及其编码蛋白为植物尤其是烟草烟碱含量调控分子育种提供基因与技术支持。
29.下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。
30.实施例中所有的植物组织材料取自烤烟(nicotiania tabacum l.)品种k326及rnai干扰ntbhlh68的k326转基因植株。烟草材料种植于人工气候箱中，生长温度为25℃，光周期为12小时光照/12小时黑暗。苗期的烟草，采集叶片，液氮速冻，用于后续分子实验；采集叶片，冻干后用于后续代谢检测。
31.实施例1：克隆ntbhlh68基因片段
32.烟草rna提取及cdna合成
33.rna提取：以生长至苗期的栽培烟草k326幼嫩叶片为样品，经液氮充分研磨成粉状后，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0ml trizol试剂的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，振荡混匀，离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μl异丙醇，沉淀、离心分离出rna，再经75％酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的rnase free的水，充分溶解。所提总rna经dnase i处理，消化的反应体系是：
[0034][0035]
37℃水浴中放置30min。
[0036]
cdna第一链合成：在无菌0.2ml离心管中配置下列模板rna/引物混合液，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上，离心数秒钟使模板rna/引物的变性溶液聚集于离心管底部。
[0037][0038]
在上述离心管中配置下列反转录反应液后，42℃保温1h；70℃保温15min后冰上冷却，得到的cdna用于pcr扩增。
[0039][0040][0041]
以k326 cdna为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行ntbhlh68基因的pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0042]
扩增正向ntbhlh68基因片段的引物：
[0043]
ntbhlh68-f：5’cagtggtctcacaacatgaatagaggtgctatgca3’(seq id no：3)；
[0044]
ntbhlh68-r：5’cgatggtctcacctgcaggtggttattattccatg3’(seq id no：4)。
[0045]
loop引物：
[0046]
f:5’cgatggtctcacaggtctagtttttctcctt3’(seq id no：5)；
[0047]
r:5’cgatggtctcagcccgggctctgtaactatc3’(seq id no：6)。
[0048]
扩增反向ntbhlh68基因片段的引物：
[0049]
ntbhlh68-f：5’cagtggtctcagggctggttattattccatggagg3’(seq id no：7)；
[0050]
ntbhlh68-r：5’cagtggtctcatacaatgaatagaggtgctatgca3’(seq id no：8)。
[0051]
pcr扩增体系如下：
[0052][0053]
pcr反应程序如下表所示：
[0054][0055][0056]
将扩增获得的pcr产物在1％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示。电泳结
束后，采用takara pcr产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的pcr产物，并送上海生工测序，验证序列结果。
[0057]
实施例2:植物rnai载体的构建
[0058]
以实施例1中含有infusion接头序列pcr产物经纯化后，使用infusion连接酶将目的片段连接到pbwa(v)hs-rnai载体(图2)中。infusion连接体系如下表所示：
[0059][0060]
上述片段混合物在50℃反应15分钟，然后放冰上2-3分钟。
[0061]
(1)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(热激法)
[0062]
无菌条件下取10μl连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min。42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-3min。加无抗生素的lb培养基800μl，37℃摇床(100-160rpm)，温和摇振1h左右。取200μl培养液涂于含抗生素50μg/ml的lb固体培养基上，在涂菌液之前首先加入x-gal和iptg涂匀，37℃倒置培养12-16h。
[0063]
(2)阳性克隆的筛选及鉴定
[0064]
培养基中长出许多的蓝色和白色菌斑，待菌斑长到合适大小时，用灭菌的枪头挑取几个白斑，分别于含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中振荡培养12-16h。抽提质粒，酶切鉴定载体构建结果(图3)。
[0065]
实施例3：农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定
[0066]
(1)冻融法转化农杆菌
[0067]
将1μg pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai载体加入到100μeha105农杆菌l感受态中，混匀后在冰上静置30min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500μl lb溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养24-48h。
[0068]
(2)叶盘法转化烟草品种k326
[0069]
具体方法如下:
[0070]
(a)无菌条件下，将烟草k326种子放入ep管中用无菌水冲洗2-3次；随后用75％的酒精中浸泡30-60s，再用0.1％的升汞处理5min，用无菌水冲洗5次后播种于ms培养基上，将培养瓶放在人工气候箱内，保证烟苗正常萌发生长。
[0071]
(b)待烟草苗长至3-5cm时(约20-30d)，取顶芽放于ms+ba0.2 mg/l(壮芽，使其快速成长)培养基上，继代培养。继代培养14天后(有小叶片即可)，取叶片，大小1cm
×
1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入ms+ba1.0mg/lph 6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3d。
[0072]
(c)取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000r/min离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比
例(10ml悬菌液放1管1.5ml菌体)放入悬菌液，加入乙酰丁香酮(as)25mg/l)不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，15min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液。
[0073]
农杆菌侵染液的制备方法如下：取-80℃冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，lb固体平板中加入50mg/l kan和50mg/lrif；挑取单菌斑到含50mg/lkan和50mg/l rif的5ml lb液体培养基中，放入摇床中28℃、200r/min培养过夜(12-16h)；当菌液浓度达到od600＝1.5左右时，取2ml菌液加入到离心管中，4000r/min离心5min；去除上清液，吸1ml新的ms液体培养基，重悬农杆菌，4000r/min离心5min；重复步骤(6)1次；用1ml的ms液体培养基重悬菌后，再加入到40ml的ms的液体培养基中(含40μl 25mg/l的as)，即为侵染液。放置2h以后侵染。
[0074]
200ml悬菌液的配制如下：
[0075]
20
×
大量元素10ml
[0076]
200
×
有机元素1ml
[0077]
200
×
铁盐1ml
[0078]
200
×
微量元素1ml
[0079]
蔗糖5.6g
[0080]
添加去离子水，定容至200ml。
[0081]
(d)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/l cef的无菌水冲洗6次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；
[0082]
(e)用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为ms+ba 1.0mg/l+hyg 25mg/l+cef500 mg/lph 5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低cef浓度。如果长菌，则继续保持cef浓度。
[0083]
(f)每2周更换1次培养基，直至长出不定芽(一般情况为2周)。切下再生的小苗(1cm左右)，转入继代培养基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg 25mg/l+cef500mg/lph 5.8；生长至至小苗长至2cm长时(有小芽即可)，转接入生根培养基ms+naa0.2-0.1mg/l上，25℃、12h光照，培养3周左右,长出粗壮根系。
[0084]
(g)待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。
[0085]
(3)得到稳定的转基因株系
[0086]
采用takara公司dna提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组dna，设计kan抗性基因引物进行pcr扩增，筛选阳性植株，检测到10株阳性植株。
[0087]
kan抗性基因引物为：
[0088]
kan-f：tctggacgaagagcatcagg(seq id no：9)
[0089]
kan-r：atgaatccagaaaagcggcc(seq id no：10)
[0090]
按照实例1中所述方法提取k326对照和3个ntbhlh68-rnai转基因株系的rna，并合成cdna。定量pcr检测ntbhlh68在不同转基因株系中的表达情况，检测引物及内参引物如下所示：
[0091]
qrt-pcr引物为：
[0092]
qntbhlh68-f：5'gggtggaagccctaactg 3'(seq id no：11)；
[0093]
qntbhlh68-r：5'atggaggcgaaggaagtg 3'(seq id no：12)。
[0094]
内参基因引物为：
[0095]
26s-f：5
’‑
gaagaaggtcccaagggttc-3’(seq id no：13)；
[0096]
26s-r：5
’‑
tctccctttaacaccaacgg-3’(seq id no：14)。
[0097]
选取表达量最低的转基因株系(图4)作为研究对象，检测叶片烟碱含量。
[0098]
实施例4：烟草叶片生物碱含量测定
[0099]
将栽培烟草k326植株和rnai干扰转基因株系转基因烟草种子均匀播于含营养土的小盆中，置于光照培养室中培养。苗期，取叶片液氮速冻，冻干机冻干。称取0.3g冻干鲜叶粉于50ml螺口耐压试管中，加入2.5ml 5％氢氧化钠溶液，湿润试样，静置15min，加入20ml 0.01％的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加盖密封后置于超声波发生器内室温下超声萃取15min，然后，在6000转/min条件下离心5min。取2ml有机相进行gc/ms分析，检测烟碱含量；准确移取10ml有机相浓缩到1ml，进gc/ms分析，检测其它10种生物碱含量。烟碱与其它10种生物碱的检测分两次进样来完成，采用保留时间和选择离子(sim)模式定性，双内标定量。ntbhlh68基因沉默后，ntbhlh68-rnai转基因烟草植株叶片的烟碱含量明显降低(图5)。
[0100]
[0101]

技术特征：
1.烟草转录因子ntbhlh68，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：1所示。2.权利要求1所述转录因子ntbhlh68所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：2所示。3.权利要求1所述烟草转录因子ntbhlh68在烟草中的应用，其特征在于，烟草转录因子ntbhlh68与烟草烟碱合成代谢相关，将该基因沉默后，苗期烟草叶片的烟碱含量降低。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于沉默ntbhlh68的pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai载体的构建方法为：以ntbhlh68中第200-399位核苷酸作为rnai的引导序列，将此核苷酸片段按照正反方向依次插入pbwa(v)hs空载体中，构建pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai载体。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沉默的具体方法为：利用农杆菌介导的叶盘转化方法，将pbwa(v)hs-ntbhlh68-rnai转化栽培烟草k326，通过筛选、鉴定获得ntbhlh68基因沉默植株，所述ntbhlh68基因沉默植株其表型为，基因沉默的转基因植株苗期烟碱含量明显降低。

技术总结
本发明公开了一个烟草烟碱代谢相关转录因子基因NtbHLH68及其编码蛋白与应用。所述烟草转录因子NtbHLH68包含的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码蛋白质包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本申请通过对烟草NtbHLH68的RNAi干扰沉默，发现将NtbHLH68基因沉默后，和对照植株比，苗期干扰株系叶片中烟碱含量明显降低。利用这一特性，可为烟草低烟碱品种培育提供新的策略和路径。因此，烟草转录因子NtbHLH68具有广阔的应用前景。录因子NtbHLH68具有广阔的应用前景。录因子NtbHLH68具有广阔的应用前景。


技术研发人员：翟妞 刘萍萍 徐国云 郑庆霞 周会娜 张慧 金立锋 陈千思 许亚龙 王晨
受保护的技术使用者：中国烟草总公司郑州烟草研究院
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/7/12