一种L-乳酸酸菜发酵粉剂及其制备方法和应用与流程

一种l-乳酸酸菜发酵粉剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物发酵工程技术领域，特别是涉及一种l-乳酸酸菜发酵粉剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.国内外的乳酸菌发酵剂主要集中在酸奶和干酷方面，应用于蔬菜发酵、饲料发酵和有机肥生产的则相对较少。现在广泛应用的乳酸菌直投粉剂都是以冷冻干燥方法制备，冷冻干燥法要求有专用设备，投资大，操作复杂。另外，在我国，蔬菜发酵剂的研发与应用还是一个新领域。目前，除乳品的发酵剂有研制和应用外，绝大多数发酵食品还是沿袭传统的自然发酵工艺。传统酸菜是靠自然选择进行微生物发酵，存在着发酵周期长、发酵质量不稳定以及不利于工厂化、规模化及标准化生产等诸多弊端。采用酸菜乳酸菌发酵剂不仅可以弥补自然发酵的诸多不足，而且可以最大限度地提高酸菜生产的技术水平和产品质量档次。
3.传统酸菜发酵产物多为d-乳酸。医学研究证明，由于人体只有代谢l-乳酸的l-乳酸脱氢酶，所以只能吸收l-乳酸，不能吸收d-乳酸，d-乳酸进入人体后由于不能代谢会使血尿酸度提高，过量地摄入就会引起代谢紊乱，造成酸中毒等不良反应，危害人体健康，带来了较大的食品安全问题。世界卫生组织提倡在食品及医药行业中使用l-乳酸取代d-乳酸，还明确规定，成人每天摄入d-乳酸的量不得超过100mg/kg体重，3个月以下的婴儿食品中不应加入d-乳酸，而对于l-乳酸则不加限制。传统酸菜发酵产物多为d-乳酸，因此，就需要对传统酸菜进行改良，要制备出高产l-乳酸、生长性能好、产酸力强的发酵粉剂，才能更好地满足广大消费者对食品安全性的要求。而不同的乳酸菌所含的酶系不同，代谢途径及形成的最终产物也不同，因此提供一种l-乳酸酸菜发酵粉剂是十分有必要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种l-乳酸酸菜发酵粉剂及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备的乳酸菌发酵粉剂制备工艺简单，对操作要求低，且能有效抑制发酵酸菜的杂菌生长、减少亚硝酸盐产生、保持vc含量、缩短生产周期、延长保藏期等，适于酸菜的工业化生产。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种l-乳酸酸菜发酵粉剂的制备方法，包括以下步骤：
7.将嗜淀粉乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌接入固体培养基中，26-46℃培养12-96h，粉碎、装袋即得所述l-乳酸酸菜发酵粉剂。
8.进一步地，所述固体培养基包括以下组分：白菜帮1-1.5kg、乙酸钠2-3g、柠檬酸二铵1-2g、磷酸氢二钾1-2g、硫酸镁0.1-0.5g、玉米粉30-50g和麸皮粉40-140g。
9.进一步地，所述固体培养基包括以下组分：白菜帮1kg、乙酸钠3g、柠檬酸二铵1g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.1g、玉米粉50g和麸皮粉100g。
10.进一步地，所述嗜淀粉乳杆菌、所述植物乳杆菌和所述短乳杆菌的总接种量为6％，其中，所述嗜淀粉乳杆菌、所述植物乳杆菌和所述短乳杆菌的接种量比值为2：1：(0-1)。
11.进一步地，所述培养的条件为42℃培养72h；所述装袋的用量为100-300g/袋。
12.本发明还提供一种所述的制备方法获得的l-乳酸酸菜发酵粉剂。
13.本发明还提供一种所述的l-乳酸酸菜发酵粉剂在发酵生产l-乳酸酸菜中的应用。
14.本发明公开了以下技术效果：
15.本发明采用白菜帮、玉米粉和麸皮粉等农业废弃物为主要原料进行乳酸菌固体培养，简单易行，且降低乳酸菌发酵粉剂的生产成本。
16.本发明制备的乳酸菌发酵粉剂可应用于发酵l-乳酸酸菜，能够降低酸菜发酵周期，提高产品质量，降低发酵污染腐败，并且该发酵粉剂的制备工艺简单，对操作要求低，不需要企业额外置购微生物分离、培养、鉴定等一系列设备和仪器，明显减轻企业负担，同时该发酵粉剂减少了繁重的工序和传代复壮次数，有效地防止菌株变异及霉菌的污染，提高发酵工业的劳动生产率，适于酸菜的工业化生产。
17.本发明采用制备的乳酸菌粉剂发酵l-乳酸酸菜，能有效抑制发酵酸菜的杂菌生长、减少亚硝酸盐产生、缩短生产周期、延长保藏期等；同时成品酸菜中vc含量高于传统发酵酸菜，高含量的vc在一定程度上也会降低亚硝酸盐的形成速度，从而进一步提高酸菜品质。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为玉米粉添加量对菌数和l-乳酸含量的影响；
20.图2为麸皮粉添加量对菌数和l-乳酸含量的影响；
21.图3为发酵温度对菌数和l-乳酸含量的影响；
22.图4为发酵时间对菌数和l-乳酸含量的影响；
23.图5为接菌量对菌数和l-乳酸含量的影响；
24.图6为袋装量对菌数和l-乳酸含量的影响；
25.图7为复合菌种发酵粉剂对发酵过程中细菌总数的影响；
26.图8为复合菌种发酵粉剂对发酵过程中乳酸菌总数的影响；
27.图9为复合菌种发酵粉剂对发酵过程中霉菌总数的影响；
28.图10为复合菌种发酵粉剂对发酵过程中酵母菌总数的影响；
29.图11为复合菌种发酵粉剂对生产周期的影响；
30.图12为复合菌种发酵粉剂对产品亚硝酸盐含量的影响；
31.图13为复合菌种发酵粉剂对产品vc含量的影响；
32.图14为表1中菌种1号发酵酸菜的照片；
33.图15为表1中菌种2号发酵酸菜的照片；
34.图16为表1中菌种3号发酵酸菜的照片；
35.图17为表1中菌种4号发酵酸菜的照片。
具体实施方式
36.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
37.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
38.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
39.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
40.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
41.实施例1
42.1培养基：
43.mrs培养基(g/l)：牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖10，乙酸钠5，柠檬酸二铵2，k2hpo42，mgso4·
7h2o 0.2，mnso4·
4h2o 0.05，ph自然；分装到500ml三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。
44.固体培养基：1kg白菜帮打成浆，乙酸钠3g，柠檬酸二铵1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.1g，玉米粉50g，麸皮粉100g，装袋，200g/袋，121℃灭菌45min，备用。
45.2液体菌种制备：把4℃保藏的乳酸菌菌种(以嗜淀粉乳杆菌为例)活化后接入mrs培养基中，放置培养箱中42℃培养24h，转化2代，镜检无杂菌则可备用。
46.3发酵粉剂制备：上述液体菌种按6％接入灭过菌的固体培养基中，42℃恒温培养72h，镜检无杂，菌数达到109cfu/g，粉碎，装袋，200g/袋，制成乳酸菌发酵粉剂。
47.4l-乳酸酸菜发酵
48.将白菜清洗干净后，摆放在小号缸中，每缸放10kg，其中2个缸加10l 20g/l盐水即为传统酸菜，另外2个缸加10l 20g/l盐水和20g乳酸菌发酵粉剂即为l-乳酸酸菜，压实封口，每种设2个平行样，取2个平均样的平均值。
49.5检测方法
50.5.1总酸测定
51.按照gb/t12456—2008执行。
52.吸取酸菜汁10ml于200ml三角瓶中，加入25ml蒸馏水，滴入酚酞指示剂2滴，用naoh标准溶液滴定至粉红色，并能保持30s不褪色为止，记录naoh用量。
53.5.2亚硝酸盐测定
54.按照gb/t 5009.33-2010的盐酸萘乙二胺法执行。
55.将酸菜用研钵研碎，称取5.0g试样，置于200ml烧杯中，加入12.5ml饱和硼砂液，搅拌均匀，以70℃的水300ml将试样洗入500ml容量瓶中于沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温，后加入5ml亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入5ml乙酸锌溶液混匀，以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，放置0.5h，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液30ml，收集剩余滤液备用。吸取40ml上述处理液于50ml带塞比色管中，加入2ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5min，再加入1ml盐酸萘乙二胺溶液(2g/l)，混匀，加水至刻度，静置15min，用2cm比色杯于538nm处测吸光值，同时以等量的蒸馏水代替样品液，按同样的处理方法，做空白对照。
56.5.3vc含量的测定
57.按照gb 5009.86—2016食品安全国家标准食品中抗坏血酸2.6—二氯靛酚滴定法。
58.称取切碎的酸菜样品20.00g，放在研钵中加2％草酸溶液少许研碎，倒入200ml容量瓶中，加2％草酸溶液至刻度，用离心机离心沉淀后过滤备用。吸取10.0ml滤液于烧杯中，用2.6―二氯靛酚钠盐溶液滴定至桃红色20s不褪色，记下染料的用量。吸取2％草酸溶液，用染料作空白滴定记下用量。
59.5.4l-乳酸测定
60.按照d/l-乳酸检测试剂盒(d/l-lacticacidassay kit)步骤检测。
61.酸菜汁离心，必要时进行稀释，使l-乳酸质量浓度到0.003-0.30g/l之间；温育到25℃备用。
62.5.5微生物指标测定
63.菌落总数按gb4789.2-2016《食品微生物菌落总数的测定》执行；乳酸菌培养及计数按gb4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物检验乳酸菌检验》执行；霉菌和酵母菌计数按gb4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》执行；大肠菌群计数按gb4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠杆菌计数》执行。
64.5.6有机酸分析
65.样品处理：称取样品10g，加入50ml重蒸水匀浆，75℃水浴加热30min，冷却至室温，滤纸过滤，定容至100m l，450μm膜过滤。
66.色谱条件：有机酸含量的测定采用法hplc。
67.色谱条件为：色谱柱apolloc
18
(5μm,250
×
4.6mm)：柱温25℃，流动相为0.5％(nh4)2hpo
4-h3po4(ph2.5)缓冲液，使用前用450μm滤膜抽滤，流速为1.0ml/min，紫外检测波长210nm，进样量20μl。
68.分析步骤
69.①
标准曲线制作
70.准确称取各有机酸标准品0.5g，以重蒸馈水溶解并定容至100ml。从中吸取20.0ml再次定容至100ml即为1.0mg/ml标准藏液。
71.分别吸取藏液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00ml加入0.2ml 1mol/lh3po4，以重蒸馈
水定容至10ml。进样量20μl分别检测。分别测定不同标准品出峰时间，及其不同浓度所对应的峰面积，制作标准曲线。
72.②
样品测定
73.各待测进行样品处理后上机检测，记录数据，与标准曲线对照定量计算。
74.5.7感官评价影响
75.20位专业人员通过观察发酵液、成品酸菜色泽、闻气味和脆度得出感官评价结果。
76.6条件筛选
77.在上述1-4的基础上进行下述条件筛选：
78.6.1固体培养基中玉米粉添加量的确定
79.分别以30、35、40、45、50、55g用量的玉米粉研究固体培养基对乳酸菌菌数和发酵产l-乳酸含量的影响。结果如图1所示，当玉米粉添加量为50g时，菌数89.7
×
108cfu/g和l-乳酸22.52mg/kg，含量均达到最高，因此，固体培养基中玉米粉添加量确定为50g。
80.6.2固体培养基中麸皮粉添加量的确定
81.从图2可以看出，麸皮粉添加量为100g时菌数为90.2
×
108cfu/g和l-乳酸含量22.61mg/kg，均达到最高，固体培养基中麸皮粉添加量确定为100g。
82.6.3发酵粉剂发酵温度的确定
83.从图3可以看出，在42℃时菌数为90.9
×
108cfu/g和l-乳酸含量为22.48mg/kg，均达到最高，发酵温度确定为42℃。
84.6.4发酵粉剂发酵时间的确定
85.从图4可以看出，在72h时菌数为90.1
×
108cfu/g和l-乳酸含量为22.32mg/kg，均达到最高，发酵时间确定为72h。
86.6.5乳酸菌接种量的确定
87.从图5可以看出，在接菌量为6％时菌数为88.5
×
108cfu/g和l-乳酸含量为22.37mg/kg，均达到最高，接菌量确定为6％。
88.6.6发酵粉剂装袋量的确定
89.从图6可以看出，在袋装量为200g/袋时，菌数为87.1
×
108cfu/g和l-乳酸含量为22.46mg/kg，均达到最高，袋装量确定为200g/袋。
90.6.7菌种组合配比筛选
91.在上述单一采用嗜淀粉乳杆菌为乳酸菌发酵粉剂菌种的基础上，本发明优选嗜淀粉乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌为组合菌种制备乳酸菌发酵粉剂后，发酵生产l-乳酸酸菜。各菌种的用量配比如表1所示，在上述1-4的基础上研究菌种配比对酸菜酸度和l-乳酸含量的影响。
92.从表1中可知，四组试验的总酸含量没有显著差异，但是，当嗜淀粉乳杆菌：植物乳杆菌：短乳杆菌为1：1：1(图14)和1：3：1(图17)时，颜色较深，质地较软，而酸菜2(图15)和3(图16)的口感较好，酸度适中，酸菜菜叶颜色为嫩黄色，菜帮为透明状白色，表明酸菜发酵适中；只有2和3的l-乳酸含量高于20mg/kg。因此，酸菜发酵菌种确定为嗜淀粉乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌，菌种比例在范围内2：1：(0-1)。为丰富酸菜口感，最后菌种配比确定为2：1：1，进行下述研究。
93.表1菌种比例对酸菜酸度和l-乳酸含量影响
[0094][0095]
7复合菌种发酵粉剂对保藏期的影响
[0096]
从图7中可以看出，使用此乳酸菌发酵粉剂的酸菜和传统酸菜在整个发酵过程中，总细菌菌落数都随时间延长而下降；由于使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜产酸快而多，总酸高，能更好地抑制杂菌的生长繁殖，总细菌菌落数始终比传统酸菜少，安全性更高。
[0097]
从图8中可以看出，在整个发酵过程中使用此乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜的乳酸菌数量始终高于传统自然发酵的酸菜，在第21d达到最高，之后缓慢下降最后趋于不变；传统酸菜在测试的第42d乳酸菌数达到最高。l-乳酸酸菜由于接种该乳酸菌发酵粉剂的菌种优势，乳酸菌生长繁殖快。这个结果与总酸含量变化也是吻合的。
[0098]
从图9中可以看出，在整个发酵过程中传统自然发酵的酸菜中发酵前期霉菌数量较多，随着发酵时间延长，大量乳酸的产生，抑制了部分霉菌的生长，在发酵结束时还有少量霉菌存在；使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜在发酵前期霉菌就受到抑制，数量较低，到6d后检测不到霉菌。说明l-乳酸酸菜能更好地抑制霉菌生长繁殖，提高酸菜的安全性。
[0099]
从图10中可以看出，在整个发酵过程中使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜中酵母菌数量始终低于传统发酵的酸菜。在l-乳酸酸菜发酵过程中由于酸度大，有效抑制了酵母菌繁殖，尤其是发酵后期酵母菌数量大量减少。综合以上原因，用该乳酸菌发酵粉剂接种发酵酸菜具有超常的防腐保鲜效果，可使未经灭菌的酸菜在室温下保持1.5年之久不腐败变质。
[0100]
8复合菌种发酵粉剂对生产周期的影响
[0101]
从图11可以看出，在整个发酵过程中，两种酸菜的总酸都呈现先上升趋，然后呈现微上升的趋势，这是后期由于大量的乳酸积累，从而进入过酸阶段，导致乳酸菌群受到了抑制，导致酸菜的总酸上升减慢。但使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜的总酸上升的幅度要比传统自然发酵的酸菜快，l-乳酸酸菜在第20d就能达到成熟酸度1.1％(ph3.5)，而传统酸菜在第42d达到成熟。此试验得出，l-乳酸酸菜比传统酸菜提前22d成熟，节约一倍的时间，这样可以大大缩短生产周期。
[0102]
9复合菌种发酵粉剂对产品亚硝酸盐含量的影响
[0103]
由图12可知，使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜中亚硝酸盐含量在发酵全程均低于传统酸菜，而且含量一直很低，远远低于酱腌菜国标限值(gb2762—2017酱腌菜中亚硝酸盐含量20mg/kg)，没有亚硝酸盐峰值出现。而传统酸菜在第12d达到峰值29.17mg/kg，到第28d符合酱腌菜标准。这首先因为使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜中乳酸菌数量高，产酸多，在一定程度上抑制有害菌及还原性细菌的生长繁殖，从而减少亚硝酸盐的含量；其次因为乳酸菌在代谢过程中可以产生有抑菌活性的多肽或前体多肽，也能高效抑制杂菌繁殖、减少亚硝酸盐含量。结果表明，传统酸菜在12～28d时亚硝酸盐含量较高，而接入该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜不存在亚硝酸盐超标问题，能更好地控制亚硝酸盐含量，提高酸
菜安全性。
[0104]
10复合菌种发酵粉剂对产品vc含量的影响
[0105]
由图13可知，在整个发酵过程中，使用该乳酸菌发酵粉剂的l-乳酸酸菜和传统酸菜中vc含量都随发酵时间延长而减少。但l-乳酸酸菜中vc的含量始终高于传统发酵的酸菜。有研究报道vc能在一定程度上抑制或减少亚硝酸盐形成，所以vc含量增加不但提高了l-乳酸酸菜的品质也增加了l-乳酸酸菜的安全性。
[0106]
11复合菌种发酵粉剂对酸菜风味物质的影响
[0107]
分别对复合菌种发酵粉剂发酵的l-乳酸酸菜和传统酸菜进行hplc分析，有机酸分析结果(表2)表明，用该乳酸菌发酵粉剂接种发酵的l-乳酸酸菜与自然发酵酸菜中的有机酸种类和含量并无明显差异，但l-乳酸酸菜中的草酸含量最少；同时l-乳酸酸菜中的乳酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸的含量高于自然发酵蔬菜的，尤其是琥珀酸含量远远高于传统发酵蔬菜。琥珀酸是一种具有鲜味的有机酸，其钠盐具有独特的类似贝类的鲜味，有较高的鲜味口感。与其最高感官评价得分相一致。
[0108]
表2hplc检测两种发酵方式酸菜的有机酸含量
[0109][0110]
表3感官评价
[0111][0112]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种l-乳酸酸菜发酵粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将嗜淀粉乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌接入固体培养基中，26-46℃培养12-96h，粉碎、装袋即得所述l-乳酸酸菜发酵粉剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基包括以下组分：白菜帮1-1.5kg、乙酸钠2-3g、柠檬酸二铵1-2g、磷酸氢二钾1-2g、硫酸镁0.1-0.5g、玉米粉30-50g和麸皮粉40-140g。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基包括以下组分：白菜帮1kg、乙酸钠3g、柠檬酸二铵1g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.1g、玉米粉50g和麸皮粉100g。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述嗜淀粉乳杆菌、所述植物乳杆菌和所述短乳杆菌的总接种量为6％，其中，所述嗜淀粉乳杆菌、所述植物乳杆菌和所述短乳杆菌的接种量比值为2：1：(0-1)。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养的条件为42℃培养72h；所述装袋的用量为100-300g/袋。6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法获得的l-乳酸酸菜发酵粉剂。7.一种如权利要求6所述的l-乳酸酸菜发酵粉剂在发酵生产l-乳酸酸菜中的应用。

技术总结
本发明公开了一种L-乳酸酸菜发酵粉剂及其制备方法和应用，属于生物发酵工程技术领域。所述制备方法包括：将嗜淀粉乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌接入固体培养基中，26-46℃培养12-96h，粉碎、装袋即得所述L-乳酸酸菜发酵粉剂。本发明采用白菜帮、玉米粉和麸皮粉等农业废弃物为主要原料进行乳酸菌固体培养，简单易行，且降低乳酸菌发酵粉剂的生产成本；该乳酸菌发酵粉剂的制备工艺简单，对操作要求低，其可应用于发酵L-乳酸酸菜，能有效抑制发酵酸菜的杂菌生长、减少亚硝酸盐产生、保持V


技术研发人员：刘晓辉 李杨 敖静 高晓梅 孙玉禄 宋立群 池景良
受保护的技术使用者：辽宁省微生物科学研究院
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/12