基于酶法检测口腔中产酸龋齿致病菌的培养基、检测试剂盒、系统及其应用

1.本发明属于微生物培养和检测分析技术领域，具体涉及基于酶法检测口腔中产酸龋齿致病菌的培养基、检测试剂盒、系统及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.龋齿是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与癌和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。主要临床表现为牙齿硬组织进行性病损，包括无机质脱矿和有机质的分解，随病程发展而从色泽改变到形成实质性病损的演变过程。其特点是发病率高，分布广，并且儿童患龋情况已呈现上升态势，成年人的患龋率在60%以上。
4.龋齿是一种细菌性疾病，研究表明主要的龋齿致病菌为变异链球菌。口腔中的变异链球菌将致龋性食物：特别是蔗糖和精制碳水化合物紧紧贴附于牙面，在适宜温度下，龋齿致病菌有足够的时间在菌斑深层产酸，侵袭牙齿，使之脱矿，并进而破坏有机质，产生龋齿。继续发展则会继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。作为肉眼观察不到的细菌，变异链球菌在口腔中的定殖、繁殖和侵蚀牙齿是一个逐渐发展的过程，定殖和繁殖阶段看不到其存在以及牙齿的变化，容易引起忽视导致发现时已经有了明显的病斑，破坏了牙冠甚至牙神经系统。因此，加强日常对儿童口腔中的致龋变异链球菌的监测，建立方便、快捷的口腔产酸龋齿致病菌的检测方法，是实现龋病风险预防、科学量化评估、进而实施针对性的靶干预预防和治疗措施的重要方法途径。
5.专利（申请号：201510849262.x，202010332829.7）针对龋齿建立了基于ph变化的检测评估方法。取样菌斑在加入酸碱指示剂的培养基中培养24-48小时，产酸龋齿致病菌产酸后ph降低，培养液颜色随着ph改变，通过颜色变化的规律判断变异链球菌的多少，进而进行龋病的风险评估。该方法简单便捷，但依赖指示剂的颜色变化进行评判，需要培养较长时间才能产生足够的乳酸，降低ph到达试纸检测范围，获得结果慢且判断精准度较低。因此，建立一种精准便捷的变异链球菌检测方法对于龋齿风险评估系统的建立具有重要的研究意义和应用价值。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术，本发明提供一种基于酶法检测口腔中产酸龋齿致病菌的培养基、检测试剂盒、系统及其应用。本发明通过优化培养基从而实现促进变异链球菌快速生长，并基于酶反应原理检测乳酸生成，检测结果精准，使用范围广，方法灵活。基于上述研究，从而完成本发明。
7.具体的，本发明涉及以下技术方案：本发明的第一方面，提供一种适合产酸龋齿致病菌生长的选择性培养基，所述选择性培养基其成分包括：葡萄糖1-4 g/l，蔗糖2-5 g/l，磷酸氢二钠1-4 g/l，牛心浸粉0.5-3 g/l，氯化钠1-3 g/l，多粘菌素b 10-50 mg/l，ph 7.0。
8.该配方经系列优化获得，实验过程中发现葡萄糖与蔗糖组合能够促进变异链球菌快速生长，经优化获得最优培养基成分包括：葡萄糖2 g/l，蔗糖3 g/l，磷酸氢二钠2 g/l，牛心浸粉2 g/l，氯化钠2 g/l，多粘菌素b 40 mg/l，ph 7.0。
9.本发明的第二方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含培养管，所述培养管中含有上述选择性培养基。具体的，所述选择性培养基经灭菌后灌入培养管中。
10.进一步的，所述培养管（最大）容量可以为2-15 ml，所述选择性培养基体积不大于培养管（最大）容量的1/3。本发明研究发现，选择5 ml培养管装液量1 ml时更有利于变异链球菌的快速生长。出现该结果的原因可能是培养管装液量高时，下层菌体因缺氧生长缓慢所造成，使用优化后的装液量不仅有效的改善这一缺陷，而且节约了培养基成本。因此在本发明的一个具体实施方式中，所述培养管（最大）容量为5 ml，所述选择性培养基体积为1 ml。
11.所述检测试剂盒还含有乳酸氧化酶检测液、2,4-二硝基苯肼（dnph）溶液，以及碱液。所述碱液可以为naoh。通过上述成分的选择加入，从而基于酶法检测显色（乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸采用dnph显色法检测），获取待测样品的产乳酸含量，判断致龋菌情况，从而可对口腔龋齿易感性进行评估判断。
12.因此，本发明的第三方面，提供上述选择性培养基、检测试剂盒在制备产酸龋齿致病菌检测和/或口腔龋齿易感性风险评估的产品中的应用。
13.本发明的第四个方面，提供一种产酸龋齿致病菌检测和/或口腔龋齿易感性风险评估的系统，所述系统包括分析模块和评估模块；其中，所述分析模块至少包含上述选择性培养基或检测试剂盒，用于获取受试者样品致龋菌的产乳酸情况（显色情况）；所述评估模块根据上述产乳酸情况（显色情况），基于515 nm光吸收度值和/或显色情况对应的ph值（可选用比色卡实现），获得对应的龋态值（cat值），从而输出龋齿严重程度。
14.其中，所述受试者样品为受试者牙齿表面附着物样品，具体可采用无菌棉棒对牙齿表面蘸取轻微摩擦后获得。
15.若ph》6.0，od
515nm
《120，则cat值为0~0.5，表明龋齿易感性属于安全区；若ph为6.0-5.2，od
515nm
为120-170，则cat值为0.5~1.0，表明龋齿易感性属于注意区；若ph为5.2-4.8，od
515nm
为170-225，则cat值为1.0~1.5，表明龋齿易感性属于危险区；若ph＜4.8，od
515nm
》225，则cat值为2.0~3.0，表明龋齿易感性属于高危区。
16.以上一个或多个技术方案的有益技术效果：1.优化的培养基能够促进变异链球菌快速生长。首先发现葡萄糖作为唯一碳源更能促进菌体初期快速生长，而蔗糖为唯一碳源则初期生长较慢。通过优化获得葡萄糖和蔗
糖组合的培养基配方。其次，通过不同溶解氧培养发现中等厌氧条件更有利于变异链球菌的快速生长，因此选择5 ml培养管装液量1 ml，既克服了现有试剂盒培养管装液量高、下层因缺氧菌体生长缓慢的缺陷，又节约了培养基成本。最后，为抑制革兰氏阴性菌生长，通过采集牙菌斑样品做实验，发现加入40 mg/l的多粘菌素b，可以抑制阴性菌生长，而革兰氏阳性菌变异链球菌不受抑制从而能优势快速生长。经过系列优化，优化培养基及培养条件让变异链球菌接种后快速生长，产酸快，缩短检测时间的同时产品生产成本低。
17.2.能够微量检测。结合酶反应原理检测乳酸生成，菌体生长后产生微量乳酸即可检测出来，因此本方案能极大缩短培养检测时间，即使针对龋齿样品致龋菌含量极少的，培养5-10小时均可进行检测评价；3.检测结果精准。针对标准曲线计算乳酸产量，检测范围宽，不同龋齿的严重程度均可以检测，可以发现牙菌斑中极少量的致龋菌且结果精准；4.使用范围广，方法灵活。个人家庭使用，利用比色卡比色检测，结果读取简便易懂，通过肉眼观察即可进行口腔龋齿易感性风险评判。医院使用，通过测定od
515nm
可以实现更加精准的分析和风险评判。因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
18.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
19.图1为丙酮酸含量与515 nm光吸收度（od
515nm
）的标准曲线。
20.图2为培养液比对色卡。
具体实施方式
21.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
23.本发明的一个典型具体实施方式中，一种基于酶法显色的快速检测口腔中产酸龋齿致病菌的方法，包括如下步骤：（1）本发明选择利用一种适合产酸龋齿致病菌生长的选择性培养基及培养条件，该配方经系列优化获得，实验过程中发现葡萄糖与蔗糖组合能够促进变异链球菌快速生长，经优化获得最优培养基成分包括：葡萄糖2 g/l，蔗糖3 g/l，磷酸氢二钠2 g/l，牛心浸粉2 g/l，氯化钠2 g/l，多粘菌素b 40 mg/l，ph 7.0。5 ml的培养管中加入1 ml培养基灭菌，培养基配方简单，配置及使用方便，成本低。取样后接种，37℃培养。
24.（2）检测不同时间培养致病菌后的培养液中的乳酸含量，分析并建立培养液ph和
乳酸含量之间的关系（表3）。
25.（3）培养5-10小时后，在1 ml培养液中加入1 μl的乳酸氧化酶检测液（a液），混匀后25-35℃水浴或者空气中放置1 小时，充分产生丙酮酸，丙酮酸采用dnph法检测，与dnph结合在碱性条件下显紫色。加入dnph碱性溶液（b液），于515 nm处检测最大光吸收值。
26.（4）测定丙酮酸含量与515 nm光吸收度（od
515nm
）的标准曲线（图1），通过分光光度计测定样品的od
515nm
，建立od
515nm
与龋齿易感性比对分区表（表4），对被检样品的龋易感风险进行精准量化分级。建立样品颜色与od
515nm
、丙酮酸含量、乳酸含量的关系，制作培养液颜色比对色卡（图2），比较样品颜色进而对被检样品的龋易感风险进行直观简便的量化分级。
27.2. 针对本发明提供的选择性培养基，其使用方法操作步骤如下：a.取无菌培养基标号。
28.b.取样：针对有明显牙菌斑患者，可直接用无菌棉棒蘸取牙菌斑面及癍面附近，对牙菌斑不明显的，可取无菌棉棒分别在上下前牙唇侧及上下颌磨牙，牙颈部等4-6个部位蘸取轻微摩擦。
29.c.打开对应标号培养基试剂瓶，把取好样的棉签放到里面，轻轻混匀后取出，盖上试剂瓶盖。
30.d.将接种好的试剂瓶置于37℃培养箱中，静置培养5-10小时。
31.e.在1 ml培养液中分别加入a、b液充分反应后，分光光度计测定od
515nm
，比对od分区表，对口腔龋齿易感性作出精准判定。
32.f.测试管颜色和ph-比色卡对比，对口腔龋齿易感性作出快速判定。
33.本发明技术方案工作原理如下：本发明基于口腔中致龋菌经过恒温条件下培养，在其生长繁殖过程中，消耗糖类物质生成乳酸，通过乳酸氧化酶氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸采用dnph显色法检测，获取待测样品的产乳酸含量，从而达到快速检测口腔中产酸菌致龋菌的目的，也即达到了对口腔龋齿易感性的风险评价目的。
34.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
35.实施例1：检测培养基和装液量优化培养基成分以及配比为：葡萄糖0-5 g/l，蔗糖0-5 g/l，磷酸氢二钠0-3 g/l，牛心浸粉0-5 g/l，氯化钠0-5 g/l，多粘菌素b 20-40 mg/l，ph 7.0，4 ml培养管内分装2 ml培养液，121℃灭菌20 min，于37℃，静置，对变异链球菌进行培养。实验结果显示最佳培养基配比为：葡萄糖2 g/l，蔗糖3 g/l，磷酸氢二钠2 g/l，牛心浸粉2 g/l，氯化钠2 g/l，多粘菌素b 40 mg/l，ph 7.0，详情见表1。
36.培养基装液量优化：在最佳配比培养基成分的基础上，于5 ml培养管内分别分装1 ml、2 ml、3 ml、4 ml培养液，结果发现选择5 ml培养管装液量1 ml时更有利于变异链球菌的快速生长，详情见表2。出现该结果的原因可能是培养管装液量高时，下层菌体因缺氧生长缓慢所造成，使用优化后的装液量不仅有效的改善这一缺陷，而且节约了培养基成本。
37.表1 不同碳源培养基变异链球菌的生长（三个重复的平均值）
表2 优化培养基在不同氧气条件培养液ph的变化（三个重复的平均值）实施例2：检测不同培养时间培养液中的乳酸含量，分析并建立培养液ph和乳酸含量之间的关系利用优化的培养基，于5 ml培养管内分装1 ml培养液，灭菌后接种变异链球菌。37℃，静置对变异链球菌进行培养。培养过程中用ph计检测培养液的ph，同时用sba生化分析仪检测乳酸浓度，选取表3中的ph及乳酸含量结果整理并列表，获得ph与乳酸之间的关系列表。
38.表3 培养液ph和乳酸含量之间的关系（三个重复的平均值）实施例3：酶法检测及标准曲线绘制使用容量瓶准确配置一系列0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/ml的丙酮酸钠溶液。取1 ml系列丙酮酸钠溶液，之后加入1 ml的1 g/l dnph（溶于1 m hcl中）溶液，于暗处反应5分钟后，再加入2 ml 2.5 m的naoh溶液显色。使用可见分光光度计测定515 nm处的吸光度，使用空白调零，空白组将丙酮酸钠溶液换成等量的蒸馏水，其他组分不变，绘制标准曲线如图1所示。由于酶法检测显色反应的最终体系的体积为4 ml，所以丙酮酸标曲的检测体积与其保持一致，横坐标表示每4 ml反应体系产生的丙酮酸μmol数。
39.实施例4：口腔门诊试剂盒及使用操作方法该试剂盒包含：无菌取样棒、5 ml培养瓶、a液、b液。
40.a.取含有无菌培养基的培养瓶标号。
41.b.取样：针对有明显牙菌斑患者，可直接用无菌棉棒蘸取牙菌斑面及癍面附近，对牙菌斑不明显的，可取无菌棉棒分别在上下前牙唇侧及上下颌磨牙，牙颈部等4-6个部位蘸取轻微摩擦。
42.c.打开对应标号培养基试剂瓶，把取好样的棉签放到里面，轻轻混匀后取出，盖上试剂瓶盖。
43.d.将接种好的试剂瓶置于37℃培养箱中，静置培养5-10小时。
44.e.培养5-10小时后，在1 ml培养液中加入1 μl的乳酸氧化酶检测液（a液），混匀后25-35℃水浴或者空气中放置1 小时，之后加入1 ml的1 g/l dnph（溶于1 m hcl中）溶液（b液），于暗处反应五分钟后，再加入2 ml 2.5 m的naoh溶液显色。
45.f.充分反应后，分光光度计测定od
515nm
，比对od分区表（表4），对口腔龋齿易感性作出精准判定。
46.实施例5：家用试剂盒及使用操作方法a.取含有无菌培养基的培养瓶标号。
47.b.取样：针对有明显牙菌斑患者，可直接用无菌棉棒蘸取牙菌斑面及癍面附近，对牙菌斑不明显的，可取无菌棉棒分别在上下前牙唇侧及上下颌磨牙，牙颈部等4-6个部位蘸取轻微摩擦。
48.c.打开对应标号培养基试剂瓶，把取好样的棉签放到里面，轻轻混匀后取出，盖上试剂瓶盖。
49.d.将接种好的试剂瓶置于室温下，夏天静置培养5-10小时，其余静置培养12-24小时。
50.e.培养后，在1 ml培养液中加入1 μl的乳酸氧化酶检测液（a液），混匀后25-35℃水浴或者空气中放置1小时，之后加入1 ml的1 g/l dnph（溶于1 m hcl中）溶液（b液），于暗处反应五分钟后，再加入1.99 ml 2.5 m的naoh溶液显色。
51.f.测试管颜色和比色卡对比（附图2及表4），对口腔龋齿易感性作出快速判定。
52.表4 培养液ph、515 nm光吸收度（od
515nm
）及龋齿严重程度的对应关系以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、
等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种适合产酸龋齿致病菌生长的选择性培养基，其特征在于，所述选择性培养基其成分包括：葡萄糖1-4 g/l，蔗糖2-5 g/l，磷酸氢二钠1-4 g/l，牛心浸粉0.5-3 g/l，氯化钠1-3 g/l，多粘菌素b 10-50 mg/l，ph 7.0。2.如权利要求1所述的选择性培养基，其特征在于，所述选择性培养基其成分为：葡萄糖2 g/l，蔗糖3 g/l，磷酸氢二钠2 g/l，牛心浸粉2 g/l，氯化钠2 g/l，多粘菌素b 40 mg/l，ph 7.0。3.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含培养管，所述培养管中含有权利要求1或2所述选择性培养基。4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述培养管容量为2-15 ml，所述选择性培养基体积不大于培养管容量的1/3；进一步的，所述培养管最大容量为5 ml，所述选择性培养基体积为1 ml。5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有乳酸氧化酶检测液、2,4-二硝基苯肼（dnph）溶液以及碱液。6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述碱液为naoh。7.权利要求1或2所述选择性培养基、权利要求3-6任一项所述检测试剂盒在制备产酸龋齿致病菌检测和/或口腔龋齿易感性风险评估的产品中的应用。8.一种产酸龋齿致病菌检测和/或口腔龋齿易感性风险评估的系统，其特征在于，所述系统包括分析模块和评估模块；其中，所述分析模块至少包含权利要求1或2所述选择性培养基或权利要求3-6任一项所述检测试剂盒，用于获取受试者样品致龋菌的产乳酸情况（显色情况）；所述评估模块根据上述产乳酸情况（显色情况），基于515 nm光吸收度值和/或显色情况对应的ph值，获得对应的cat值，从而输出龋齿严重程度。9.如权利要求8所述系统，其特征在于，所述受试者样品为受试者牙齿表面附着物样品。10.如权利要求8所述系统，其特征在于，若ph>6.0，od
515nm
<120，则cat值为0~0.5，表明龋齿易感性属于安全区；若ph为6.0-5.2，od
515nm
为120-170，则cat值为0.5~1.0，表明龋齿易感性属于注意区；若ph为5.2-4.8，od
515nm
为170-225，则cat值为1.0~1.5，表明龋齿易感性属于危险区；若ph＜4.8，od
515nm
>225，则cat值为2.0~3.0，表明龋齿易感性属于高危区。

技术总结
本发明属于微生物培养和检测分析技术领域，具体涉及基于酶法检测口腔中产酸龋齿致病菌的培养基、检测试剂盒、系统及其应用。本发明通过优化培养基从而实现促进变异链球菌快速生长，并基于酶反应原理检测乳酸生成。具体的，本发明基于口腔中致龋菌经过恒温条件下培养，在其生长繁殖过程中，消耗糖类物质生成乳酸，酸碱指示剂随pH变化产生不同的显色反应，显色程度依乳酸生成及致龋菌的量而定，从而达到快速检测口腔中产酸菌致龋菌的目的，也即达到了对口腔龋齿易感性的检测目的，检测结果精准，使用范围广，方法灵活，因此具有良好的实际应用之价值。用之价值。用之价值。


技术研发人员：张震 杨若涵 贾真珍
受保护的技术使用者：山东师范大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/12