一株同温层芽孢杆菌及在防治作物根结线虫病方面的应用的制作方法

1.本发明属于生防微生物技术领域，具体涉及一株同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，包含该菌株的菌剂及其在防治作物根结线虫病方面的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.根结线虫meloidogyne是世界性分布的土传病害，全球每年的农作物损失约数千亿美元。目前对病害防治多采用化学防治法，然而，化学杀线虫剂的滥用后会对环境造成严重危害。因此，需要具有更高安全性和效率的新型杀线虫剂来保护农作物免受线虫侵扰。利用微生物生防菌防治可以克服化学防治的上述弊病，且研究和实践已证明其对植物根结线虫病害经济有效因而成为防治土传病害研究的热点，越来越受到人们重视。芽孢杆菌作为重要的生防资源，它能够产生许多具有杀线虫活性的次生代谢产物，直接杀灭线虫。
4.目前，研究学者已报道了不同芽孢杆菌对植物寄生线虫的拮抗活性，如嗜气芽孢杆菌bacillus aerophilus zdxc-01，其发酵液对根结线虫的致死率达到78.3％；对45d番茄根结线虫的防效为74.12％；溶蛋白芽孢杆菌bacillus proteolyticus bp 196发酵液原液对黄瓜根结线虫防治效率达86.5％。目前，针对同温层芽孢杆菌抑杀线虫的研究暂无发表数据。


技术实现要素：

5.本发明从黄瓜根际土壤中分离得到一株具有线虫防治效果的菌株，通过菌株形态鉴定及全基因组分析，该菌株16s rrna序列与bacillus stratosphericus lama 585、bacillus stratosphericus亲缘关系相近，可判定为同温层芽孢杆菌，定名为同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064。
6.本发明针对上述菌株的杀虫作用进行了验证，该菌株的发酵液、上清液均表现出较高的杀虫活性，黄瓜盆栽实验显示，上述菌剂能够有效抑制根结线虫病的发生，减少黄瓜根结数量，改善作物的长势。
7.基于上述技术效果，本发明提供如下的技术方案：
8.第一方面，提供一株同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，该菌株已于2023年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：中国
·
武汉
·
武汉大学，其生物保藏号为：cctcc m 2023517。
9.所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064的形态学特征如下：
10.菌体特征：菌体杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性，具有圆形末端，单个排列，形成内
生孢子，孢子为椭圆形，中生或亚端生。
11.菌落特征：白色，形状不规则，表面褶皱、干燥、有光泽，不透明，边缘线平滑。
12.所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064的生理生化特征如下：
13.能利用d-木糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇等，能水解淀粉，可还原硝酸盐。
14.所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064的适宜发酵培养方式如下：刮取斜面中的菌体接种于种子液培养基，30-37℃、150～200rpm振荡培养18-24h，获得液体发酵种子，将发酵种子接种于发酵罐中，发酵温度30-37℃，接种量5％，发酵罐搅拌速度140～180rpm，通气量1∶0.8vvm，发酵时间为24-36h。
15.上述发酵方式中，所述种子液培养基的主要成分包括胰蛋白胨、酵母浸膏及氯化钠，质量比为1～3:1:1～3，ph7.0-7.5；发酵培养基的主要成分：玉米冻干粉、蛋白胨、玉米淀粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰、碳酸钙，其质量比为10～14：10～14：18～22：4～6：1：1：0.2：1，ph7.0-7.5。
16.上述条件配置的种子液过夜培养后仍然具有良好的活性、无污染，产孢量较大，接种于发酵罐中经30h培养后可获得较高的活菌量，作为工业发酵方法具有更高的经济效益。
17.第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064和/或菌的培养物。
18.上述菌剂中，所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064的使用形式包括活菌菌粉、菌的上清液或菌悬液等；所述菌的培养物主要为菌的发酵物及接种该菌株的培养基，包括液体及固体形式，其中发酵物的具体实例如发酵液、发酵物的上清液，或其稀释液等。
19.所述菌剂剂型为液体剂、粉剂或颗粒剂，如水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
20.一些实施方式中，所述菌剂用于制备微生物农药，该系列的实施方式中，所述菌剂中包括农药学上述可接受的辅料，如分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料或载体中的一种或多种。
21.第三方面，提供第一方面所述同温层芽孢杆菌、第二方面所述菌剂在防治作物根结线虫病方面的应用。
22.上述应用方式包括将所述菌株、菌剂应用于制备根结线虫病的生防制剂，还包括将所述菌株、菌剂施用于作物。
23.第四方面，一种防治作物根结线虫病的方法，采用第一方面所述同温层芽孢杆菌、第二方面所述菌剂冲施需要防治的作物。
24.上述方法可行的作物包括但不限于黄瓜、芸豆、番茄、烟草、生姜等，本发明验证的实施方式中，所述作物为黄瓜或芸豆。
25.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
26.本发明涉及一株同温层芽孢杆菌的培养物(包括发酵液、上清液、菌悬液)及其在防治根结线虫的应用。所述同温层芽孢杆菌的发酵液和上清液对根结线虫抑制效果较好，对线虫的校正死亡率为98.6％，盆栽防治率可达89.93％，利用该菌剂能减少根结线虫的病情指数，促进黄瓜长势，具有很好的应用前景。
附图说明
27.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
28.图1处理1次后芸豆株高和叶长对比图(左对照，右处理)
29.图2拔秧时线虫根结情况(左处理、右对照)
30.图3.拔秧时植株整体长势对比图(左处理、右对照)。
具体实施方式
31.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
33.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
34.实施例1菌株的筛选及鉴定
35.一、实验材料
36.1、培养基：
37.nb培养基：1％蛋白胨，0.3％牛肉粉，0.5％氯化钠，115℃灭菌30min即为nb培养基。
38.na培养基：1％蛋白胨，0.3％牛肉粉，0.5％氯化钠，2％琼脂，115℃灭菌30min即为na培养基。
39.2、样品来源：土壤样品采集于山东省泰安市肥城蔬菜种植大棚黄瓜根际土壤(116
°
46
′
30
″
e，36
°
05
′
58
″
n)。
40.二、实验方法
41.1、菌株分离
42.称取新鲜土壤10g接入100ml无菌水中，在37℃摇床中180rpm震荡30min，用无菌水进行梯度稀释，依次得到10-3
、10-4
、10-5
系列土壤稀释液，各取100μl涂布于营养肉汤平板上，重复3次，置于37℃培养箱中培养24h，挑选不同菌落形态不断纯化，直至得到单菌落。
43.2、具有杀线虫效果菌种的初筛
44.(1)线虫制备：在黄瓜根部取线虫卵囊置于装有无菌水的六孔板中，28℃培养至线虫孵化。
45.(2)发酵液制备：将不同菌株的单菌落分别接种于nb培养基中，37℃、180r/min振荡培养24h，备用。
46.(3)杀虫效果验证：挑取二龄幼虫与菌种发酵液共培养，在24h观察线虫死亡数目并计算线虫校正死亡率。
47.死亡率＝死亡线虫数/处理总线虫数
×
100％
48.校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)
×
1003、菌种鉴定：
49.(1)菌株形态鉴定
50.菌体形态采用结晶紫染色法，置于100倍油镜下观察。
51.(2)生理生化鉴定
52.参考伯杰氏系统细菌学手册鉴定方法，利用氧化实验、硫化氢实验、尿素分解实验、柠檬酸利用实验、明胶水解实验、硝酸盐还原实验等生理生化反应进一步验证目的菌株。
53.(3)全基因组分析
54.准备纯度高、活性好的菌株斜面送至青岛生工进行全基因组测定，并对其结果进行分析。
55.三、实验结果
56.1、菌种分离
57.经梯度稀释涂布法共计获得了形态不同的菌株共计36株。
58.2、菌种的初筛
59.对初筛获得的36株菌进行杀根结线虫效果初筛，结果显示其中4株菌与根结线虫共培养后表现出较高的线虫死亡率，死亡率为88.9％-98.6％，其中nbl-b1n064表现最好，对根结线虫的致死率达到98.6％。
60.结果见表1。
61.表1具有杀根结线虫菌株的筛选
[0062][0063][0064]
2、菌种鉴定
[0065]
(1)菌种的菌体菌落形态：
[0066]
nbl-b1n064的菌落观察特征为白色，形状不规则，表面褶皱、干燥、有光泽，不透明，边缘线平滑。显微镜观察菌落纯化后的菌株特征为菌体杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性，具有圆形末端，单个排列，形成内生孢子，孢子为椭圆形，中生或亚端生。
[0067]
(2)菌种的生理生化特征：
[0068]
表2菌株nbl-b1n064的生理生化特征
[0069][0070]
注：“+”表示阳性反应，
“‑”
表示阴性反应
[0071]
(3)菌种的全基因组测序分析：
[0072]
经全基因组测序后显示，使用blast将基因预测得到的16s rrna序列与ncbi的16s数据库进行比对，设置参数identify》95。然后选取identify最高的前30条16s rrna序列，并利用muscle软件进行序列多重比对后构建系统发育树，结果显示nbl-b1n064与bacillus stratosphericus lama 585、bacillus stratosphericus亲缘关系相近，可判定nbl-b1n064为同温层芽孢杆菌。
[0073]
实施例2菌种杀虫性能鉴定
[0074]
一、实验材料
[0075]
(1)材料：体外杀虫试验材料为二龄幼虫。
[0076]
二、试验方法
[0077]
(1)不同稀释倍数发酵液对根结线虫的致死作用
[0078]
将nbl-b1n064菌株接于装有100ml nb培养基的三角瓶中，在37℃、180r/min振荡培养24h收集发酵液，分别吸取原液、50倍、500倍稀释的发酵液100μl置于试管中，同时加入线虫悬液100μl，以水处理作为对照，在28℃培养箱中培养24h后观察线虫死亡率。所有试验重复3遍。
[0079]
(2)不同稀释倍数上清液对根结线虫的致死作用
[0080]
将nbl-b1n064菌株接于装有100ml nb培养基的三角瓶中，在37℃、180r/min振荡培养24h，取2ml发酵液于12000rpm离心10min，小心吸取上清，分别吸取原液、50倍、500倍稀释的上清液100μl置于试管中，同时加入线虫悬液100μl，以水处理作为对照，在28℃培养箱中培养24h后观察线虫死亡率。所有试验重复3遍。
[0081]
(3)不同稀释倍数菌悬液对根结线虫的致死作用
[0082]
将nbl-b1n064菌株接于装有100ml nb培养基的三角瓶中，在37℃、180r/min振荡培养24h，取2ml发酵液于12000rpm离心10min，弃上清保存菌体，无菌水多次洗涤、离心去除菌种培养过程中的发酵产物，后加入2ml无菌水重悬菌体获得菌悬液。分别吸取原液、50倍、500倍稀释的菌悬液100μl置于试管中，同时加入线虫悬液100μl，以水处理作为对照，在28℃培养箱中培养24h后观察线虫死亡率。所有试验重复3遍。
[0083]
在体视显微镜下观察并记录线虫死亡数，计算校正死亡率。
[0084]
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)x100％
[0085]
评估标准：根结幼虫的存活状态为弯曲呈不规则“s”型时，表现为假死性，可用1mol/l氯化钠刺激，鉴别幼虫存活状态。反之幼虫僵直则死亡。
[0086]
三、试验结果
[0087]
1)不同稀释倍数发酵液对根结线虫的致死作用
[0088]
将nbl-b1n064菌株发酵液与根结线虫二龄幼虫共培养24h后，该菌表现出较好的杀线虫效果，其发酵液原液与50倍稀释发酵液的杀虫率均高于90％，但随着稀释梯度的增加，其对二龄幼虫的致死率下降，为72.3％。
[0089]
表3在不同浓度下的生防菌发酵液对根结线虫的杀害效果对比
[0090][0091]
2)不同稀释倍数上清液对根结线虫的致死作用
[0092]
将nbl-b1n064菌株上清液与根结线虫二龄幼虫共培养24h后，该菌表现出较好的杀线虫效果，其上清液原液与50倍稀释上清液的杀虫率均高于90％，但随着稀释梯度的增加，其对二龄幼虫的致死率下降，为66.5％。
[0093]
表4在不同浓度下的生防菌上清液对根结线虫的杀害效果对比
[0094][0095]
3)不同稀释倍数菌悬液对根结线虫的致死作用
[0096]
将nbl-b1n064菌株菌悬液与根结线虫二龄幼虫共培养24h后，该菌菌悬液对根结线虫二龄幼虫的致死率比发酵液与上清液略有下降，其菌悬液原液对线虫的致死率为88.3％，50倍稀释菌悬液对线虫的致死率为63.1，500倍稀释菌悬液对线虫的致死率为30.5％.
[0097]
表5在不同浓度下的生防菌菌悬液对根结线虫的杀害效果对比
[0098][0099][0100]
实施例3菌种抑制虫卵孵化性能检测
[0101]
一、试验材料材料：根结线虫的卵囊、同温层芽孢杆菌nbl-b1n064菌株发酵液
[0102]
二、试验材料
[0103]
1、线虫卵囊的获得
[0104]
采集感染根结线虫的黄瓜病根，将带有大量卵囊的病根洗净，在解剖镜下挑取根结线虫卵囊，剧烈振荡及冲洗过筛后制成适当密度(1000个卵/ml)的虫卵悬液。
[0105]
2、菌株发酵液对根结线虫抑制卵孵化实验
[0106]
将同温层芽孢杆菌nbl-b1n064菌株接于装有100ml nb培养基的三角瓶中，在37℃、180r/min振荡培养24h收集发酵液，分别吸取原液、50倍、500倍稀释的发酵液100μl置于试管中，同时加入5ml无菌水、100μl卵悬液，以水处理作为对照，在28℃培养箱中培养24h后记录线虫孵化数量，计算线虫孵化率和抑制孵化率。所有试验重复3遍。
[0107]
线虫孵化率(％)＝孵化线虫数/处理线虫卵数
×
100％；
[0108]
线虫孵化抑制率(％)＝(对照线虫孵化率-处理线虫孵化率)/对照线虫孵化率
×
100％。
[0109]
三、试验结果
[0110]
利用不同浓度的发酵液处理线虫虫卵24h后，同温层芽孢杆菌nbl-b1n064均表现出抑制线虫孵化的能力，其中nbl-b1n064发酵液原液抑制孵化率为94％，50倍稀释液抑制孵化率为78.2％，500倍稀释液抑制孵化率为38.1％。
[0111]
表6
[0112]
[0113][0114]
实施例4菌种的固氮基因检测
[0115]
一、试验材料
[0116]
1、试验材料：同温层芽孢杆菌nbl-b1n064菌株
[0117]
2、试验试剂：细菌基因组dna提取试剂盒、固氮基因扩增引物(上游nifh-f:ttatactacaggagcttcag，下游nifh-r：atgacagacgaaaacattag)二、试验方法
[0118]
经同温层芽孢杆菌nbl-b1n064全基因组分析结果显示，其中20个基因参与氮代谢通路，为检测该菌株是否具有固氮能力，对固氮关键基因nif进行了检测。具体操作方法为
[0119]
(1)基因组dna的提取：将nbl-b1n064利用nb液体培养基进行摇菌活化，利用细菌基因组dna提取试剂盒进行nbl-b1n064基因组dna提取。
[0120]
(2)固氮基因nif的扩增及检测：以nbl-b1n064基因组dna为模板，以nifh-f、nifh-r为上下游引物进行固氮酶关键基因nifh的扩增，扩增结果利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0121]
三、试验结果
[0122]
对固氮基因nifh的检测结果显示，nbl-b1n064含有片段长度为894bp的固氮基因，结合前人的研究说明，含有该固氮基因的微生物具有将分子氮转化为氨的潜在能力，能够促进植物的氮吸收，从而促进植物生长。
[0123]
实施例5菌种的发酵培养
[0124]
一、试验材料
[0125]
1、种子液培养基：胰蛋白胨10g/l；酵母浸膏5g/l；氯化钠10g/l；ph7.0-7.5。
[0126]
2、发酵培养基1：玉米冻干粉12.5g/l、蛋白胨12.5g/l、玉米淀粉20g/l、葡萄糖5g/l、硫酸镁1g/l、磷酸氢二钾1g/l、硫酸锰0.2g/l、碳酸钙1g/l、ph7.0-7.5。
[0127]
发酵培养基2：玉米淀粉20g/l、玉米浆干粉10g/l、葡萄糖5g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸氢二钾1g/l、硫酸锰0.2g/l、碳酸钙1g/l、ph7.0-7.5。
[0128]
发酵培养基3：淀粉40g/l、葡萄糖5g/l、玉米桨干粉120g、蛋白胨10g/l、酵母膏7.5g/l、磷酸氢二钾2.5g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.25g/l、碳酸钙5g/l、ph7.0-7.5。
[0129]
发酵培养基4：玉米粉25g/l、鱼粉25.0g/l、蛋白胨15.0g/l、玉米浆干粉5.g/l、碳酸钙1.0g/l、硫酸镁0.3g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、ph7.0-7.5。
[0130]
二、试验方法
[0131]
1、种子液制备：刮取斜面中菌体接种于含有500ml种子液培养基的3l三角瓶中，37℃、180rpm振荡培养培养18-24h，获得液体发酵种子，镜检观察种子液长势、纯度、产孢量。
[0132]
2、发酵工艺优化(20l)：在500l三角瓶、20l发酵罐中分别进行1n064的发酵培养基摸索，在4种培养基中筛选一组生长状态最优、活菌数最高的培养基配方用于后续700l发酵罐培养。
[0133]
2.发酵罐培养(700l)：将发酵种子接种到700l发酵罐中发酵温度37℃、接种量5％，发酵罐搅拌速度150rpm，通气量1∶0.8vvm，发酵时间为24-36h的条件下得到同温层芽孢杆菌发酵液。发酵结束后利用梯度稀释法进行计数。
[0134]
三、试验结果
[0135]
在4种组分的培养基分别培养后，发现发酵培养基i活菌数最高，活菌数可达3.0
×
109，发酵培养基组分为玉米冻干粉12.5g/l、蛋白胨12.5g/l、玉米淀粉20g/l、葡萄糖5g/l、硫酸镁1g/l、磷酸氢二钾1g/l、硫酸锰0.2g/l、碳酸钙1g/l、ph7.0-7.5。
[0136]
过夜培养的种子液经镜检后显示种子液活性好，无污染，产孢量大于80％，将其按照5％的接种于700l种子罐中，上罐培养30h后结束发酵，冻干后获得活菌数为5
×
10
10
cfu/g的nbl-b1n064发酵冻干粉。
[0137]
实施例6菌种的盆栽试验
[0138]
一、实验材料
[0139]
1、试验试剂：1.8％阿维菌素乳油(济南中基作物科学有限公司)
[0140]
2、试验菌株：活菌数为5
×
10
10
cfu/g的nbl-b1n064菌粉。
[0141]
二、实验方法
[0142]
将同温层芽孢杆菌菌粉溶解后稀释调整浓度至107cfu/g、106cfu/g、105cfu/g。供试作物为黄瓜，待苗长至4片真叶时移栽于装入800g混合土(好土：病土＝3:5)，虫口密度为5-10条/g土。移栽后2d分别按照处理组浇灌无菌水、5％阿维菌素乳油的2000倍稀释液、107cfu/g菌液、106cfu/g菌液、105cfu/g菌液，浇灌量为80ml，每个处理10个重复，每隔15d处理一次，种植45d、60d后调查黄瓜根部根结线虫发病情况并记录病级，计算根结指数及防治效果。
[0143]
根结指数＝σ(病株数
×
相应病级数)/调查的总株数；
[0144]
防治效果％＝(对照根结数-处理根结数)/对照根结数
×
100％
[0145]
三、实验结果
[0146]
采用盆栽试验的方法，通过根结指数和防治效率等指标研究同温层芽孢杆菌对黄瓜根结线虫的影响，实验结果表明，nbl-b1n064处理组能明显抑制根结线虫病的发生，使用菌剂45d时，107cfu/g菌剂组防治效果为89.93％，其中106cfu/g菌剂组防治效果为75.96％，其中105cfu/g菌剂组防治效果为66.82％。使用生防菌剂60d时，107cfu/g菌剂组防治效果为83.59％，其中106cfu/g菌剂组防治效果为73.56％，其中105cfu/g菌剂组防治效果为65.05％，使该菌剂能够明显较少黄瓜根结数量，增加植物长势，其综合防治效果优于阿维菌素处理组。
[0147]
表7不同浓度下的生防菌菌悬液对根结线虫的盆栽试验
[0148][0149]
实施例7菌种田间应用
[0150]
一、试验材料
[0151]
1.8％阿维菌素乳油(济南中基作物科学有限公司)
[0152]
5％噻唑膦可溶液剂(山东省联合农药工业有限公司)
[0153]
处理组成分：活菌数为5
×
10
10
cfu/g的nbl-b1n064菌粉。
[0154]
二、试验方法
[0155]
(1)试验用大棚共分为对照组12间，菌剂组13间，试验产品在定植期、结荚期和盛果期各处理1次，各组除试验产品差异外，其他肥药及管理措施一致。对照组：阿维菌素1kg+噻唑膦1kg，稀释1000倍冲施，三次
[0156]
处理组：nbl-b1n064菌剂5l稀释500倍冲施，三次。
[0157]
(2)调查长势与病情情况
[0158]
1)长势情况：第一次处理后25天，调查植株株高和茎粗、叶长和叶宽等长势指标。
[0159]
2)根结线虫病情调查
[0160]
第三次处理后20天，调查发病率，寻找受害可疑病株，采用五点取样或随机取样法，每点调查十株，计算发病率。最后1次采摘后拔秧时，调查统计根结线虫发病率和根结指数：调查植株根结病情，单垄均从第4株开始调查，每垄连续调查10株，每组随机选取6垄，共调查300株。把整株从根部挖起，拍碎土块保留根系，统计病株数和各病级值，计算根结指数及防治效果。
[0161]
三、试验结果
[0162]
1、芸豆植株长势情况
[0163]
由表8可知，处理一次后，菌剂处理组的芸豆的株高、茎粗、叶长和叶宽等显著高于化学农药对照组，说明该菌株发酵液对芸豆苗期有着明显的促进生长的作用。
[0164]
表8处理1次后植株长势情况
[0165]
[0166]
2、芸豆发病率和根结指数
[0167]
表9芸豆发病率和根结指数
[0168][0169]
由表9可知，用菌剂处理三次后的和种植结束拔秧时的发病率虽然高于对照化学农药处理，但是两组的根结指数差异不大，是由于对照组的线虫根结较多且大(图2)，根结级别较高导致，说明菌株发酵液处理的植株相比对照组，能显著减少根结数量，降低病害程度和根结级别，植株的长势也强于处理组(图3)，综合种植结束的根结指数来看，菌株发酵液对根结线虫的防治效果水平与阿维菌素和噻唑膦的组合制剂一致。
[0170]
实施例8减少氮肥施用的应用试验
[0171]
一、试验材料
[0172]
尿素(济南圣丰茂有限公司)
[0173]
活菌数为5
×
10
10
cfu/g的nbl-b1n064菌粉。
[0174]
二、试验方法
[0175]
1、实验处理：试验地块共2.1亩，分3个处理，每个处理0.7亩(长63m*宽22.2m)，从路旁向里设计依次为t1(常规施尿素)、t2(常规施尿素+菌)、t3(80％常规施尿素+菌)，在基肥施用期、苗期、拔节期和孕穗期进行施用。除试验用肥处理外，其它管理措施和用药等按照当地常规管理方式进行。
[0176]
2、生长情况指标测定：每施肥组样品选取30棵，测定株高、茎粗、穗长、穗粗，行粒数，然后脱粒，带回脱粒后的玉米。测量获取样品百粒重以及实际亩产量。实测产量(kg/mu)＝[种植密度/10株]
×
[籽粒湿重(kg)
×
(1-含水量)/(1-14％)]三、试验结果
[0177]
不同施肥处理小区内玉米各项生长指标存在差异。实验组t1小区内玉米长势较好。株高最低、茎粗最大，能够有效的防止玉米倒伏。经过增施菌肥处理的t1、t2小区玉米穗的穗长、穗粗、行粒数、百粒重及亩产量均高于常规施肥处理的ck小区，由此表明，施用菌肥能够有效的促进玉米果实的生长，进而提高玉米产量。t2与ck处理相比较，玉米的生长指标呈优势，说明在增施菌肥的基础上减少20％化肥使用仍然可以提高玉米产量。
[0178]
表10
[0179]
[0180][0181]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一株同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，该菌株已于2023年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：中国
·
武汉
·
武汉大学，其生物保藏号为：cctcc m 2023517。2.如权利要求1所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，其特征在于，所述菌株的形态学特征如下：菌体特征：菌体杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性，具有圆形末端，单个排列，形成内生孢子，孢子为椭圆形，中生或亚端生；菌落特征：白色，形状不规则，表面褶皱、干燥、有光泽，不透明，边缘线平滑。3.如权利要求1所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，其特征在于，所述菌株的生理生化特征如下：能利用d-木糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇，能水解淀粉，可还原硝酸盐。4.如权利要求1所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，其特征在于，所述菌株适宜发酵培养方式如下：刮取斜面中的菌体接种于种子液培养基，30-37℃、150～200rpm振荡培养18-24h，获得液体发酵种子，将发酵种子接种于发酵罐中，发酵温度30-37℃，接种量5％，发酵罐搅拌速度140～180rpm，通气量1∶0.8vvm，发酵时间为24-36h。5.如权利要求4所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，其特征在于，所述种子液培养基的主要成分包括胰蛋白胨、酵母浸膏及氯化钠，质量比为1～3:1:1～3，ph7.0-7.5。6.如权利要求4所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064，其特征在于，发酵培养基的主要成分：玉米冻干粉、蛋白胨、玉米淀粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰、碳酸钙，其质量比为10～14：10～14：18～22：4～6：1：1：0.2：1，ph7.0-7.5。7.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1-6任一项所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064和/或菌的培养物。8.如权利要求7所述菌剂，其特征在于，所述菌株的使用形式包括活菌菌粉、菌的上清液或菌悬液；所述菌的培养物主要为菌的发酵物及接种该菌株的培养基，包括液体及固体形式，包括发酵液、发酵物的上清液，或其稀释液；或，所述菌剂剂型为液体剂、粉剂或颗粒剂，包括但不限于水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。9.权利要求1-6任一项所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064、权利要求7或8所述菌剂在防治作物根结线虫病方面的应用。10.一种防治作物根结线虫病的方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述同温层芽孢杆菌(bacillus stratosphericus)nbl-b1n064、权利要求7或8所述菌剂冲施需要防治的作物；所述作物包括但不限于黄瓜、芸豆、番茄、烟草、生姜。

技术总结
本发明涉及一株同温层芽孢杆菌及在防治作物根结线虫病方面的应用。本发明从黄瓜根际土壤中筛选得到该同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)NBL-B1N064，经测定，该菌株的发酵液具有良好的根结线虫防治效果，稀释后仍然能够发挥较高的杀虫活性，应用于防治农作物病害具有良好的应用前景。物病害具有良好的应用前景。物病害具有良好的应用前景。


技术研发人员：胡著然 王丽荣 樊梅娜 张国珍 陶宁 韩广泉 钱程 张文娟 申小冉 全双军
受保护的技术使用者：和田昆仑利来生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/7/12