利用裂解酶LysP53产生细菌外膜囊泡的方法及应用

利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物或酶技术领域，尤其涉及一种利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法及应用。


背景技术：

2.外膜囊泡(outer membrane vesicles，omvs)是由革兰氏阴性菌分泌的纳米尺寸的天然囊泡，含有来自细菌外膜的多种抗原蛋白，omvs还拥有丰富的病原体相关分子模式(pamps)，可强烈刺激先天免疫系统，促进抗原呈递和t细胞活化。omv作为细菌疫苗已经有成功的商业化例子，如从b型脑膜炎血清群中分离出的omv被证明对人类安全且具有免疫原性，针对脑膜炎奈瑟菌血清群b菌株的omvs疫苗已在挪威、古巴和新西兰等地获得许可，用于控制脑膜炎球菌性脑膜炎的流行。
3.此外，omv还可以作为疫苗载体。david j.chen等人建立了一种抗原通过与clya融合整合到omv的方法。clya(也称为shea或hlye)是一种蛋白质细菌溶血素，在大肠杆菌omv中特异性富集，与单独使用gfp免疫相比，通过将gfp与细菌溶血素clya基因融合而产生的展示绿色荧光蛋白(gfp)的工程omv在免疫后，能产生更强的抗gfp抗体应答。
4.此外，还开发了展示病原体糖原的糖基化omv。糖基化外膜囊泡可通过修饰在细菌表面广泛存在的多糖聚-n-乙酰基-d-葡萄糖胺(pnag)糖蛋白而来，免疫后能在小鼠体内诱导高滴度的pnag特异性igg抗体，保护免疫小鼠免受表达不同pnag细菌的致命攻击。
5.因此，omv在细菌疫苗和疫苗载体方面有很大的应用前景。但细菌自发分泌的omv通常含量很低，需要从大量培养上清液中富集。目前主要是使用洗涤剂或螯合剂来促进omvs的产生，虽然获得omvs产率提高，但可能会导致重要抗原的缺失以及增加omvs的毒性。除产量外，已证明通过不同方法获得的脑膜炎奈瑟菌血清群b菌株的外膜囊泡在形态、蛋白质组成、毒性、免疫原性甚至血清杀菌活性方面都存在差异。因此，需要探索新的方式来促进细菌omvs的产生并研究其组成变化和对免疫效果的影响。
6.裂解酶是噬菌体编码的肽聚糖水解酶，在噬菌体感染后期表达，主要作用是裂解宿主细菌壁，释放子代噬菌体。后来发现重组的裂解酶也能“自外向内”裂解细菌壁，表现出高效的杀菌活性，并且细菌很难产生耐受。裂解酶作为潜在的抗菌新型药物已经引起了人们的极大兴趣，目前已有多个裂解酶药物正在临床2或3期试验中。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法。
8.发明人发现裂解酶lysp53除了具有杀菌功能外，还可以刺激诱导革兰氏阴性菌如鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌等细菌外膜囊泡的产生，与自然产生的omvs相比，在产率提高的同时，omvs的内毒素含量也大大降低。发明人发现裂解酶lysp53在制备细菌外膜囊泡时，其一方面能与细菌外膜作用，嵌入进细菌外膜后，可诱导细菌omv的产生，另一方面，由于其具有裂解细菌壁肽聚糖的活性，其切割细菌壁，会导致细菌壁上局部穿孔，在渗
透压作用下，细菌内膜也可能从内向外凸出，进一步促进omvs的产生，并且该过程可能包裹更多的细菌壁成分，甚至部分细菌内容物。发明人还发现裂解酶lysp53刺激诱导产生的革兰氏阴性菌外膜囊泡在对小鼠进行免疫接种后产生的免疫保护作用比自然分泌产生的革兰氏阴性菌外膜囊泡更好。
9.所涉及的裂解酶lysp53的氨基酸序列详见中国专利申请202110760643.6。
10.本发明的技术方案：
11.利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
12.将细菌菌株接种到培养基上过夜培养；将过夜培养物在20～45℃下扩大培养16～18h；离心去除上清液，得到细菌沉淀；用裂解酶lysp53溶液重新悬浮细菌沉淀，在20～45℃下保存1～3h；离心去除沉淀，将上清液通过膜过滤后再进行超滤浓缩；用缓冲液离心洗涤，得到的沉淀为囊泡颗粒；用缓冲液将囊泡颗粒重新悬浮，膜过滤得到细菌外膜囊泡。
13.进一步的，所述细菌菌株为革兰氏阴性菌；进一步优选的，所述细菌菌株为鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌中的一种。
14.进一步的，所述培养基各自独立地为lb培养基、tsb培养基、bhi培养基、macconkey培养基、hektoen enteric培养基中任意一种；所述缓冲液各自独立地为pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液、mes缓冲液、hepes缓冲液中任意一种。
15.进一步的，所述裂解酶lysp53溶液的浓度为30-300μg/ml。具体制备方法为将纯化的lysp53溶解于tris-hcl溶液中。所述tris-hcl溶液的ph为6.0-8.0。
16.进一步的，所述离心去除上清液的离心力为10000
×
g；所述离心去除沉淀的离心力为10000
×
g；所述离心洗涤的离心力为20000
×
g。
17.一种细菌外膜囊泡，由上述方法制备而成。
18.本发明还提供了上述方法制备得到的细菌外膜囊泡在制备疫苗方面的应用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果：
20.本发明首次发现裂解酶lysp53可以刺激诱导革兰氏阴性菌如鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌外膜囊泡的产生。并且，通过裂解酶lysp53制备的外膜囊泡比自然形成的外膜囊泡具有更均一的形态、更高的产量、更低的细胞毒性、更好的免疫保护效果。
附图说明
21.图1为鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡的电镜图(a)与裂解酶lysp53诱导鲍曼不动杆菌whg40137产生的外膜囊泡的电镜图(b)。
22.图2大肠杆菌bl21自然产生的外膜囊泡的电镜图(a)与裂解酶lysp53诱导大肠杆菌bl21产生的外膜囊泡的电镜图(b)。
23.图3肠炎沙门氏菌atcc13076自然产生的外膜囊泡电镜图(a)与裂解酶lysp53诱导肠炎沙门氏菌atcc13076产生的外膜囊泡的电镜图(b)。
24.图4为鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡及裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡的sds-pade胶图(a)、大肠杆菌bl21自然产生的外膜囊泡及裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡的sds-pade胶图(b)、肠炎沙门氏菌atcc13076自然产生的外膜囊泡及裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡的sds-pade胶图(c)。
25.图5为鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡及裂解酶lysp53诱导产生的外
膜囊泡、大肠杆菌bl21自然产生的外膜囊泡及裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡、肠炎沙门氏菌atcc13076自然产生的外膜囊泡及裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡的产量比较。
26.图6为鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡和裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡对raw264.7细胞(a)和树突状细胞(b)的细胞活力影响。
27.图7为鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡和裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡对小鼠进行三次滴鼻免疫后产生的抗体滴度(a)或进行三次肌肉免疫后产生的抗体滴度(b)。
28.图8为经pbs、鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡和裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡进行滴鼻免疫后的小鼠肺炎模型血液中的细菌负荷(a)；经pbs、鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡和裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡进行肌肉免疫后的小鼠肺炎模型血液中的细菌负荷(b)；经pbs、鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡和裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡进行滴鼻免疫后的小鼠肺炎模型肺部的细菌负荷(c)；经pbs、鲍曼不动杆菌whg40137自然产生的外膜囊泡和裂解酶lysp53诱导产生的外膜囊泡进行肌肉免疫后的小鼠肺炎模型肺部的细菌负荷(d)。
具体实施方式
29.下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但是应该明确提出这些实施例用于举例说明，但是不解释为限制本发明的范围。
30.本发明实施例中部分原料的参数如下：
31.鲍曼不动杆菌，whg40137，中国科学院武汉病毒研究所16srdna序列鉴定结果为acinetobacter baumannii鲍曼不动杆菌；筛选分离来源：武汉大学中南医院病房地面采集的拭子。
32.大肠杆菌，bl21(de3)，市售。
33.肠炎沙门氏菌，atcc 13076，市售。
34.裂解酶lysp53溶液，溶剂为tris-hcl溶液，浓度为60μg/ml，ph＝7.4，自制。
35.对照例1
36.一种自然产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
37.将鲍曼不动杆菌whg40137菌株接种到lb培养基上在37℃下过夜培养；将10ml鲍曼不动杆菌菌株whg40137过夜培养物接种到1l lb培养基上，在37℃下以180rpm孵育16h，通过10000
×
g离心10min去除细菌细胞沉淀，将上清液通过0.22μm膜过滤，过滤后的溶液通过超滤浓缩并用pbs缓冲液洗涤，在4℃下以200000
×
g离心90min得到囊泡颗粒的沉淀；将囊泡颗粒的沉淀重新悬浮在ph＝7.4的pbs缓冲液中，经0.22μm膜过滤后得到自然产生的鲍曼不动杆菌外膜囊泡nomv；通过在琼脂平板上涂布以测试细菌生长，确定omv制剂中是否存在活菌。
38.对照例2
39.一种自然产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
40.将大肠杆菌bl21(de3)菌株接种到lb培养基上在37℃下过夜培养；将10ml大肠杆菌bl21(de3)过夜培养物接种到1l lb培养基接种上，在37℃下以180rpm孵育16h，通过10000
×
g离心10min去除细菌细胞沉淀，将上清液通过0.22μm膜过滤，过滤后的溶液通过超
滤浓缩并用pbs缓冲液洗涤，在4℃下以200000
×
g离心90min得到囊泡颗粒的沉淀；将囊泡颗粒的沉淀重新悬浮在ph＝7.4的pbs缓冲液中，经0.22μm膜过滤后得到自然产生的大肠杆菌外膜囊泡nomv；通过在琼脂平板上涂布以测试细菌生长，确定omv制剂中是否存在活菌。
41.对照例3
42.一种自然产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
43.将肠炎沙门氏菌atcc13076菌株接种到lb培养基上在37℃下过夜培养；将10ml肠炎沙门氏菌atcc13076过夜培养物接种到1llb培养基上，在37℃下以180rpm孵育16h，通过10000
×
g离心10min去除细菌细胞沉淀，将上清液通过0.22μm膜过滤，过滤后的溶液通过超滤浓缩并用pbs缓冲液洗涤，在4℃下以200000
×
g离心90min得到囊泡颗粒的沉淀；将囊泡颗粒的沉淀重新悬浮在ph＝7.4的pbs缓冲液中，经0.22μm膜过滤后得到自然产生的肠炎沙门氏菌外膜囊泡nomv；通过在琼脂平板上涂布以测试细菌生长，确定omv制剂中是否存在活菌。
44.实施例1
45.一种利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
46.将鲍曼不动杆菌菌株whg40137接种到lb培养基上在37℃下过夜培养；将10ml鲍曼不动杆菌菌株whg40137过夜培养物接种到1l lb培养基上，在37℃下以180rpm孵育16h；将鲍曼不动杆菌菌株whg40137培养物通过10000
×
g离心10min，去除上清液得到细菌沉淀，并使用60μg/ml 裂解酶lysp53溶液重新悬浮细菌沉淀；2h后，将悬浮液以10000
×
g离心10min去除沉淀，上清液通过0.22μm膜过滤，过滤后的溶液通过超滤浓缩，加入pbs缓冲液后在4℃下以200000
×
g离心90min进行洗涤，得到囊泡颗粒的沉淀；将囊泡颗粒的沉淀重新悬浮在ph＝7.4的pbs缓冲液中，经0.22μm膜过滤后得到裂解酶lysp53产生的鲍曼不动杆菌外膜囊泡lysin-omv(简称lomv)；通过在琼脂平板上涂布以测试细菌生长，确定lomv制剂中是否存在活菌。
47.实施例2
48.一种利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
49.将大肠杆菌bl21(de3)菌株接种到lb培养基上在37℃下过夜培养；将10ml大肠杆菌bl21(de3)过夜培养物接种到1l lb培养基上，并在37℃下以180rpm孵育16h；将大肠杆菌bl21(de3)培养物通过10000
×
g离心10min，去除上清液得到细菌沉淀，并使用60μg/ml裂解酶lysp53溶液重新悬浮细菌沉淀；2h后，将悬浮液以10000
×
g离心10min去除沉淀，上清液通过0.22μm膜过滤，过滤后的溶液通过超滤浓缩，加入pbs缓冲液后在4℃下以200000
×
g离心90min进行洗涤，得到囊泡颗粒的沉淀；将囊泡颗粒的沉淀重新悬浮在ph＝7.4的pbs缓冲液中，经0.22μm膜过滤后得到裂解酶lysp53产生的大肠杆菌外膜囊泡lysin-omv(简称lomv)；通过在琼脂平板上涂布以测试细菌生长，确定lomv制剂中是否存在活菌。
50.实施例3
51.一种利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：
52.将肠炎沙门氏菌atcc13076菌株接种到lb培养基上在37℃下过夜培养；将10ml肠炎沙门氏菌atcc13076过夜培养物接种到1llb培养基上，并在37℃下以180rpm孵育16h；将肠炎沙门氏菌atcc13076培养物通过10000
×
g离心10min，去除上清液得到细菌沉淀，并使用60μg/ml裂解酶lysp53重新悬浮细菌沉淀；2h后，将悬浮液以10000
×
g离心10min去除沉
淀，上清液通过0.22μm膜过滤，过滤后的溶液通过超滤浓缩，加入pbs缓冲液后在4℃下以200000
×
g离心90min进行洗涤，得到囊泡颗粒的沉淀；将囊泡颗粒的沉淀悬浮在ph＝7.4的pbs缓冲液中，经0.22μm膜过滤后得到裂解酶lysp53产生的肠炎沙门氏菌外膜囊泡lysin-omv(简称lomv)；通过在琼脂平板上涂布以测试细菌生长，确定lomv制剂中是否存在活菌。
53.测试例1
54.将对照例及实施例所制备的外膜囊泡进行形态比较，取20μl外膜囊泡样本置于封口膜上，用镊子轻轻夹住铜网边缘并插入样本液滴中，吸附5min。从液滴中夹出铜网将其移至20μl pta负染液中，负染2min，取出铜网轻轻放在滤纸上，待液体完全吸干后用透射电镜观察。透射电镜(120kv)下观察不同细菌外膜囊泡的形态，并拍照记录，具体形态图见附图1～3。
55.如图1所示，经过统计可知鲍曼不动杆菌nomv的平均直径为137.5nm，多分散指数为0.303，lomv的平均直径为246.7nm，多分散指数为0.089，多分散指数越小说明囊泡的大小更为均一，所以与nomv相比，lomv的囊泡直径更大，大小更为均一。如图2所示，经过统计可知，大肠杆菌nomv的平均直径为293.3nm，多分散指数为0.528，lomv的平均直径为85.3nm，多分散指数为0.305，所以与nomv相比，lomv的囊泡直径更小，大小更为均一。如图3所示，肠炎沙门氏菌的nomv平均直径相比lomv更大，而lomv的大小更为均一。
56.从图1～3可以看出，裂解酶lysp53可以刺激革兰氏阴性菌如鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌产生细菌外膜囊泡。从已有报道分析，多种因素会诱导细菌分泌omv，如对环境信号(温度、氨基酸营养限制、抗生素或噬菌体等)的应激反应，细胞壁成分生物合成的不平衡，或疏水分子嵌入革兰氏阴性菌的外膜等等。在本发明制备外膜囊泡的例子中，机理可能在于，裂解酶lysp53一方面能与细菌外膜作用，嵌入进革兰氏阴性菌外膜后，可诱导细菌omv的产生，另一方面，由于其具有裂解细菌壁肽聚糖的活性，其切割细菌壁，会导致细菌壁上局部穿孔，在渗透压作用下，细菌内膜也可能从内向外凸出，进一步促进omvs的产生，并且该过程可能包裹更多的细菌壁成分，甚至部分细菌内容物。
57.测试例2
58.对对照例及实施例中所制备的细菌外膜囊泡进行蛋白组成的比较，纯化的外膜囊泡在12％的sds-page蛋白胶，随后对凝胶进行染色和脱色。测试图见图4。
59.如图4所示，对于同一菌株中，外膜囊泡的蛋白组成受到不同制备方法的影响。对于鲍曼不动杆菌来说，两种omvs中都具有明显的20kda、27kda和37kda大小的蛋白，其它大小的蛋白则不太相同；在大肠杆菌的两种omvs中都含有35kda、45kda、60kda和100kda大小的蛋白；而沙门氏菌的两种omvs除了在37kda有一条大小形同的蛋白条带，其它大小的蛋白含量不同。
60.测试例3
61.对对照例及实施例中所制备的细菌外膜囊泡进行产量的比较，使用pierce bca蛋白质测定法对omv进行定量。将蛋白标准品bsa(2mg/ml)采用pbs缓冲液依次稀释为1000，500，250，125，62.5μg/ml的梯度标准蛋白。按50：1体积比混合bca中的试剂a和试剂b，配制测试数量+1次的体积。分别在透明96孔板内加入10μl的外膜囊泡和标准品，空白对照加入等体积的pbs缓冲液，再依次加入100μl的bca测试试剂，37℃孵育30min，测试od562nm的吸光度。根据od562nm的吸光度和bsa的浓度拟合标准曲线，利用标准曲线的方程式换算蛋白
浓度，测试结果见图5.
62.如图5所示，鲍曼不动杆菌的nomv产量为115.25μg/l，lomv产量显著更高为595.54μg/l；大肠杆菌的nomv产量为194.18μg/l，lomv产量为218.92μg/l，产量相当；肠炎沙门氏菌的nomv产量为285.03μg/l，lomv产量显著更高为321.64μg/l。在所测试的三种不同的菌株中，裂解酶制备的外膜囊泡产量都不低于自然产生的，其中鲍曼不动杆菌的lomv产量是nomv的5倍以上。
63.测试例4
64.测试对照例1及实施例1中所制备的细菌外膜囊泡对raw264.7细胞和树突状细胞的细胞活力影响，将raw264.7细胞和树突状细胞dc(≈
×
104个细胞/孔)分别接种在96孔板中，细胞分别暴露于不同浓度的nomv和lomv(0、5、10、15和20μg/ml)培养24h。在细胞培养液中直接加入1/10体积的cell counting kit-8，充分混合，注意避免气泡产生。于37℃培养箱中培养0.5-4h至颜色变为橙色，应避免过夜培养。用酶标仪测量在450nm处的吸光值，将每次处理后的细胞的相对活力归一化，并与缓冲液处理的对照孔的相对活力进行比较，测试结果见图6.
65.如图6所示，鲍曼不动杆菌的nomv在使用浓度为10μg/ml时就显示出对两种细胞的细胞毒性作用，而lomv测试到20μg/ml都没有表现出细胞毒性。
66.测试例5
67.测试对照例1及实施例1中所制备的细菌外膜囊泡三次滴鼻免疫或肌肉免疫产生的抗体滴度。选取健康小鼠60只。随机分为组，分别进行肌肉免疫和滴鼻免疫。肌肉免疫组又分为3组分别免疫imject alum+pbs，imject alum+nomv和imject alum+lomv，每隔2周肌肉免疫一次，每次10μg。滴鼻免疫组也分为3组分别免疫pbs，nomv和lomv，每隔2周滴鼻免疫一次，每次10μg。
68.收集三次免疫后的小鼠血清进行抗体滴度检测。具体测试方法为：用elisa包被液稀释外膜囊泡至5μg/ml，在96孔elisa板中每个孔加入100μl稀释好的外膜囊泡，对96孔板进行封口，于4℃冰箱过夜包被(16h)，取出包被好的孔板，倒出包被液，每孔加入300μlpbst缓冲液，室温静置孵育3min，倒掉，并拍干孔板内液体，重复5次，冲洗结束并确认孔中无液体时，每孔加入300μl的5％脱脂奶粉封闭液，于37℃封闭2h。
69.取出封闭好的孔板，按上述清洗方法，用pbst缓冲液清洗5次，拍干孔内液体将待测血清和空白血清用pbst缓冲液稀释100、1000、10000、100000、1000000、10000000倍，每孔加入100μl样品，pbst缓冲液为空白对照，空白血清为阴性对照，37℃孵育1h。取出孔板，弃孔内液体，按上述清洗方法用pbst缓冲液清洗5次，拍干，每孔加入100μl稀释好的hrp标记的二抗(1:5000)，37℃孵育1h。
70.孵育结束后取出孔板，弃孔内液体，按上步清洗方法用pbst缓冲液清洗5次并拍干，在暗室中每孔加100μl显色底物tmb，静置10min，再每孔加入100μl浓硫酸(2mol/l)来终止反应。在酶标仪上检测od450的数值，实验组的读数大于阴性对照2.1倍，即可判定为阳性，具体测试结果见图7.
71.如图7所示，滴鼻免疫的小鼠中，nomv的抗体滴度为105，而lomv的抗体滴度为104；肌肉免疫的小鼠中，nomv的抗体滴度为106，而lomv的抗体滴度为105。
72.测试例6
73.将测试例5中经过三次肌肉免疫以及三次滴鼻免疫的小鼠分别随机分成两组，共四组，用2
×
109cfu的鲍曼不动杆菌whg40137进行滴鼻感染，建立细菌性肺炎模型，感染剂量由lb琼脂平板上连续10倍稀释的cfu计数确认。在滴鼻感染细菌24h后测定小鼠肺部和血液中的细菌负荷，具体测试结果见图8。
74.如图8所示，无论是滴鼻免疫还是肌肉免疫方式，免疫nomv和lomv都能降低小鼠血液(105到103cfu)和肺部(108到105cfu)的菌载量，能够有效的控制鲍曼不动杆菌对小鼠的感染。虽然lomv免疫产生的抗体滴度比nomv低，但是在面对鲍曼不动杆菌攻击时，提供的保护效果是相当的。
75.综合而言，裂解酶lysp53可以刺激多种革兰氏阴性细菌产生细菌外膜囊泡，并且通过裂解酶制备的外膜囊泡比自然形成的外膜囊泡具有更均一的形态、更高的产量、更低的细胞毒性。在小鼠感染模型上，通过裂解酶制备的鲍曼不动杆菌lomv变现出了与鲍曼不动杆菌自然分泌的nomv相当的免疫保护效果。

技术特征：
1.利用裂解酶lysp53产生细菌外膜囊泡的方法，其特征在于，包括如下步骤：将细菌菌株接种到培养基上过夜培养；将过夜培养物在20～45℃下扩大培养16～18h；离心去除上清液，得到细菌沉淀；用裂解酶lysp53溶液重新悬浮细菌沉淀，在20～45℃下作用1～3h；离心去除沉淀，将上清液通过膜过滤后再进行超滤浓缩；用缓冲液离心洗涤，得到的沉淀为囊泡颗粒；用缓冲液将囊泡颗粒重新悬浮，膜过滤得到细菌外膜囊泡。2.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述细菌菌株为革兰氏阴性菌。3.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述细菌菌株为鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌中的一种。4.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述培养基各自独立地为lb培养基、tsb培养基、bhi培养基、macconkey培养基、hektoen enteric培养基中任意一种；所述缓冲液各自独立地为pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液、mes缓冲液、hepes缓冲液中任意一种。5.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述裂解酶lysp53溶液的浓度为30-300μg/ml。6.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述离心去除上清液的离心力为10000
×
g。7.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述离心去除沉淀的离心力为10000
×
g。8.如权利要求1所述细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于：所述离心洗涤的离心力为20000
×
g。9.一种细菌外膜囊泡，其特征在于：由权利要求1-8任一项所述方法制备而成。10.如权利要求9所述的细菌外膜囊泡在制备疫苗中的应用。

技术总结
本发明涉及微生物或酶技术领域，具体公开了一种利用裂解酶LysP53产生细菌外膜囊泡的方法及应用，所涉及的裂解酶LysP53的氨基酸序列详见专利202110760643.6。在本发明中，发明人发现裂解酶LysP53可以刺激诱导革兰氏阴性菌如鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌等细菌外膜囊泡的产生，并且通过裂解酶制备的外膜囊泡比自然形成的外膜囊泡具有更均一的形态、更高的产量、更低的细胞毒性、更好的免疫保护效果。果。果。


技术研发人员：权利要求书1页说明书7页附图4页
受保护的技术使用者：中国科学院武汉病毒研究所
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/12