一种鸡B亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb的制作方法

一种鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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及其应用
技术领域
1.本发明涉及家禽遗传抗性品种选育技术领域，具体涉及一种鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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及其应用。


背景技术：

2.鸡b亚群禽白血病是由b亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup b，alv-b)引起的一种鸡免疫抑制性肿瘤性传染病。alv-b可引起感染鸡群产生免疫抑制而极易继发禽流感、新城疫等其他病毒性疾病和大肠杆菌、沙门氏菌等细菌性疾病，引起感染种鸡、肉鸡发生特征性肿瘤而死亡，致使感染鸡群生产性能和肉、蛋品质下降，给世界家禽产业造成了巨大的经济损失。目前，禽白血病尚无商品化疫苗和有效的治疗方法，主要通过种群净化措施进行防控，但种群净化周期长(至少8-10年)、费用高(每只种鸡净化费用约500元)，且净化后阴性鸡群依然面临着再次感染alv的风险，很难维持禽白血病的防控成效，且会陷入病原-动物-检测人员持续的斗争。近年来已从地方鸡种、黄羽肉鸡、白羽肉鸡、蛋鸡等不同类型鸡中均分离出alv-b。可见，现有措施并不能完全控制b亚群禽白血病在中国的发生与流行，该病已成为威胁我国养鸡业(尤其是种鸡业)可持续健康发展的重大疾病之一。alv-b主要通过垂直传播，其感染可从曾祖代(纯系)
→
祖代
→
父母代
→
商品代逐代放大，每代感染率扩大约5％-20％，1只曾祖代(纯系)种鸡感染alv-b后可传染给24万只商品鸡，禽白血病已成为危害我国家禽种业安全最大的疾病。因此，开展控制禽白血病的技术创新，从宿主遗传抗性方面研究禽白血病的抗病育种已成为防控该病的有效策略。
3.alv-b由鸡tvb受体基因编码的细胞表面特异性tvb受体蛋白介导侵入宿主细胞，继而发生感染，决定宿主细胞对alv-b感染的易感性或抗性。tvb受体基因的遗传突变可能会导致tvb受体蛋白表达的完全缺失或表达一个不适宜作为alv-b受体的缺陷型tvb受体蛋白，从而引起宿主细胞对alv-b的感染产生遗传抗性。因此，鉴定b亚群禽白血病的遗传抗性分子标记，并应用于筛选b亚群禽白血病遗传抗性育种素材，以培育遗传抗b亚群禽白血病鸡品种(系)是实现b亚群禽白血病抗病育种的关键所在，从而保障我国家禽种业安全。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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及其应用，以解决现有技术中存在的不能完全控制b亚群禽白血病在我国鸡群发生与流行的问题。
5.本发明的第一个目的是提供一种鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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，该分子标记为tvb受体基因在第3215～3216位碱基之间插入cc碱基。
6.本发明的第二个目的是提供一种用于检测上述分子标记tvb
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的引物，该引物的核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2所示。
7.本发明的第三个目的是提供一种应用，即将上述分子标记tvb
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和/或上
述引物用于筛选/鉴定b亚群禽白血病遗传抗性鸡。
8.进一步，上述应用包括以下步骤：
9.提取待测样本基因组dna，扩增tvb受体基因片段，然后进行测序，若tvb受体基因序列第3215～3216位碱基位置存在cc纯合插入突变(tvb
inscc/inscc
)，则待测样本为b亚群禽白血病遗传抗性鸡，也就是说存在上述cc纯合突变，则具有对alv-b的感染产生遗传抗性的表型，即待测鸡基因型为tvb
inscc/inscc
，则该个体为b亚群禽白血病遗传抗性鸡；
10.若tvb受体基因序列第3215～3216位碱基位置没有发生cc纯合插入突变，则待测样本为b亚群禽白血病易感鸡，也就是说没有发生cc插入突变则为野生型，则对alv-b的感染易感(无抗性)，即如待测样本的基因型为野生型tvb
s1/s1
，则该个体为b亚群禽白血病易感鸡；
11.若tvb受体基因序列第3215～3216位碱基位置存在杂合插入突变(tvb
s1/inscc
)，则该个体为b亚群禽白血病易感鸡，但基因型均为tvb
s1/inscc
种公鸡、种母鸡配种后产生的下一代可以产生基因型为tvb
inscc/inscc
的个体，则该个体为b亚群禽白血病抗性鸡。
12.进一步，扩增时扩增体系包括：dna模板1μl，10
×
buffer 2.5μl，dntps 2μl，上下游检测引物1μl，kod-fx 0.5μl，最后用ddh2o补至25μl。
13.进一步地，扩增时扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃后延伸5min，最后4℃保存。
14.本发明的第四个目的是提供一种检测/筛选b亚群禽白血病遗传抗性鸡的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。
15.本发明的第五个目的是将上述试剂盒用于筛选培育遗传抗b亚群禽白血病鸡品种/品系的育种素材。
16.本发明具有以下有益效果：
17.本发明首次在我国鸡种中发现alv-b受体基因tvb dna序列(genbank登录号：nc_052553.1)第3215～3216位碱基存在cc插入突变(tvb
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)，进一步研究证实该tvb受体基因自然突变能够引起宿主鸡对alv-b的感染产生遗传抗性。因此，将该突变位点作为鉴定鸡b亚群禽白血病遗传抗性的分子标记是非常准确的。
18.本发明进一步建立了b亚群禽白血病遗传抗性标记tvb
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的分子诊断和基因分型方法，建立了一种鉴定b亚群禽白血病遗传抗性鸡的方法，能够快速、准确判定检测样本为b亚群禽白血病遗传抗性鸡还是易感鸡，可应用于在我国鸡种(包括地方鸡种和商业鸡品系)中筛选培育b亚群禽白血病遗传抗性鸡品种(品系)的育种素材，从而开展b亚群禽白血病遗传抗性鸡品种(品系)的选育，具有很好的应用价值和推广前景。
附图说明
19.图1为tvb受体基因5个片段的pcr扩增结果；其中，m为2000marker，nc为阴性对照；1-5分别表示tvb基因1、2、3、4、5基因片段的pcr扩增结果。
20.图2为tvb受体基因的结构示意图。
21.图3为tvb
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突变位点不同基因型序列测序图谱。
22.图4为tvb受体基因全长编码区序列的rt-pcr扩增结果；其中m为2000marker。
23.图5为tvb受体基因全长编码区序列的rt-pcr扩增产物测序分析结果。
24.图6为重组质粒pmcherry-c1-tvb
s1/s1
和pegfpc1-tvb
inscc/inscc
的酶切鉴定结果；其中，m为5000marker。
25.图7为重组质粒转染293ft细胞24h的荧光表达结果。
26.图8为融合蛋白在293-ft细胞的表达结果。
27.图9为rcasbp(b)-egfp重组表达质粒的构建示意图。
28.图10为rcasbp(b)-egfp重组表达质粒的酶切鉴定结果。
29.图11为rcasbp(b)-egfp病毒拯救结果。
30.图12为rcasbp(b)-egfp感染tvb
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突变位点不同基因型的过程。
具体实施方式
31.本发明首先分析了我国鸡种(包括20个地方鸡种和20黄羽肉鸡品系共2636份血液样品)tvb受体基因的遗传变异情况，发现我国鸡种中tvb受体基因dna序列(genbank登录号：nc_052553.1，具体见seq id no：19)第3215～3216位碱基位置存在cc插入突变，简称为tvb
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突变位点。
32.其次，从体外、体内实验两个层面证实了该tvb受体基因自然突变引起宿主抗alv-b的感染。具体原因在于tvb
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突变位于tvb受体基因第3外显子区域，该突变位于tvb基因编码序列cds(tvb基因mrna参考序列nm_204115.3，具体见seq id no：20)第195-196位碱基位置插入cc(tvb c.195_196inscc)。tvb c.195_196inscc突变造成其编码的tvb受体蛋白序列(tvb受体蛋白参考序列np_989446.2，具体见seq id no：21)从66位氨基酸残基开始移码，并在91位氨基酸残基发生提前终止编码，导致tvb受体蛋白半胱氨酸富集区域2(crd2)结构的改变(tvb受体蛋白的crd是介导alv-b感染并进入宿主细胞的关键结构域)，并表达一个截短的tvb
inscc
受体蛋白，从而引起宿主对alv-b的感染产生遗传抗性。
33.最后，基于b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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建立了b亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定方法，该方法能够快速、准确判定检测样本为alv-b抗性鸡还是易感鸡，可从我国鸡种(包括地方鸡种和商业肉鸡品系)筛选用于选育alv-b遗传抗性鸡品种的育种素材，为培育alv-b遗传抗性鸡品种(品系)提供技术支撑。
34.以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.实施例1：突变位点的发掘
36.1、引物设计
37.参考ncbi数据库中鸡tvb受体基因的dna序列(genbank登录号：nc_052553.1)，设计5对引物分5个片段pcr扩增tvb受体基因全长序列6596bp(1段、2段、3段、4段和5段)，引物序列、位置及pcr扩增片段大小如表1所示。
38.表1tvb受体基因全长序列pcr扩增引物信息
[0039][0040][0041]
2、tvb受体基因的pcr扩增
[0042]
参考天根血液dna提取试剂盒说明书，提取我国不同鸡种(包括20个我国不同地方鸡种和20个黄羽肉鸡品系)共2636份血液样品的基因组dna，用该5对引物pcr扩增tvb受体基因全长序列。
[0043]
pcr反应体系组成：dna模板1μl，10
×
buffer 2.5μl，dntps 2μl，上下游引物各1μl，kod-fx 0.5μl，ddh2o补至25μl。
[0044]
pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火(1段62℃，2、3段58℃，4、5段60℃，)退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1。
[0045]
由图1可知，经pcr扩增后可扩增出1079bp、1254bp、1530bp、1239bp和1451bp 5个片段，条带大小与目的片段大小相符。
[0046]
3、tvb受体基因pcr扩增产物的测序分析
[0047]
将tvb受体基因的pcr扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并进行测序，应用dnastar和mutation surveyor基因序列分析软件进行序列比对、分析我国鸡种tvb受体基因的遗传变异，筛选alv-b候选遗传抗性位点。
[0048]
通过分析20个地方鸡种和20黄羽肉鸡品系(共2636份血液样品)tvb受体基因的遗传变异，筛选并发现了我国鸡种tvb受体基因外显子3第3215-3216位碱基位置存在插入cc 2个碱基(tvb
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)的自然突变(见图2)。突变位点不同基因型序列测序图谱如图3所示，序列由上至下依次是参考序列(野生型tvb
s1/s1
个体)、杂合突变型tvb
s1/inscc
个体和纯合突变型tvb
inscc/inscc
个体的序列，红线标注为tvb基因序列第3215-3216位碱基位置的cc插入突变。
[0049]
实施例2：tvb受体基因编码区序列分析
[0050]
1、rna的抽提与反转录反应
[0051]
采集tvb
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突变位点野生型tvb
s1/s1
和纯合突变型tvb
inscc/inscc
种鸡200μl血液于800μl trizol中(rnase free ep管)振荡混匀，充分裂解，室温静置5min后，加入300μl的氯仿，振荡混匀后，4℃，12,000
×
g离心15min，吸取上层无色透明上清液至新的ep管，加入等体积异丙醇溶液沉淀rna，静置10min；4℃，12,000
×
g离心30min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，室温静置，待乙醇全部挥发后，加入50μldepc水溶解rna。以抽取
的tvb
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突变位点野生型tvb
s1/s1
和纯合突变型tvb
inscc/inscc
种鸡血液rna为模板，根据反转录试剂盒(takara)说明书反转录成cdna。反转录成的cdna于-20℃保存备用。
[0052]
2、tvb受体基因全长编码区序列的rt-pcr扩增
[0053]
(1)引物设计
[0054]
参考ncbi已发表tvb受体基因mrna序列(nm_204115.3)，设计扩增tvb整个编码区序列(cds)的引物，引物序列及rt-pcr扩增片段大小如表2所示。
[0055]
表2tvb受体基因全长编码区序列的rt-pcr扩增引物信息
[0056][0057]
(2)rt-pcr扩增
[0058]
以tvb
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突变位点野生型tvb
s1/s1
和纯合突变型tvb
inscc/inscc
种鸡血样的cdna为模板，参照toyobo公司高保真酶kod-fx的说明书进行rt-pcr扩增。
[0059]
rt-pcr反应体系组成：cdna模板1μl，10
×
buffer 2.5μl，dntps 2μl，上下游引物各1μl，kod-fx 0.5μl，ddh2o补至25μl。
[0060]
rt-pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸75s，35个循环；72℃后延伸10min，4℃保存。反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0061]
野生型tvb
s1/s1
、纯合突变基因型tvb
inscc/inscc
鸡血样的tvb受体基因全长编码区序列的rt-pcr扩增结果见图4。由图4可知，扩增出的条带大小与目的片段大小相符。
[0062]
3、rt-pcr产物的克隆测序分析
[0063]
参考axygen公司的胶回收纯化试剂盒说明书步骤进行rt-pcr产物的回收、纯化。参考pmd19-t vector(takara公司)说明书，将rt-pcr纯化产物连接入pmd19-t载体。参考感受态细胞dh5α说明书，将连接产物转化dh5α感受态细胞。筛选阳性菌落，并进行pcr鉴定，经pcr鉴定为阳性的菌液，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。应用lasergene 7.0软件比对分析tvb
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突变位点野生型和纯合突变型tvb基因全长编码区序列的测序结果，具体见图5。
[0064]
图5中给出了cc二核苷酸出入位置和改变的氨基酸序列，同时还给出了tvb
s1
和tvb
inscc
受体蛋白的示意图。tvb
s1
蛋白的编号包括信号肽(sp)、富含半胱氨酸的结构域(crd1到-3)、跨膜结构域(msd)和细胞质死亡结构域。在tvb
inscc
中移码突变的位置用星号突出显示，而在tvb
inscc
中提前终止密码子tga用三角号表示。此外还比较了已知tvb受体crd的推导氨基酸序列。推测tvb
s1 crds中的二硫键，tvb
inscc
中推测的半胱氨酸取代被圈了出来，tvb
inscc
移码肽的氨基酸残基以粗体显示。由图5可知，tvb
inscc/inscc
的cdna第195-196位碱基位置插入cc(tvb c.195_196inscc)。tvb
inscc/inscc cdna序列的cc碱基插入，造成其编码的tvb
inscc
受体蛋白序列从66位氨基酸残基开始移码，并在91位氨基酸残基发生提前终止编码。由此，预测tvb
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突变引起的移码突变造成tvb受体蛋白半胱氨酸富集区域2(crd2)的半胱氨酸被其他氨基酸残基取代，导致crd2的二硫键断裂，从而改变tvb
inscc
受体蛋白的结构。
[0065]
实施例3：突变影响蛋白表达
[0066]
1、pmcherry-c1-tvb
s1/s1
、pmcherry-c1-tvb
inscc/inscc
重组表达质粒的构建
[0067]
(1)tvb受体基因突变位点全长cds片段的rt-pcr扩增
[0068]
根据tvb受体基因全长编码区序列的rt-pcr扩增引物，分别加入xhoi和hindiii酶切位点(下划线序列)和保护碱基(如表3)，参照实施例2方法rt-pcr扩增tvb
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突变位点野生型tvb
s1/s1
和纯合突变型tvb
inscc/inscc tvb基因全长编码区序列。
[0069]
表3tvb受体基因全长cds的rt-pcr扩增引物
[0070][0071]
(2)pcr产物的纯化与连接
[0072]
参考axygen公司的胶回收纯化试剂盒说明书，回收纯化rt-pcr扩增产物，并连接到pmd19-t载体。
[0073]
(3)连接产物转化感受态细胞
[0074]
参考感受态细胞dh5α说明书，将连接产物转化入dh5α感受态细胞。
[0075]
(4)双酶切反应
[0076]
将含tvb
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突变位点野生型tvb
s1/s1
和纯合突变型tvb
inscc/inscc tvb基因全长编码区序列片段的pmd19-t与pmcherry-c1质粒分别进行xhoi/hindiii双酶切。
[0077]
(5)酶切产物的纯化与连接
[0078]
目的片段与pmcherry-c1载体按照axygen公司的胶回收纯化试剂盒说明书回收纯化后，将目的片段与pmcherry-c1载体以3:1比例混匀，离心，置于16℃连接过夜。
[0079]
(6)阳性菌落的筛选和鉴定
[0080]
从培养的平板上挑取单个白色菌落，接种于500μl kana lb液体培养基中，37℃振荡培养约5h后，直接以菌液为模板进行pcr鉴定并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0081]
(7)pmcherry-c1-tvb重组质粒的酶切鉴定
[0082]
参照质粒小量提取试剂盒(艾德莱)说明书，抽提阳性菌液的重组质粒。将pmcherry-c1-tvb重组质粒用内切酶xhoi和hindiii进行双酶切鉴定，同时将重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。
[0083]
由图6可知，成功构建了重组质粒，将构建好的重组质粒分别命名为pmcherry-c1-tvb
s1/s1
和pegfpc1-tvb
inscc/inscc
。
[0084]
2、pmcherry-c1-tvb重组表达质粒的western blotting检测
[0085]
参照lipofectamine 3000reagent说明书，利用lipofectamine 3000转染试剂将pmcherry-c1对照质粒和pmcherry-c1-tvb
s1/s1
、pegfpc1-tvb
inscc/inscc
分别转染到预先准备好的长至70～80％满单层的293-ft细胞(6孔板)，24h后观察红色荧光，结果见图7。由图7可知，在倒置荧光显微镜下检测到转染pmcherry-c1、pmcherry-c1-tvb
s1/s1
、pmcherry-c1-tvb
inscc/inscc
重组质粒的293-ft细胞发出红色荧光，结果表明mcherry-tvb融合蛋白在293-ft细胞中表达。
[0086]
转染48h后，收集293ft细胞上清进行western blotting检测，结果见图8。由图8可知，空白对照质粒pmcherry-c1在293-ft细胞表达约为27kd的蛋白，pmcherry-c1-tvb
s1/s1
在
293-ft细胞表达约为70kd的mcherry-tvb
s1
融合蛋白，而pmcherry-c1-tvb
inscc/inscc
重组质粒在293-ft细胞表达约为37kd大小的mcherry-tvb
inscc
融合蛋白，结果表明tvb
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突变导致tvb受体基因表达一个截短的tvb
inscc
受体蛋白。
[0087]
实施例4：突变致使宿主抗alv-b感染的鉴定
[0088]
1、体外细胞感染验证
[0089]
(1)构建rcasbp(b)-egfp重组表达质粒，将其转染至df-1细胞中，转染后7天，拯救并收集df-1细胞上清液的rcasbp(b)-egfp病毒(即携带egfp荧光蛋白alv-b报告病毒)，测定病毒感染单位(iu)后，分装保存于-80℃。
[0090]
上述rcasbp(b)-egfp重组表达质粒的构建示意图见图9；rcasbp(b)-egfp重组表达质粒的酶切鉴定结果见图10；rcasbp(b)-egfp病毒拯救结果见图11。
[0091]
(2)利用alv-b荧光报告病毒rcasbp(b)-egfp分别感染tvb
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突变位点野生型tvb
s1/s1
、杂合突变型tvb
s1/inscc
和纯合突变型tvb
inscc/inscc cef(鸡成纤维上皮细胞cef利用实施例1中检测的种鸡配种后孵化的9日龄鸡胚制备)，感染后1、2、3、7天，利用流式细胞仪检测rcasbp(b)-egfp病毒感染tvb
3215-3216inscc
突变位点不同基因型cef的情况，gpf阳性细胞率(％)表示病毒的感染率，具体结果见图12。
[0092]
由图12可知，野生型tvb
s1/s1 cefs对alv-b易感，将其作为阳性对照。rcasbp(b)-egfp可高效感染tvb
s1/s1 cefs，第1天的感染率约为20％，到第7天几乎所有细胞感染(图12a)。而rcasbp(b)-egfp对tvb
inscc/inscc cefs的感染效率低，第1天感染的细胞约为2％，且传播缓慢，在第3天约8％的细胞感染，在第7天达到16％(图12a)。与tvb
inscc/inscc
cefs相比，tvb
s1/inscc cefs对rcasbp(b)-egfp的感染更加敏感，表现出与野生型相似的感染特性(图12a)。gfp阴性和gfp阳性细胞明显不同，在facs直方图中有两个独立的峰(图12b)。上述结果表明tvb
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突变致宿主细胞体外抗rcasbp(b)-egfp的感染。
[0093]
2、体内攻毒试验验证
[0094]
(1)将tvb
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突变位点野生型、杂合突变型和纯合突变型的1日龄小鸡随机分组，每组25只，饲养于隔离器。1日龄时，每只小鸡腹腔接种alv-b sdau09c2株病毒液(s/p值＝2.2)0.3ml，5日龄时，再次攻毒一次。攻毒后2周，采集每只雏鸡抗凝血样，抽取基因组dna，通过直接测序方法对每只雏鸡tvb
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突变位点进行基因分型。攻毒后1个月，采集小鸡的血样，利用trizol试剂盒抽提血样总rna，利用alv-b sdau09c2株特异性检测引物，rt-pcr检测每只雏鸡的病毒血症情况，确定tvb
3215-3216inscc
突变不同基因型雏鸡对alv-b sdau09c2株的感染状况。
[0095]
设计alv-b-env的rt-pcr扩增上游引物和下游引物：
[0096]
env-f：5
’‑
gcaggcatttctgactgggc-3’(seq id no：17)；
[0097]
env-r：5
’‑
agaccttccgataggtgagg-3’(seq id no：18)。
[0098]
(2)rt-pcr扩增alv-b的env基因编码序列，rt-pcr扩增片段长度为435bp。利用one step rt-pcr kit ver.2试剂盒进行rt-pcr扩增，pcr反应程序：50℃反转录30min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃后延伸10min。pcr产物在2％琼脂糖凝胶电泳检测，如观察到435bp的目的条带，则该样品发生病毒血症(alv-b阳性)，如无目的条带的扩增，则该样品没有发生病毒血症(alv-b阴性)，其结果见表4。
[0099]
表4alv-b感染tvb
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突变位点不同基因型小鸡后病毒血症阳性情况
[0100][0101]
如表4所示，在接种alv-b sdau09c2株病毒液的22只野生型tvb
s1/s1
雏鸡中，均为alv-b阳性。然而，24只tvb
inscc/inscc
基因型雏鸡接种alv-b sdau09c2株病毒液后，alv-b阳性率下降到12.5％(表4)，而29只tvb
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基因型雏鸡接种alv-b sdau09c2株病毒液后alv-b阳性率为93.1％。攻毒试验结果表明，体内感染与病毒在体外的感染结果是一致的，证实了tvb
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突变致宿主抗alv-b的感染，tvb
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自然突变为宿主鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记。
[0102]
实施例5：b亚群禽白血病遗传抗性鸡鉴定标准的建立与应用
[0103]
1、b亚群禽白血病遗传抗性鸡鉴定标准的建立
[0104]
(1)引物设计
[0105]
参考tvb受体基因dna序列(genbank登录号：nc_052553.1)，设计pcr引物(正向引物f：5
’‑
gcacaatcagctcttgctgc-3’(seq id no：1)；反向引物r：5
’‑
gcagcctgcaagcaccgcca-3’(seq id no：2))扩增包含tvb
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突变位点的tvb受体基因基因组区域。
[0106]
(2)tvb
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突变位点的tvb受体基因基因组区域的pcr扩增
[0107]
pcr反应体系组成：dna模板1μl，10
×
buffer 2.5μl，dntps 2μl，上下游检测引物(其核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2所示)1μl，kod-fx 0.5μl，ddh2o补至25μl。
[0108]
pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃后延伸5min，最后4℃保存。
[0109]
(3)pcr扩增产物的测序
[0110]
pcr扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并进行测序，根据测序结果对tvb
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突变位点进行基因分型。
[0111]
根据tvb
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突变位点基因型建立b亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准，判定标准如表5。
[0112]
表5b亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准
[0113][0114]
若tvb
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抗性位点基因型为野生型tvb
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，则对alv-b感染的无抗性(易感)，该个体为b亚群禽白血病易感鸡；
[0115]
若tvb
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抗性位点基因型为tvb
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，则对alv-b的感染易感，但该个体携带b亚群禽白血病遗传抗性隐性基因；
[0116]
若tvb
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抗性位点基因型为tvb
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，则对alv-b的感染产生遗传抗性，该个体为b亚群禽白血病抗性鸡。
[0117]
2、b亚群禽白血病遗传抗性鸡鉴定标准的应用
[0118]
(1)全基因组dna抽提
[0119]
按照天根血液基因组提取试剂盒说明书，抽提20个我国地方鸡种和20个黄羽肉鸡品系共计2636份抗凝血液的dna，并保存在-20℃备用。
[0120]
(2)pcr扩增与测序
[0121]
pcr扩增引物及扩增程序如实施例5、1所述，对我国不同鸡种tvb
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突变位点的tvb基因基因组区域进行pcr扩增，pcr扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0122]
(3)tvb
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抗性位点基因分型
[0123]
利用chromas软件分析测序结果的测序峰图，分析测序样品tvb
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抗性位点的基因型。
[0124]
我国地方鸡种和黄羽肉鸡品系tvb
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抗性位点的基因分型结果如表6和表7所示，清远麻鸡、沙栏鸡、崇仁麻鸡、河田鸡、文昌鸡等地方鸡种存在tvb
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抗性位点的抗性基因型tvb
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，其频率分别为0.15、0.17、0.06、0.10和0.15，黄羽肉鸡品系3、黄羽肉鸡品系7、黄羽肉鸡品系11和黄羽肉鸡品系20也存在tvb
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抗性位点的抗性基因型tvb
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，其频率分别为0.07、0.20、0.13和0.17，表明这些地方鸡种和我国自主培育的黄羽肉鸡品系具有良好的抗alv-b遗传改良潜力，可从这些鸡种中筛选出抗alv-b感染的育种素材，并运用于培育遗传抗alv-b感染的鸡品种(品系)，以防控b亚群禽白血病。
[0125]
表6我国地方鸡种tvb
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遗传抗性位点的基因型频率分布
[0126][0127]
表7我国黄羽肉鸡品系tvb
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遗传抗性位点的等位基因频率分布
[0128][0129][0130]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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，其特征在于，该分子标记为tvb受体基因在第3215～3216位碱基之间插入cc碱基。2.用于检测权利要求1所述的鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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的引物，其特征在于，该引物的核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2所示。3.权利要求1所述的鸡b亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb
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和/或权利要求2所述的引物在筛选/鉴定b亚群禽白血病遗传抗性鸡中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本基因组dna，扩增tvb受体基因片段，然后进行测序，若tvb受体基因序列第3215～3216位碱基位置存在cc纯合插入突变，则待测样本为b亚群禽白血病遗传抗性鸡；若tvb受体基因序列第3215～3216位碱基位置存在杂合插入突变tvb
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，则待测样本为携带b亚群禽白血病遗传抗性隐性基因；若tvb受体基因序列第3215～3216位碱基位置没有发生插入突变，则待测样本为b亚群禽白血病易感鸡。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增时扩增体系包括：dna模板1μl，10
×
buffer 2.5μl，dntps 2μl，上下游检测引物1μl，kod-fx 0.5μl，最后用ddh2o补至25μl。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增时扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃后延伸5min，最后4℃保存。7.一种检测/筛选b亚群禽白血病遗传抗性鸡的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求2所述引物。8.权利要求7所述的试剂盒在筛选培育遗传抗b亚群禽白血病鸡品种/品系育种素材中的应用。9.权利要求1所述的分子标记和/或权利要求2所述的引物在筛选培育遗传抗b亚群禽白血病鸡品种/品系育种素材中的应用。

技术总结
本发明公开了一种鸡B亚群禽白血病遗传抗性分子标记tvb


技术研发人员：谢青梅 陈伟国 李文雪 陈胜 徐慧娟
受保护的技术使用者：岭南现代农业科学与技术广东省实验室河源分中心
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/12