一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物检测方法，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用。


背景技术：

2.鸭疫里默氏杆菌(riemerella anatipestifer)是鸭疫里默氏杆菌感染的病原。鸭疫里默氏杆菌感染是一种高致病性、接触性的细菌性疾病，本病发生呈急性或慢性败血性过程，以心包炎、肝周炎、气囊炎、脑炎和关节炎以及干酪性输卵管炎为特征。自然条件下鸭最易感，各品种鸭均能感染发病。该病一年四季均可发生，没有明显的季节性。感染鸭群中的致病率可达90％，死亡率可达5％-80％。目前该病流行于全国各养鸭地区，给养鸭业造成了重大的经济损失。根据临床发病情况、剖检病变等鉴定鸭疫里默氏杆菌感染存在不足，不易与其他发病类似的疾病相区别，只能做出初步诊断，不利于及时诊断病因及控制病情。为了快速、准确、简便的诊断该病，必须进行实验室检测。


技术实现要素：

3.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用。
4.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
5.本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：
6.上游引物：5’tagcatctcttggattcccttc 3’，
7.下游引物：5’ccagtttttaaccaccattaccc 3’。
8.本发明提供一种上述特异性引物在鸭疫里默氏杆菌快速检测中的应用。
9.本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，所述试剂盒含有上述特异性引物。
10.作为本发明的进一步优化方案，所述试剂盒还含有鸭疫里默氏杆菌dna提取试剂盒、扩增反应试剂、阳性对照物。
11.本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的方法，包括如下步骤：
12.(1)提取待测样品基因组总dna；
13.(2)利用上述特异性引物，以所述总dna作为pcr模板，进行pcr扩增；
14.(3)对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。
15.作为本发明的进一步优化方案，所述pcr扩增的反应体系为taqdna聚合酶：0.5μl，10
×
pcrbuffer：5.0μl，2.5mmdntps：4.0μl，上游引物f：1.0μl，下游引物r：1.0μl，模板：4.0μl，加水补至50μl。
16.作为本发明的进一步优化方案，所述pcr扩增的反应程序为95.0℃，2min；94.0℃，30s；57℃，30s；72.0℃，40s；35次循环；72.0℃延伸10min。
17.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
18.作为本发明的进一步优化方案，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，若检测到338bp单一扩增条带即表明待测样品是鸭疫里默氏杆菌，即为阳性样品，若未出现相应的338bp单一扩增条带，则说明不是鸭疫里默氏杆菌。
19.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)具体为：无菌挑取病鸭的肝脏、脑组织或心血划线接种于含10％牛血清的胰酪大豆胨液体培养基中，37℃摇床振荡培养12-16h，获得待测样品基因组总dna。
20.本发明的有益效果在于：提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用，通过这种实验室检测方法可快速、准确诊断鸭疫里默氏杆菌感染，即能在鸭疫里默氏杆菌感染病害显症前进行检测，又可对病害的发生进行早期预警，防治病害的扩散蔓延。对于该病的诊断、预警和防治具有重要意义。
附图说明
21.图1为鸭疫里默氏杆菌在培养基上的生长形态；
22.图2为镜检下的鸭疫里默氏杆菌形态；
23.图3为实施例中4种不同引物扩增的产物电泳结果(m：dl2000dna marker；1：引物1扩增产物；2：引物2扩增产物；3：引物3扩增产物；4：引物4扩增产物)；
24.图4为大肠杆菌、沙门氏菌菌株和鸭疫里默氏杆菌3种菌株pcr产物电泳结果(m：dl2000dnamarker；1：鸭疫里默氏杆菌菌株样品；2：大肠杆菌菌株样品；3：沙门氏菌菌株样品；4：阴性对照)。
具体实施方式
25.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
26.1、材料
27.本发明所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。
28.2、方法
29.2.1细菌的分离培养
30.无菌挑取病鸭的肝脏、脑组织或心血划线接种于含10％牛血清的营养琼脂和麦康凯琼脂上，置于37℃厌氧烛缸培养24-48h。如图1所示，鸭疫里默氏杆菌在血清营养琼脂上生长出的菌落呈光滑、透明、露珠状，直径1mm-2mm，斜射对光观察时可见浅蓝色荧光。在麦康凯琼脂上没有菌落生长。
31.2.2细菌的镜检
32.在载玻片上滴加1滴灭菌生理盐水，无菌挑取培养出的疑似单菌落均匀涂于载玻片上的生理盐水中，并采用火焰固定。固定的样品进行革兰氏染色，如图2所示，镜检时鸭疫里默氏杆菌为革兰氏阴性小杆菌，单个或成双排列，细菌变化较大，长1-5um，宽0.2-0.4um。
33.2.3细菌的pcr检测
34.根据genbank中发表的鸭疫里默氏杆菌基因序列(登录号：cp011859.1)，通过primer 5软件分别设计了4对引物，具体序列如表1所示。
35.参考试剂盒(北京全式金生物公司)说明书提取鸭疫里默氏杆菌dna，用设计合成的引物进行pcr扩增，反应体系为taqdna聚合酶：0.5μl，10
×
pcrbuffer：5.0μl，2.5mmdntps：4.0μl，上游引物f：1.0μl，下游引物r：1.0μl，模板：4.0μl，加水补至50μl，反应程序为95.0℃，2min；94.0℃，30s；57℃，30s；72.0℃，40s；35次循环；72.0℃延伸10min，产物经1％琼脂糖凝胶电泳后观察。如图3所示，结果显示使用引物4扩增出的条带单一，没有拖尾情况，为最佳引物。
36.表1本实施例中所用引物及其pcr扩增后产物长度
[0037][0038]
在相同的条件下，提取大肠杆菌、沙门氏菌菌株的dna，用引物4进行扩增、电泳观察。如图4所示，鸭疫里默氏杆菌能出现338bp的单一扩增条带，大肠杆菌、沙门氏菌不能出现扩增条带，说明使用的引物特异性良好。
[0039]
因此得出一种鸭疫里默氏杆菌的实验室检测方法：无菌挑取上述培养出的单菌落接种于含10％牛血清的胰酪大豆胨液体培养基中，37℃摇床振荡培养12-16h。将培养的菌液提取细菌dna，用引物4进行扩增、电泳。在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果出现相应的338bp单一扩增条带，则说明细菌为鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的338bp单一扩增条带，则说明不是鸭疫里默氏杆菌。
[0040]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5’tagcatctcttggattcccttc3’，下游引物：5’ccagtttttaaccaccattaccc3’。2.一种如权利要求1所述的特异性引物在鸭疫里默氏杆菌快速检测中的应用。3.一种鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有鸭疫里默氏杆菌dna提取试剂盒、扩增反应试剂、阳性对照物。5.一种鸭疫里默氏杆菌检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测样品基因组总dna；(2)利用权利要求1中所述的特异性引物，以所述总dna作为pcr模板，进行pcr扩增；(3)对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为taqdna聚合酶：0.5μl，10
×
pcrbuffer：5.0μl，2.5mmdntps：4.0μl，上游引物f：1.0μl，下游引物r：1.0μl，模板：4.0μl，加水补至50μl。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序为95.0℃，2min；94.0℃，30s；57℃，30s；72.0℃，40s；35次循环；72.0℃延伸10min。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，若检测到338bp单一扩增条带即表明待测样品是鸭疫里默氏杆菌，即为阳性样品，若未出现相应的338bp单一扩增条带，则说明不是鸭疫里默氏杆菌。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：无菌挑取病鸭的肝脏、脑组织或心血划线接种于含10％牛血清的胰酪大豆胨液体培养基中，37℃摇床振荡培养12-16h，获得待测样品基因组总dna。

技术总结
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用，属于生物工程技术领域，涉及微生物检测方法，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5’TAGCATCTCTTGGATTCCCTTC3’，下游引物：5’CCAGTTTTTAACC ACCATTACCC3’；本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用，通过这种实验室检测方法可快速、准确诊断鸭疫里默氏杆菌感染，即能在鸭疫里默氏杆菌感染病害显症前进行检测，又可对病害的发生进行早期预警，防治病害的扩散蔓延。对于该病的诊断、预警和防治具有重要意义。预警和防治具有重要意义。预警和防治具有重要意义。


技术研发人员：郝东敏 陈丽颖 魏战勇 程冰花 陈家勤 刘洪
受保护的技术使用者：安徽强英食品集团有限公司 宿州市动物疫病预防与控制中心（宿州市畜牧兽医技术推广中心）
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/12