一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料及其制备方法

1.本发明涉及角膜修复材料技术领域，特别涉及一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料及其制备方法。


背景技术：

2.角膜疾病是导致失明的主要原因，目前角膜移植术是唯一被广泛接受的治疗方法。然而全世界只有不到5％的患者可以进行移植，角膜供体的短缺、排斥反应引起的炎症及感染都是角膜移植面临的重要挑战，因此用于角膜再生的生物材料成为研究热点。
3.适宜的角膜替代修复材料应具有与健康人角膜相似的性能，包括含水率、透光性和渗透性，以满足角膜的透明性及营养的供给。用于角膜移植的角膜修复材料还要有一定的力学强度，能够抵抗手术操作时缝线的拉扯。材料植入体内后需要稳定存在且不会产生免疫排斥反应，必须无毒，故还需要具有良好的生物相容性。术后免疫排斥反应引起的长期炎症现象是角膜移植后常见的并发症之一，炎症是角膜伤口愈合的基本过程，但长期处于炎症微环境也会带来不利的影响，因此修复材料具有抗炎功能能够有效减轻术后长期炎症现象，保证材料的修复效果。目前的几种可行替代方案主要包括脱细胞角膜基质、羊膜、丙烯酸酯人工角膜和胶原基角膜等，以替代供体角膜或促进天然角膜的再生。但这些材料也存在一定的局限性，如免疫原性、透明度差、易诱发并发症以及机械强度差等问题。理想的角膜修复材料要在理化性能上满足要求，在实际修复中达到良好的上皮修复效果，还要不易发生术后炎症以保障修复效果，如何制备得到一种既能满足所需力学强度耐手术缝合、又具有良好的生物相容性且能有效减轻术后炎症的角膜修复材料，成为了本领域内仍亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，制备得到的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料在满足角膜再生修复材料所需力学性能、含水率、透光率等要求的前提下，能够调控巨噬细胞的极化，从而达到调控炎症的作用。
5.本发明的另一目的在于提供上述胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法制备得到的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将生物活性玻璃与卵磷脂在20～25℃条件下共混研磨，然后真空干燥，得到改性的生物活性玻璃；所述生物活性玻璃与卵磷脂的质量比为22～28：1；
9.(2)将步骤(1)制备得到的改性生物活性玻璃加入超纯水中超声混合，得到均匀的悬浊液；
10.(3)将步骤(2)得到的悬浊液与胶原溶液共混，室温下反应20～25小时得到均匀且
无气泡的混合溶液；
11.所述混合溶液中胶原与改性生物活性玻璃的质量比为100：(1～7)；
12.(4)将步骤(3)得到的混合溶液风干后得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。
13.优选的，所述生物活性玻璃的成分为24.5％na2o-24.5％cao-6％p2o
5-45％sio2。
14.优选的，所述胶原溶液的制备为：将胶原用盐酸溶液配制成胶原溶液，所用盐酸溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/l。
15.优选的，所述胶原为从牛跟腱中提取的ι型胶原。
16.优选的，步骤(1)所述共混研磨，具体为：
17.加入无水乙醇，共混研磨1.5～2.5小时。
18.优选的，步骤(1)所述真空干燥，具体为：
19.在35～40℃真空干燥。
20.优选的，步骤(2)所述超声混合，具体为：超声混合30～60分钟。
21.优选的，步骤(4)所述将步骤(3)得到的混合溶液风干后得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，具体为：
22.将步骤(3)所述的混合溶液浇铸在模具中，室温下风干成复合膜，用去离子水多次洗涤，在室温下自然风干，即得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。
23.优选的，所述混合溶液中胶原与改性生物活性玻璃的质量比为100：(6～7)。
24.优选的，所述胶原溶液的浓度为5.8～6.5mg/ml。
25.进一步优选的，所述胶原溶液的浓度为5.8～6.3mg/ml。
26.所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法制备得到的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，其接触角为60
°
～70
°
。
27.优选的，所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的接触角为65
°
～70
°
。
28.所述胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，具有层状结构，生物活性玻璃嵌入胶原的层间。
29.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
30.(1)本发明的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，角膜上皮细胞可以在本发明的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料上粘附、增殖。在体外炎症条件下可以上调il-10、arg-1等抗炎细胞因子的表达，从而有效降低术后免疫排斥反应引起的炎症反应。
31.(2)本发明的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，通过将卵磷脂改性后的生物活性玻璃与胶原复合，得到的抗炎角膜修复材料具有层状结构，光学透过性好，含水性好，且具有较好的力学性能，手术线进行缝合时不会造成撕裂。
32.(3)本发明的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，所使用的制备原料胶原、卵磷脂、生物活性玻璃均无毒无害，具有良好的生物相容性和可生物降解。
附图说明
33.图1是本发明的实施例1的col-bg复合膜的扫描电子显微镜(sem)的截面
34.图2是本发明的实施例1的col-bg复合膜的光透过性能测试结果。
35.图3是本发明的实施例1的col-bg复合膜的水接触角测试结果。其中，图中(a)为
col膜的水接触角；图中(b)为col-bg复合膜的水接触角。
36.图4是本发明的实施例1的col-bg复合膜的力学性能测试结果。
37.图5是本发明的实施例1的col-bg复合膜的细胞毒性测试结果。
38.图6a是本发明的实施例1和对比例1的角膜修复材料的体外抗炎效果图(促炎基因表达)，即复合膜对炎症条件下巨噬细胞raw264.7相关基因mrna的表达水平的调控测试结果。
39.图6b是本发明的实施例1和对比例1的角膜修复材料的体外抗炎效果图(抗炎基因表达)，即对炎症条件下巨噬细胞raw264.7相关基因mrna的表达水平的调控测试结果。
具体实施方式
40.下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
41.实施例1
42.一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料(col-bg复合膜)，制备方法包括以下步骤：
43.(1)按照生物活性玻璃与卵磷脂25：1的比例在20～25℃条件下通过研磨介质共混研磨2小时制备改性生物活性玻璃，在37℃真空干燥箱干燥；
44.(2)将制备的改性生物活性玻璃按与胶原质量比为5：100的比例进行称取，加入超纯水中超声30分钟得到混合均匀的悬浊液；
45.(3)将步骤(2)制备得到的混合溶液与胶原溶液共混，室温下反应24小时得到均匀且无气泡的混合溶液；
46.(4)将步骤(3)制备得到的混合溶液浇铸在培养皿中，室温下自然风干成膜即可得到col-bg复合膜，脱除模具，取出复合膜，并用去离子水多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。
47.生物活性玻璃用超纯水配置成浓度为2mg/ml的生物活性玻璃悬浊液；将从牛跟腱中提取的ι型胶原，用0.01mol/l的盐酸溶液配制浓度为6.0mg/ml的胶原溶液。
48.通过对实施例1中的col-bg复合膜材料进行理化性能表征，可以得到以下结论：
49.图1是本实施例所得的具有抗炎效果的角膜修复材料的扫描电子显微镜(sem)的截面图。可见生物活性玻璃被嵌入胶原材料的层间，这是该角膜修复材料制备成功的直接证据。
50.图2是实施例1的col-bg复合膜的光透过性能测试结果。由图2可知，col-bg复合膜材料的光透过性能良好，生物活性玻璃的加入对光透过性能无较大影响，在大部分波长处的透光率可达70％以上；
51.图3是实施例1的col-bg复合膜的水接触角测试结果。由图3可知，与col膜相比，col-bg复合膜的接触角增加，说明表面粗糙度略有增加，有利于细胞粘附，二者接触角范围在60
°
～70
°
，符合粘附较好的接触角范围(45
°
～75
°
)。
52.图4是实施例1的col-bg复合膜的力学性能测试结果。由图4可知，col-bg复合膜材料与col材料相比，其拉伸强度有所提高。
53.图5是实施例1的col-bg复合膜的细胞毒性测试结果。由图5可知，col-bg复合膜材料无细胞毒性，第5天时col-bg复合膜材料的吸光值略高于col材料，表明复合膜更利于细
胞增殖。
54.图6a～图6b是实施例1和对比例1的角膜修复材料的体外抗炎效果图。由图6a、图6b可知，与col材料相比，col-bg复合膜材料在3天时能够显著下调inos的表达，同时上调il-10、arg-1的表达，并存在显著性的差异，这说明在col-bg膜上培养的raw264.7巨噬细胞向m2型巨噬细胞极化，从而表达抗炎细胞因子。这表明生物活性玻璃的加入可以赋予材料抗炎性能。
55.实施例2
56.一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料(col-bg复合膜)，制备方法包括以下步骤：
57.(1)按照生物活性玻璃与卵磷脂25：1的比例在20～25℃条件下通过研磨介质共混研磨2小时制备改性生物活性玻璃，在40℃真空干燥箱干燥；
58.(2)将制备的改性生物活性玻璃按与胶原质量比为1：100的比例进行称取，加入超纯水中超声45分钟得到混合均匀的悬浊液；
59.(3)将步骤(2)得到的混合溶液与胶原溶液共混，室温下反应22小时得到均匀且无气泡的混合溶液；
60.(4)将步骤(3)得到的混合溶液浇铸在培养皿中，室温下自然风干成膜即可得到col-bg复合膜，脱除模具，取出复合膜，并用去离子水多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。
61.生物活性玻璃用超纯水配置成浓度为1mg/ml的生物活性玻璃悬浊液；将从牛跟腱中提取的ι型胶原，用0.005mol/l的盐酸溶液配制浓度为6.3mg/ml的胶原溶液。
62.实施例3
63.一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料(col-bg复合膜)，制备方法包括以下步骤：
64.(1)按照生物活性玻璃与卵磷脂25：1的比例在20～25℃条件下通过研磨介质共混研磨2小时制备改性生物活性玻璃，在50℃真空干燥箱干燥；
65.(2)将制备的改性生物活性玻璃按与胶原质量比为7：100的比例进行称取，加入超纯水中超声60分钟得到混合均匀的悬浊液；
66.(3)将步骤(2)得到的混合溶液与胶原溶液共混，室温下反应20小时得到均匀且无气泡的混合溶液；
67.(4)将步骤(3)得到的混合溶液浇铸在培养皿中，室温下自然风干成膜即可得到col-bg复合膜，脱除模具，取出复合膜，并用去离子水多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。
68.生物活性玻璃用超纯水配置成浓度为4mg/ml的生物活性玻璃悬浊液；将从牛跟腱中提取的ι型胶原，用0.001mol/l的盐酸溶液配制浓度为6.5mg/ml的胶原溶液。
69.对比例1
70.一种胶原角膜修复材料(col膜，col)，制备方法包括以下步骤：
71.(1)将制备好的胶原溶液在室温下搅拌24小时，除去气泡得到均匀且无气泡的胶原溶液；
72.(2)将步骤(1)制备的胶原溶液倒入培养皿中，室温下自然风干成膜即可得到col
膜，脱除模具，取出col膜，并用去离子水多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。
73.将从牛跟腱中提取的ι型胶原，用0.001mol/l的盐酸溶液配制浓度为6.5mg/ml的胶原溶液。
74.结果检测
75.实施例和对比例的具体检测结果详见下表1和表2。
76.表1
77.序号透光率(％)水接触角(
°
)拉伸强度(mpa)实施例177.4
±
2.468.53
±
1.650.51
±
0.01实施例279.07
±
2.763.17
±
2.490.53
±
0.04实施例375.57
±
2.5775.51
±
1.430.45
±
0.05对比例182.87
±
2.3562.1
±
4.850.44
±
0.02
78.表2
[0079][0080][0081]
对各组实施例与对比例的透光率(800nm处)、接触角以及拉伸强度进行了比较，可以发现本发明实施例中生物活性玻璃的加入对透明性的影响不大，且col-bg复合膜的表面接触角增大，表明表面粗糙度增加而有利于细胞的生长；且拉伸强度也随生物活性玻璃的加入而增大，这可能与成核位点的增多有关。从表3中可见各实施例复合膜可上调arg-1等抗炎因子的表达，下调inos等促炎因子的表达，且实施例1调控效果相对是最好的，且在透光性和拉伸强度上不会对角膜材料有负面抑制作用。
[0082]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物活性玻璃与卵磷脂在20～25℃条件下共混研磨，然后真空干燥，得到改性的生物活性玻璃；所述生物活性玻璃与卵磷脂的质量比为22～28：1；(2)将步骤(1)制备得到的改性生物活性玻璃加入超纯水中超声混合，得到均匀的悬浊液；(3)将步骤(2)得到的悬浊液与胶原溶液共混，室温下反应20～25小时得到均匀且无气泡的混合溶液；所述混合溶液中胶原与改性生物活性玻璃的质量比为100：(1～7)；(4)将步骤(3)得到的混合溶液风干后得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。2.根据权利要求1所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述生物活性玻璃的成分为24.5％na2o-24.5％cao-6％p2o
5-45％sio2。3.根据权利要求1所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液的制备为：将胶原用盐酸溶液配制成胶原溶液，所用盐酸溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/l。4.根据权利要求1或3所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述胶原为从牛跟腱中提取的ι型胶原。5.根据权利要求1所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述共混研磨，具体为：加入无水乙醇，共混研磨1.5～2.5小时。6.根据权利要求1所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述真空干燥，具体为：在35～40℃真空干燥。7.根据权利要求1所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述超声混合，具体为：超声混合30～60分钟。8.根据权利要求1所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述将步骤(3)得到的混合溶液风干后得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，具体为：将步骤(3)所述的混合溶液浇铸在模具中，室温下风干成复合膜，用去离子水多次洗涤，在室温下自然风干，即得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。9.权利要求1～8任一项所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法制备得到的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，其特征在于，其接触角为60
°
～70
°
。10.根据权利要求9所述的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料，其特征在于，具有层状结构，生物活性玻璃嵌入胶原的层间。

技术总结
本发明公开了一种胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将生物活性玻璃与卵磷脂共混研磨，然后真空干燥，得到改性的生物活性玻璃；(2)将步骤(1)制备得到的改性生物活性玻璃加入超纯水中超声混合，得到均匀的悬浊液；(3)将步骤(2)得到的悬浊液与胶原溶液共混，室温下得到均匀且无气泡的混合溶液；(4)将步骤(3)得到的混合溶液风干后得到胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。本发明还公开了上述制备方法得到的胶原-生物活性玻璃抗炎角膜修复材料。本发明的角膜修复材料在满足角膜再生修复材料所需力学性能、含水率、透光率等要求的前提下，能够调控巨噬细胞的极化，从而达到调控炎症的作用。从而达到调控炎症的作用。从而达到调控炎症的作用。


技术研发人员：任力 于宁 彭岳海 宋文婧 刘卅
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/12