一种白屈菜红碱在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及白屈菜红碱在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。


背景技术：

2.白屈菜最早记载于《救荒本草》，是罂粟科白屈菜属植物白屈菜的干燥全草，夏、秋二季采挖，全草入药，归肺、胃经，具有镇静止痛、抗肿瘤、抗菌杀虫生物活性，主要用于治疗胃脘挛痛、咳嗽气喘、百日咳等，为中医临床常用药物，国家级名老中医长春中医药大学附属医院王烈教授，便擅于应用白屈菜治疗小儿咳嗽哮喘。白屈菜属于吉林省道地药材且范围分布较广泛。研究表明，白屈菜的主要活性成分为异喹啉类生物碱，主要包含白屈菜碱、血根碱、白屈菜红碱、黄连碱等，有现代研究报道其主要成分白屈菜红碱具有抗菌、抗炎、抗寄生虫等生物学活性，其抗肿瘤活性也越来越受到关注。
3.白屈菜红碱(chelerythrine，che)，又名白屈菜赤碱、白屈菜季铵碱，是从飞龙掌血、白屈菜、博落回、血水草等植物中分离的异喹琳类的苯并菲啶型生物碱。che药理活性特别是抗癌活性与其分子的结构特点有着密切的关系。白屈菜红碱抗卵巢癌转移的研究在国内处于空白阶段。
4.白屈菜红碱是白屈菜中重要的有效活性成分，其抗肿瘤、抗菌、抗炎等药理活性已得到证实。近年来发现其对包括胃癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤均具有抑制作用，但白屈菜红碱对卵巢癌增殖和凋亡的影响尚无报导，而白屈菜红碱在体内的抗肿瘤研究更是缺乏。
5.在女性生殖系统肿瘤发病率排名中，卵巢癌仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，位居第三，但是卵巢癌致死率却在全世界范围内居领先地位。由于起病隐匿、缺乏早期诊断方法、后期对多种化疗药物出现耐药等，使卵巢恶性肿瘤患者的5年存活率低于30％，广大妇女的生命安全因此受到了重大威胁。给予病人实行肿瘤细胞减灭术以及满意的手术结束后加上铂类为最根本的化学药物医治是目前卵巢恶性肿瘤的医治准则，虽然大多数患者在接受标准的初期手术和化疗治疗方案后可以明显缓解病情，但在2年左右会出现复发，最终因化疗耐药导致治疗失败而死亡，因此寻找高效的新型抗卵巢癌药物对卵巢癌的治疗具有重要意义。
6.众多研究发现在癌症的医治上中药有着重要的积极影响。白屈菜红碱是白屈菜的主要有效活性成分之一。近年来，che的抗肿瘤活性正逐步得到人们的重视并在国内外研究中得到较多关注。研究报告指出，che对9种肿瘤细胞具有细胞毒性；che可抑制人胃癌细胞bgc-823生长，诱导细胞发生凋亡。因此可作为一种新型的抗癌药物，而目前关于白屈菜红碱抗卵巢癌的作用尚未明确。
7.白屈菜红碱抗肿瘤作用机制研究越来越多。现有技术1发现，che可以降低p-fak的表达改变hep3b细胞的骨架结构，主要通过pi3k/akt/mtor信号通路下调mmp-2/9的表达来抑制肝癌细胞的转移。现有技术2发现，che可能通过抑制erk活性来诱导肾癌细胞凋亡。现有技术3发现，che通过pi3k/bad信号通路，通过激活线粒体凋亡来抑制宫颈癌hela细胞的
增殖。现有技术4发现，白屈菜红碱诱导骨肉瘤细胞凋亡是通过激活raf/mek/erk途径介导的。现有技术5发现che通过mapk信号通路抗肿瘤，并研究了che诱导hela细胞凋亡的是通过激活p38/jnk信号通路介导的而非erk，且在此基础上证明了che诱导hela细胞jnk1和p38的时间和剂量依赖性激活是通过上游激酶mekk1和mkk4介导的。
8.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有将白屈菜红碱应用于制备用于治疗卵巢癌的药物，白屈菜红碱在抑制卵巢癌增殖方面属于技术空白。


技术实现要素：

9.本发明发现白屈菜红碱可以抑制卵巢癌细胞的增殖，并且通过调控上皮-间充质转化进程抑制卵巢癌细胞侵袭转移。
10.基于以上内容，本发明提供如下技术方案：
11.本发明的第一方面，涉及白屈菜红碱在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
12.本发明的第二方面，涉及白屈菜红碱在制备试剂中的应用，所述的试剂用于抑制卵巢癌细胞的增殖、凋亡或迁移。
13.本发明的第三方面，涉及一种体外抑制卵巢癌细胞生长的方法，所述方法包括对卵巢癌细胞施用有效量的白屈菜红碱。
14.白屈菜红碱(chelerythrine；che)，分子式：c21h18no4
+
，分子量：348.37192，化学结构式为：
[0015][0016]
细胞实验结果显示，白屈菜红碱能够通过调控上皮-间充质转化进程抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制卵巢癌的生长，说明白屈菜红碱可以作为抗癌药物治疗卵巢癌。另外，白屈菜红碱对正常卵巢细胞毒性较小，说明对正常人体细胞伤害较小。
[0017]
根据本发明具体实施方式的用途，本发明所述的治疗卵巢癌的药物可以白屈菜红碱作为活性成分，通过加入一种或多种药学上可接受的辅料，按照制剂学常规工艺，制备成药剂学上可接受的任何药物剂型。所述治疗卵巢癌的药物可经口服途径给药、也可以经局部给药、腹腔注射、静脉途径给药等其他临床治疗可接受的给药途径给药。
[0018]
本发明的有益效果为：
[0019]
本发明涉及的白屈菜红碱可有效杀死卵巢癌细胞系skvo3细胞，通过调控上皮-间充质转化进程，抑制skvo3细胞的增殖、侵袭迁移，具有明显的抗卵巢癌活性。白屈菜红碱是从中药材白屈菜中提取的化合物，具有巨大的药理潜力，但在卵巢癌的治疗中尚未见报道，将其作为新型抗卵巢癌天然药物具有较好的潜在临床价值。本发明拓宽了白屈菜红碱的应用领域，为白屈菜红碱在制备治疗卵巢癌药物方面的临床应用提供了实验依据，具有良好的应用前景和巨大的潜在价值。
附图说明
[0020]
图1：白屈菜红碱呈浓度和时间依赖性降低skvo3细胞的活力；
[0021]
图2：白屈菜红碱呈浓度依赖性杀死skvo3细胞；
[0022]
图3a：白屈菜红碱抑制skvo3细胞的迁移；
[0023]
图3b：白屈菜红碱抑制skvo3细胞的迁移过程中相对划痕面积；
[0024]
图4a：白屈菜红碱抑制skvo3细胞的侵袭转移；
[0025]
图4b：白屈菜红碱抑制skvo3细胞的侵袭转移过程中相对迁移率；
[0026]
图4c：白屈菜红碱抑制skvo3细胞的侵袭转移过程中相对侵袭率；
[0027]
图5a：白屈菜红碱调控上皮-间充质转化进程，抑制skvo3细胞细胞的侵袭转移；
[0028]
图5b：白屈菜红碱调控上皮-间充质转化进程，抑制skvo3细胞细胞的侵袭转移中钙黏蛋白e相对表达量；
[0029]
图5c：白屈菜红碱调控上皮-间充质转化进程，抑制skvo3细胞细胞的侵袭转移中钙黏蛋白n相对表达量；
[0030]
图5d：白屈菜红碱调控上皮-间充质转化进程，抑制skvo3细胞细胞的侵袭转移中波形蛋白相对表达量；
[0031]
图6和图7：光显微镜对荧光信号进行观察并拍效果图。
具体实施方式
[0032]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0033]
实施例1：白屈菜红碱对卵巢癌细胞活力的影响实验
[0034]
将处于对数生长期的人卵巢癌细胞skov3以1
×
104个/ml浓度铺于96孔板中，24h后向各组加入0、2.5、5、10、20、40μm的che，每组5个复孔，孵育24、48、72h后，每孔加入10μl mtt溶液，4h后弃上清，加入150μl dmso充分溶解甲瓒，酶标仪测定吸光度并计算细胞活力。结果表明白屈菜红碱可呈浓度和时间依赖性的降低skvo3细胞的活力。见图1。
[0035]
实施例2：白屈菜红碱对卵巢癌细胞杀伤的影响实验
[0036]
将处于对数生长期的人卵巢癌细胞skov3以1
×
105个/ml浓度铺于6孔板中，当细胞生长至80％融合时，加入(0、5、10、15μm)不同浓度的白屈菜红碱(chelerythrine；che)，24h后观察skvo3细胞生长状态，拍照记录。见图2。
[0037]
实施例3：白屈菜红碱对卵巢癌细胞迁移的影响实验
[0038]
将处于对数生长期的人卵巢癌细胞skov3以1
×
105个/ml浓度铺于6孔板中，当细胞生长至80％融合时，用200μl移液枪枪头沿小孔中轴划线，pbs润洗后拍照。按照空白对照组、tgf-β1组、tgf-β1+che 5μm组、tgf-β1+che 10μm组进行给药处理，24h后对同一位置进行再次拍照，比较分析细胞迁移距离，计算相对划痕面积。见图3a，图3b。
[0039]
实施例4：白屈菜红碱对卵巢癌细胞侵袭转移的影响实验
[0040]
将消化后的skov3细胞用无血清培养基重悬，以2.5
×
105浓度铺于transwell小室上层，每孔100μl；下层分别加入10％培养基及其配置的tgf-β1、tgf-β1+che 5μm、tgf-β1+che 10μm培养液，每孔500μl。继续培养24h后，pbs清洗小室，4％多聚甲醛固定细胞并用结晶紫溶液染色，棉签轻柔擦去小室上层细胞后，显微镜下拍照观察穿膜细胞数，计算细胞相
对迁移率和相对侵袭率。其中，侵袭实验要提前将小室上层铺好matrigel基质胶，后续操作同上。见图4a，图4b，图4c。
[0041]
实施例5：白屈菜红碱对emt相关蛋白表达的影响实验
[0042]
将处于对数生长期的人卵巢癌细胞skov3以1
×
105个/ml浓度铺于6孔板中，当细胞生长至80％融合时，弃上清，按照空白对照组、tgf-β1组、tgf-β1+che 5μm组、tgf-β1+che 10μm组进行给药处理。24h后，用预冷的pbs洗涤细胞，每孔中加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液150μl，细胞刮刀收集细胞，12000g离心30min，得到含有细胞蛋白的上清液。bca蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白质浓度并定量。进行sds page时，凝胶浓度为12％，每孔上样量为15μl，电泳条件为150v 80min；湿法转膜，转膜条件为200ma45min。5％脱脂奶粉封闭2h，tbst洗涤后，分别加入e-cadherin、n-cadherin、vimentin、β-actin抗体，按照说明书比例稀释，4℃冰箱孵育过夜；次日回收一抗，tbst洗涤，二抗孵育2h后，ecl发光液显色，多功能化学发光成像仪拍照，image j分析条带灰度值。见图5a，图5b，图5c，图5d。
[0043]
将处于对数生长期的人卵巢癌细胞skov3以1
×
105个/ml浓度铺于6孔板中，当细胞生长至80％融合时，弃上清，按照空白对照组、tgf-β1组、tgf-β1+che 5μm组、tgf-β1+che 10μm组进行给药处理。24h后，pbs洗涤细胞，4％多聚甲醛固定细胞，并用0.1％triton x-100进行细胞打孔。5％bsa封闭60min后，分别加入e-cadherin、n-cadherin抗体，按照说明书比例稀释，4℃冰箱孵育过夜。次日回收一抗，tbst洗涤，alexa fluor 488标记山羊抗兔igg(h+l)孵育e-cadherin组，alexa fluor 647标记山羊抗兔igg(h+l)孵育n-cadherin组，荧光二抗孵育2h，并用dapi染色10min。荧光显微镜对荧光信号进行观察并拍照。见图6和图7。
[0044]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
[0045]
二、拟重点解决的科学问题：
[0046]
白屈菜红碱是白屈菜的主要有效活性成分之一。近年来，che的抗肿瘤活性正逐步得到人们的重视并在国内外研究中得到较多关注。而目前关于白屈菜红碱抗卵巢癌的作用尚未明确。本发明通过离体和在体实验观察白屈菜红碱对卵巢癌增殖能力和凋亡水平的影响，是对白屈菜看肿瘤研究的重要补充。
[0047]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.白屈菜红碱在制备用于治疗卵巢癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢癌的药物为抑制卵巢癌细胞增殖的药物。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢癌的药物为促进卵巢癌细胞凋亡的药物。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢癌的药物为抑制卵巢癌细胞侵袭转移的药物。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢癌的药物为通过介导与卵巢癌细胞侵袭转移相关的上皮-间充质转化进程，抑制卵巢癌细胞侵袭转移，治疗卵巢癌的药物。6.如权利要求1-5任意一项所述用途，其特征在于，所述白屈菜红碱通过调控上皮-间充质转化进程途径抑制卵巢癌细胞侵袭转移，治疗卵巢癌。7.根据权利要求2-6之一所述的应用，其特征在于，所述卵巢癌细胞为skvo3细胞。8.根据权利要求1-6之一所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢癌的药物还包括一种或多种药学上可接受的辅料。9.根据权利要求1-6之一所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢癌的药物的剂型为药剂学上可接受的任何药物剂型。10.白屈菜红碱在制备试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂用于抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭或转移。

技术总结
本发明属于卵巢癌治疗技术领域，公开了一种白屈菜红碱在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途。本发明填补了白屈菜红碱在抑制卵巢癌增殖相关研究领域的空白，为白屈菜红碱的临床应用提供理论依据和新思路。本发明发现白屈菜红碱可以有效杀死卵巢癌细胞系SKOV3细胞，通过调控上皮-间充质转化进程，抑制SKVO3细胞的侵袭转移，具有明显的抗卵巢癌活性，可将其开发成为治疗卵巢癌的药物。本发明为白屈菜红碱用于治疗卵巢癌提供了重要理论依据，扩宽了该药物治疗范围，同时为提高现有卵巢癌的治疗水平，改善预后提供了新的药物解决方案。改善预后提供了新的药物解决方案。改善预后提供了新的药物解决方案。


技术研发人员：黄晓巍 周佳 王雨辰 律广富 林贺 徐岩 高乔 许佳明 林喆 邱智东
受保护的技术使用者：长春中医药大学
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/12