ddPCR检测罗非鱼无乳链球菌的引物、探针和方法与流程

ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的引物、探针和方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种ddpcr法检测罗非鱼无乳链球菌的特异性引物、特异性探针、试剂盒和方法。


背景技术：

2.罗非鱼(oreochromis niloticus)是隶属于鲈形目丽鱼科的一种淡水鱼，原产自非洲，自古埃及时代以来，罗非鱼就是一种重要的人工养殖水产品。在可捕获的野生渔业资源日益枯竭的当代，罗非鱼因其卓越的养殖适应性而提供了商业化的可能性。并且因其食性广泛、繁殖率高、生长迅速及抗病能力强等优点，已成为全球广泛养殖的主要淡水鱼种。自1950年至2017年，全球罗非鱼产量以年均7.39％的速度增长，从1590t升至659万t。在国内，罗非鱼的产量自2012年至2016年，更是以每年9％左右的年均增长速度快速增加，成为我国最重要水产品之一。然而，随着养殖规模的的迅速扩张，罗非鱼养殖业也受到了各种疾病的威胁，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等，造成巨大的经济损失，其中，无乳链球菌感染引起的死亡高，对罗非鱼养殖业造成了极为严重的影响。
3.无乳链球菌(streptococcus agalactiae，s.agalactiae)又名b族链球菌(group b streptococcus，gbs)，自1966年首次报道以来，研究发现其不仅可以感染罗非鱼等各种水生动物，也能感染人类、牛、狗、啮齿动物等，并有跨物种传播的风险，且人源和动物源的分离菌株之间也有着密切遗传关系。虽然无乳链球菌尚未被认定为食源性病原体，但在2015年新加坡大规模无乳链球菌感染中发现，408名病例中，35.8％的患者为鱼源株st283感染引起，证明无乳链球菌个别菌株具有人兽共患的风险，对人类健康有潜在威胁。在我国，无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病是养殖罗非鱼最常见的疾病。早期的快速、准确的诊断是防治该病的最有效方法。目前，罗非鱼无乳链球菌检测方法有细菌分离培养鉴定、间接elisa、胶体金免疫层析法、环介导等温技术、常规pcr、实时荧光pcr等。其中细菌分离培养结合pcr鉴定是现行的行业标准方法，通过从鱼脑、肾脏、肝脏、脾脏等器官少量取样划线接种与血琼脂平板，经过培养、分离，三次纯化来实现，并结合生化鉴定结果和分子生物学鉴定结果作出最终判定。但该方法耗时长，需要2～4天，且无乳链球菌的细菌浓度低于6
×
102cfu.mg-1
时不是优势菌，低于水中细菌浓度(水族箱：2.27
×
104cfu.mg-1
、池塘：6.68
×
103cfu.mg-1
)，检出率将会大大降低。同样，间接elisa、胶体金免疫层析法等方法也存在灵敏度不足的问题。实时荧光pcr方法因为其特异性强，灵敏度较高，以及可以相对定量的优势在各类兽医实验室检测中应用越来越广泛。但是在病原体含量极低的情况下实时荧光pcr方法易出现假阴性结果，且在定量时受到参考标准曲线的限制，无法显示低拷贝数下的微小变化，特别是当初始拷贝数接近检测下限时，无法检出。在罗非鱼链球菌病监测中，病原体无乳链球菌的早期检测显得尤为重要，但表面健康和早期发病时鱼体及水体含菌量低，无疑增加了检测的难度和不确定性，不能做到提前警示以预防疫病大规模爆发。在这种情况下，最低检测限能到达0.15～6.4copies.μl-1
的微滴数字pcr技术可以作为检测病原体的理想方法。
4.微滴数字pcr是荧光pcr方法的基础上的新一代技术，可用于目标核酸的绝对定量。在微滴生成器中，反应体系被分隔成10000～20000个小的油包水微滴来充当pcr生物反应室，每个反应室都有目标核酸的0个或1个至多个拷贝。每个液滴都是一个特定的封闭区域，可防止反应室之间的交叉污染。目前较成熟的划分样品的方法除微滴式还有微孔式、微流体室等。微滴生成后进行常规pcr扩增，最终通过类似于流式细胞术机制的微滴读取仪单独分析液滴是否含有荧光，结合泊松分布原理确定拷贝数。自1999年vogelsteinb和kinzler kw提出数字pcr构想以来，微滴式数字pcr技术已经在兽医领域得到应用，但应用于鱼类疫病病原体诊断检测相对较少。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于提供一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性引物、特异性探针、试剂盒和方法。
6.实现上述发明目的的技术方案包括如下。
7.本发明的第一方面，提供了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性引物，所述特异性引物包括序列如seq id no.1所示的正向引物和序列如seq idno.2所示的反向引物。
8.本发明的第二方面，提供了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性探针，所述特异性探针的序列如seq id no.3所示。
9.本发明的第三方面，提供了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒，包括上述特异性引物和特异性探针。
10.本发明的第四方面，提供了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的方法，包括以下步骤：以待测罗非鱼样品的dna为模板，利用上述特异性引物和特异性探针，进行ddpcr扩增。
11.在本发明中，通过设计特异性引物和探针，优化ddpcr反应体系及扩增程序，建立了ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的方法，该方法灵敏度高(最低检测限达2.56copies.μl-1
，与实时荧光pcr方法相比具有更高的灵敏度，在梯度稀释至低浓度时仍有着良好线性关系)、特异性强、重复性好，适用于罗非鱼临床样品的检测，且可做到精准定量，更加适用于罗非鱼无乳链球菌感染的早期检测以及鱼苗、种鱼、鱼肉产品、鱼塘环境中微量罗非鱼无乳链球菌的检测，也为罗非鱼养殖业中罗非鱼无乳链球菌长期的防控监测，流行病学研究以及抗生素药物筛选提供了更加精准科学的方案。
附图说明
12.图1为本发明实施例3中罗非鱼无乳链球菌dna 5倍梯度稀释的ddpcr扩增图。
13.图2为本发明实施例3中采用实时荧光pcr方法检测罗非鱼无乳链球菌的标准曲线。
14.图3为本发明实施例3中采用实时荧光pcr方法和ddpcr方法的梯度稀释线性关系。
15.图4为本发明实施例3中ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性试验结果。
16.图5为本发明试验例1中使用不同引物和探针序列的ddpcr扩增图。
17.图6为本发明试验例2中使用不同引物浓度的ddpcr扩增图。
18.图7为本发明试验例2中使用不同探针浓度的ddpcr扩增图。
19.图8为本发明试验例2中使用不同退火温度的ddpcr扩增图。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
21.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
22.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如green和sambrook等人，分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
23.本发明的其中一些实施例中，公开了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性引物，所述特异性引物包括序列如seq id no.1所示的正向引物和序列如seq id no.2所示的反向引物。
24.本发明的另一些实施例中，还公开了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性探针，所述特异性探针的序列如seq id no.3所示。
25.在其中一些实施例中，所述特异性探针的5'修饰有荧光报告基团，所述荧光报告基团为fam。所述特异性探针的3'修饰有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为bhq1。本发明的荧光报告基团和荧光淬灭基团不限于上述基团，可根据需要选择任意合适的基团，均在本发明的保护范围内。
26.在本发明的另一些实施例中，还公开了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒，包括上述特异性引物和特异性探针。
27.在其中一些实施例中，所述特异性引物中正向引物和反向引物的工作浓度均为0.3μmol
·
l-1
～1.1μmol
·
l-1
。
28.在其中一些实施例中，所述特异性探针的工作浓度为0.1μmol
·
l-1
～0.35μmol
·
l-1
。
29.在本发明的另一些实施例中，还提供了一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的方法，包括以下步骤：以待测罗非鱼样品的dna为模板，利用上述特异性引物和特异性探针，进行ddpcr扩增。
30.以下实施例中，无乳链球菌由东莞市动物疫病预防控制中心实验室分离鉴定所得，编号：dg210721。鱼类海豚链球菌标准菌株，来源atcc，编号：atcc29178。猪链球菌2型、罗非鱼湖病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、蛙彩病毒、草鱼出血病病毒阳性核酸样品由东莞市动物疫病预防控制中心实验室保存。临床样品采自东莞市9个罗非鱼养殖场，共51份。classⅱbsc生物安全柜购自esco科技有限公司，precelly evolution生物样品均质器购自bertin公司；普通pcr仪、数字pcr系统qx200、96孔板封口机px1购自bio-rad公司；afd4800荧光pcr仪购自杭州安杰思医学科技有限公司；vitek2compact全自动细菌鉴定仪购自梅里
埃公司；mir-153生化培养箱购自三洋公司。ddpcr supermix for probes(no dutp)、微滴生成油购自bio-rad公司；引物、探针由生工生物工程股份有限公司合成；thb肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；罗非鱼无乳链球菌荧光pcr试剂盒购自深圳市澳东检验检测有限公司；核酸提取或纯化试剂购自广州达安基因股份有限公司；pbs溶液由东莞市动物疫病预防控制中心实验室配制。
31.以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
32.实施例1ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的引物和探针
33.根据genbank收录的鱼源s.agalactiae 01173株(收录号：cp053027.1)的lysm肽聚糖结合结构域蛋白质基因组中sip基因序列的保守片段设计特异性引物和特异性探针，其核苷酸序列分别如下：
34.特异性引物：
35.正向引物f(seq id no.1)：5
’‑
agtttctctcaatacaatttcgga-3’；
36.反向引物r(seq id no.2)：5
’‑
agaagaatatgtcttcattggcg-3’；
37.特异性探针(seq id no.3)：
[0038]5’‑
atgacaccagaagcagcaacaacgat-3’[0039]
其中，特异性探针的5’端连接有荧光报告基团fam，3’端连接有荧光淬灭基团bhq1。
[0040]
实施例2ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的方法
[0041]
包括以下步骤：
[0042]
1、取待测罗非鱼样品的肝、脾内脏或鱼苗置2ml研磨管中，加入1mlpbs溶液，放入生物样品均质器以速度7000r.min-1
，匀浆3次，每次20s，每次间隔20s进行匀浆，瞬时离心；按照核酸提取试剂说明书操作提取核酸，于-80℃冰箱保存备用；
[0043]
2、以待测罗非鱼样品的dna为模板，进行ddpcr扩增反应；
[0044]
反应体系为：ddpcr supermix forprobes(no dutp)10μl，模板1μl，正向和反向引物各0.12～0.44μl(引物原始浓度为50μmol/l，工作浓度是0.3～1.1μmol/l)，探针0.04～0.14μl(探针原始浓度为50μmol/l，工作浓度是0.1～0.35μmol/l)，depc水补至20μl。
[0045]
反应程序为：95℃，10min；94℃，30s，56.9～65℃，1min，40个循环；98℃，10min；升降温速率2℃.s-1
。
[0046]
3、对ddpcr扩增反应产物进行分析
[0047]
将反应后的pcr反应板转移至微滴分析仪，荧光分析采用fam荧光通道，对ddpcr反应产物进行计数分析。
[0048]
实施例3本发明方法的方法学验证
[0049]
将无乳链球菌接种于灭菌的thb液体培养基，摇床190r.min-1
，37℃培养20h，然后对培养液进行细菌平板计数，用生理盐水将细菌调整到1.0
×
109cfu.ml-1
，用体积分数为0.5％的甲醛溶液于28℃条件下灭活48h，用磷酸盐缓冲液(pbs)将菌液洗涤3次，混匀并配成4.0
×
108cfu.ml-1
灭活菌液，分装至1ml冻存管保存，于-80℃冰箱保存备用。
[0050]
按照水煮法提取无乳链球菌dna，取菌液1ml，13000r
·
min-1
转离心2min，弃上清，沉淀中加入100μl dna提取液充分混匀，沸水浴10min，13000r
·
min-1
转离心5min，取上清置于-80℃下保存备用。
[0051]
取制备的无乳链球菌dna进行以下试验。
[0052]
1、敏感性试验
[0053]
用dd h2o对提取的无乳链球菌dna按照5倍梯度稀释，稀释倍数从原倍至1：390625共9个梯度，同时进行ddpcr方法和实时荧光pcr方法检测，每个梯度做3次重复，并制作实时荧光pcr方法标准曲线。实时荧光pcr方法引物、探针序列和ddpcr方法一致，总反应体系为25μl，其中包括，5
×
pcrbuffer5μl，dntps 2μl，taq dna聚合酶0.6μl，正向和反向引物(50μmol
·
l-1
)各0.1μl，探针(0.5μmol
·
l-1
)0.08μl，模板1μl，ddh2o 16.12μl；反应程序为95℃，3min；95℃15s，55℃30s，40个循环。
[0054]
共检测9个梯度稀释无乳链球菌dna，获得梯度稀释ddpcr扩增图(图1)和ddpcr、实时荧光pcr梯度稀释线性关系图(图3)。
[0055]
从图3可知，ddpcr方法的线性关系优于实时荧光pcr方法。ddpcr方法在检测模板浓度低到12.8～2.56copies.μl-1
时仍能稳定检出，最低检测限为2.56copies.μl-1
。实时荧光pcr方法最低检测限为12.8copies.μl-1
，2.56copies.μl-1
dna样品不能稳定检出(表1，其中dna分子数根据图2标准曲线计算而得)。由此可见，ddpcr方法检测无乳链球菌dna的灵敏度比实时荧光pcr方法高5倍。
[0056]
表1灵敏度试验结果
[0057][0058][0059]
2、特异性试验
[0060]
按照实施例2的检测方法检测罗非鱼无乳链球菌、猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌、罗非鱼湖病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、蛙虹彩病毒、草鱼出血病病毒的核酸。通过使用ncbi引物blast工具对所选引物进行除无乳链球菌以外多种链球菌计算机分析。
[0061]
结果如图4所示，从图4可知，采用本发明的方法检测罗非鱼无乳链球菌、猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌、罗非鱼湖病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、蛙虹彩病毒、草鱼出血病病毒的核酸，微滴生成数目均在15000以上，结果均成立，除了罗非鱼无乳链球菌有特异性扩增出现阳性微滴，猪链球菌2型和其他不同种的水生动物疫病病原核酸检测结果均为阴性，未出现阳性微滴，无非特异性扩增的交叉反应。通过使用ncbi引物blast工具对所选引物进行除s.agalactiae外多种链球菌比对，无匹配序列。表明本发明建立的检测方法特异性较好。
[0062]
3、重复性试验
[0063]
对提取无乳链球菌dna进行10倍稀释，按照实施例2的检测方法重复检测9次，计算标准偏差及变异系数。
[0064]
结果如表2所示。
[0065]
表2重复性试验结果
[0066][0067]
从表2结果可知，检测10倍稀释的无乳链球菌dna9次，变异系数为3.15％，小于5％。结果表明本发明建立的检测方法重复性好。
[0068]
实施例4使用实施例2的方法对临床样品进行检测
[0069]
采用实施例2的检测方法(ddpcr方法)对东莞市罗非鱼养殖场采集的51份临床样品(罗非鱼内脏45份、罗非鱼鱼苗5份、池塘水1份)进行检测，同时，用实时荧光pcr方法和细菌分离鉴定方法进行检测。实时荧光pcr方法按照试剂盒说明书操作，细菌分离鉴定方法按照《罗非鱼链球菌病诊断规程》sc/t7235-2020操作。
[0070]
结果如表3所示，ddpcr方法检测结果为阳性样品3份，阳性检测率为5.88％。实时荧光pcr方法检测结果与ddpcr方法，符合率为100％；细菌分离鉴定方法分离检出阳性2份，阳性检测率为3.92％，ddpcr方法检测结果的符合率为94.12％。结果表明，本发明的ddpcr方法和实时荧光pcr方法的敏感性高于细菌分离鉴定方法，在低浓度样品的检测中更有优势。
[0071]
表3部分临床样品的检测结果
[0072][0073]
试验例1引物和探针的优化实验
[0074]
根据genbank收录的鱼源s.agalactiae 01173株(收录号：cp053027.1)的lysm肽聚糖结合结构域蛋白质基因组中sip基因序列的保守片段，使用primer premier 6.0软件设计了3组特异性引物和探针(表4)。探针5’端标记报告荧光基团fam，3’端标记淬灭荧光基团bhq1。使用ncbi引物比对搜索工具(blast)对所选引物进行计算机分析，以检查引物的特异性。根据扩增效率、特异性和拷贝数选择最佳组合。
[0075]
表4罗非鱼无乳链球菌检测引物、探针序列
[0076][0077]
检测结果如图5所示，图5显示3组引物、探针均能成功完成扩增，各组阳性微滴和阴性微滴分布均有明显界限，总微滴数均大于12000，拷贝数的平均值分别为5380copies.μl-1
、5060copies.μl-1
、5230copies.μl-1
。第1组引物、探针的扩增效率优于第3组和第2组，第1组阴、阳微滴荧光振幅差异更为显著。因此，选择第1组的引物和探针，作为本发明罗非鱼无乳链球菌ddpcr检测方法的引物和探针。
[0078]
试验例2ddpcr反应条件的优化实验
[0079]
按照ddpcr supermix forprobes(no dutp)说明书，进行三个步骤的ddpcr反应条件优化，分别为：引物工作浓度优化、探针工作浓度优化和退火温度优化。
[0080]
配置预混液，包括2
×
ddpcr supermix forprobes(no dutp)10μl；模板1μl；不同
工作浓度的引物(原始浓度为50μmol
·
l-1
)：0.3μmol
·
l-1
、0.5μmol
·
l-1
、
[0081]
0.7μmol
·
l-1
、0.9μmol
·
l-1
、1.1μmol
·
l-1
；不同工作浓度的探针(原始浓度为50μmol
·
l-1
)：0.1μmol
·
l-1
、0.15μmol
·
l-1
、0.2μmol
·
l-1
、0.25μmol
·
l-1
、0.3μmol
·
l-1
、0.35μmol
·
l-1
；使用depc水将反应体积调整至20μl。
[0082]
扩增条件：95℃10min；94℃30s，退火1min，40个循环；98℃10min，升降温速率2℃.s-1
，进行扩增反应，其中退火温度分别为：55℃、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63℃、64.3℃及65℃。每个程序重复检测3次。
[0083]
1、引物工作浓度的优化结果
[0084]
探针工作浓度为0.25μmol
·
l-1
时，5组不同引物工作浓度组合阳性微滴和阴性微滴分布均有明显界限，总微滴数均大于12000，结果均成立(图6)。当引物工作浓度为0.9μmol
·
l-1
时，ddpcr检测的dna分子数最大，标准偏差最小(表5)。因此，选择0.9μmol
·
l-1
作为罗非鱼无乳链球菌ddpcr反应的最适引物工作浓度。
[0085]
表5不同引物工作浓度的ddpcr检测的dna分子数
[0086]
引物浓度(μmol
·
l-1
)dna分子数平均值
±
标准差(拷贝
·
μl-1
)0.34060.00
±
140.000.54246.67
±
115.470.74273.33
±
190.090.94593.33
±
50.3341.14,540.00
±
180.00
[0087]
2、探针工作浓度的优化结果
[0088]
引物工作浓度为0.9μmol
·
l-1
时，6组不同探针工作浓度组合阴、阳微滴荧光振幅差异明显，且总微滴数大于12000，结果均成立(图7)。dna分子数依次为：0.3μmol
·
l-1
组》0.15μmol
·
l-1
组》0.35μmol
·
l-1
组》0.2μmol
·
l-1
组》0.25μmol
·
l-1
组》0.1μmol
·
l-1
组，且不存在显著差异(p》0.05)(表6)。当探针工作浓度达到0.3μmol
·
l-1
时，高效扩增获得最大dna分子数，故确定0.3μmol
·
l-1
作为罗非鱼无乳链球菌ddpcr反应最适探针工作浓度。
[0089]
表6不同探针工作浓度的ddpcr检测的dna分子数
[0090][0091]
3、退火温度的优化结果
[0092]
引物、探针浓度分别是0.9μmol
·
l-1
和0.3μmol
·
l-1
时，8组不同退火温度的ddpcr扩增的微滴生成数目均在14000以上，结果均成立。随退火温度变化ddpcr检测的dna分子数与退火温度呈二次线性回归规律，55℃组与55.7℃组阳性微滴和阴性微滴分布无明显界
限，56.9℃组、58.8℃组、61.1℃组、63℃组、64.3℃组及65℃组，阴、阳微滴荧光振幅差异明显(图8、表7)。56.9℃组高效扩增，获得最大dna分子数，确定罗非鱼无乳链球菌ddpcr反应最适退火温度为56.9℃。
[0093]
表7不同退火温度ddpcr检测的dna分子数
[0094]
序号退火温度/℃dna分子数平均值
±
标准差/(拷贝
·
μl-1
)1554,166.67
±
30.55255.74,280.00
±
160.00356.94,180.00
±
100.00458.83,993.33
±
115.47561.13,913.33
±
151.446633,866.67
±
50.33764.33,833.33
±
80.838653,173.33
±
130.13
[0095]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0096]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括序列如seq id no.1所示的正向引物和序列如seq id no.2所示的反向引物。2.一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针的序列如seq id no.3所示。3.根据权利要求2所述的ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针的5'修饰有荧光报告基团，3'修饰有荧光淬灭基团。4.根据权利要求3所述的ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的特异性探针，其特征在于，所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。5.权利要求1所述的特异性引物、或权利要求2～4任一项所述的特异性探针在制备ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒中的应用。6.一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的特异性引物和权利要求2～4任一项所述的特异性探针。7.根据权利要求6所述的ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物中正向引物和反向引物的工作浓度均为0.3μmol
·
l-1
～1.1μmol
·
l-1
；和/或特异性探针的工作浓度为0.1μmol
·
l-1
～0.35μmol
·
l-1
。8.一种ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测罗非鱼样品的dna为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和权利要求2～4任一项所述的特异性探针，进行ddpcr扩增。9.根据权利要求8所述的ddpcr检测罗非鱼无乳链球菌的方法，其特征在于，所述ddpcr扩增的反应体系包括：待测罗非鱼样品的dna1μl，ddpcr supermixforprobes10μl，50μmol/l的正向引物和反向引物各0.12～0.44μl，50μmol/l的特异性探针0.04～0.14μl，depc水补至20μl。10.根据权利要求8所述的基于ddpcr法检测罗非鱼无乳链球菌的方法，其特征在于，所述ddpcr扩增的反应程序包括：95℃，10min；94℃，30s，56.9～65℃，1min，40个循环；98℃，10min。

技术总结
本发明公开了一种ddPCR检测罗非鱼无乳链球菌的引物、探针和方法，所述引物包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本发明建立的ddPCR检测罗非鱼无乳链球菌的方法灵敏度高、特异性强、重复性好，且可做到精准定量，更加适用于罗非鱼无乳链球菌感染的早期检测以及鱼苗、种鱼、鱼肉产品、鱼塘环境中微量罗非鱼无乳链球菌的检测，也为罗非鱼养殖业中罗非鱼无乳链球菌长期的防控监测，流行病学研究以及抗生素药物筛选提供了更加精准科学的方案。选提供了更加精准科学的方案。选提供了更加精准科学的方案。


技术研发人员：张险朋 李小军 黄育浩 李永福 王自强 丁文桂 李敏 胡毅军 黄洁莹 龙海鹰
受保护的技术使用者：东莞市动物疫病预防控制中心
技术研发日：2023.02.17
技术公布日：2023/7/12