一种肺腺癌筛查miRNA标志物及其试剂盒

一种肺腺癌筛查mirna标志物及其试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物和分子诊断技术领域，具体涉及一种肺腺癌筛查mirna标志物及其试剂盒。


背景技术：

2.肺腺癌(lung adenocarcinoma)，属肺癌里面的恶性肿瘤，比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，多见于女性。多数腺性肺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部x线检查时被发现，表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移，淋巴转移则发生较晚。tnm分期ⅰ期、ⅱ期、ⅲa期的肺腺癌原则上都可以手术治疗，手术也是最有效的治疗方法。肺腺癌ⅰa期术后一般不用辅助治疗，包括术后化疗。ⅰb期术后辅助化疗存在争议，有些专家认为不需要，有些医学专家认为具有高危因素(组织低分化、脉管/神经浸润、切除范围小等情况)术后要“考虑”辅助化疗。肺腺癌ⅰ期病人若身体状况不好、或者强烈不愿手术者，也可以考虑放射性治疗，但目前不推荐首选。目前肺腺癌治疗方法多样，然而，具体机制及预后相关因素尚不完全明确。
3.现有技术中，肺腺癌的针对技术有低剂量螺旋ct，利用辐射穿透技术；pet-ct，是利用正电子核素标记葡萄糖等人体代谢物作为显像剂，通过病灶对显像剂的摄取来反映其代谢变化、肺癌肿瘤标志物5项联合检测试剂盒，在检测egtm推荐的黄金3项基础上增加检测ca125和scca来提高对肺腺癌检测的灵敏度、“艾肺明”基因甲基化检测试剂盒，通过pcr-荧光探针法对shox2、rassf1a、ptger4三个基因进行甲基化检测。
4.目前早期肺腺癌的诊断多用影像学和生物标志物诊断。影像学低螺旋ct仅从宏观角度分析肺部的病变情况，看不到微观的病理变化；而利用生物标志物对患者进行筛查，能够观察到体内指标的变化，从微观角度揭示患者体内的病理变化，为诊断肺腺癌提供依据。但是甲基化dna灵敏度与特异度不高，容易造成患者漏诊，循环肿瘤dna指标在肺腺癌筛查的作用仍不明确。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上为弥补早期肺腺癌检测技术的缺陷，降低漏诊率，降低筛查费用，提高患者依从性，提供一种肺腺癌筛查mirna标志物及其试剂盒，采用本发明标志物组合可为肺腺癌制定治疗方案和预后判断提供新的依据，以提高患者的临床预后，提高肺腺癌精准治疗预测。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
6.一种肺腺癌筛查mirna标志物，所述所述标志物为hsa-let-7b-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-130b-3p、hsa-mir-139-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-mir-107、hsa-mir-1277-3p、hsa-mir-1283、hsa-mir-1178-3p、hsa-mir-1183、hsa-mir-1203、hsa-mir-1205、hsa-mir-1236-3p、hsa-mir-1254、hsa-mir-1269a、hsa-mir-1270、hsa-mir-1302、hsa-mir-1322。
7.优选地，所述试剂盒包含有权利要求1的血液基于标志物。
1270、hsa-mir-1302、hsa-mir-1322。
22.优选地，所述试剂盒包含有权利要求1的血液基于标志物。
23.优选地，所述试剂盒还包括反转录反应液、扩增检测液、核酸提取试剂、洗涤液、洗脱液、缓冲液、阳性对照、阴性对照。
24.优选地，所的反转录反应液为dntps、反转录酶和引物。
25.优选地，所述扩增检测液dntps、dna taq聚合酶、引物和荧光探针。
26.优选地，所述核酸提取试剂为磁珠、靶标捕获探针。
27.优选地，所述洗涤剂为sds。
28.优选地，所述洗脱液为tween-20。
29.实施例1
30.肺腺癌患者外周血样本mirna靶标选取
31.(1)收集高通量数据，获取mirna表达谱：通过多个高通量数据库获取肺腺癌患者外周血样本mirna表达谱。
32.(2)批量筛查，获得高特异性mirna：利用r语言等软件，对收集到的肺腺癌患者外周血mirna数据进行筛查，挑取20个高特异性mirna，包括hsa-let-7b-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-130b-3p、hsa-mir-139-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-mir-107、hsa-mir-1277-3p、hsa-mir-1283、hsa-mir-1178-3p、hsa-mir-1183、hsa-mir-1203、hsa-mir-1205、hsa-mir-1236-3p、hsa-mir-1254、hsa-mir-1269a、hsa-mir-1270、hsa-mir-1302、hsa-mir-1322。
33.所获得的20个高特异性mirna具有肺腺癌诊断价值：与健康对照组相比，在肺腺癌患者体内，所获20个外周血mirna的表达量具有明显差异性，提示其具有成为诊断肺腺癌生物标志物的可能。另一方面，高差异性提示上述mirna在诊断肺腺癌中具有高敏感性，且mirna本身具有高度的组织特异性。因此，所获得的20个mirna具有高敏感性、高特异性，具有重要临床诊断肺腺癌价值。我们选取了前4高诊断效能mirna的sroc图进行展示(见图1-图2)，曲线下面积越大，诊断健康人群与肺腺癌人群的效能越强。
34.2、血液mirna的实验检测手段
35.利用20个外周血mirna进行肺腺癌诊断，主要包括五大步骤，即准备合适试剂，提取患者mirna，进行反转录、扩增，通过荧光分析获取结果。各个步骤皆在高精度仪器使用下进行，每个步骤都有严格的质控，能够确保筛查结果精准，有效降低漏诊误诊风险。
36.将反转录反应液、扩增检测液、核酸提取试剂、洗涤液、洗脱液、缓冲液、阳性对照、阴性对照、空白对照平衡至室温。
37.混匀试剂：在试剂准备区混匀核酸提取试剂、反转录反应液、扩增检测液。
38.将试剂滴入对应孔板：吸取对应剂量的上述试剂，滴入相应孔板。核酸提取试剂滴入96-孔深孔板(tp)各孔，反转录反应液滴入96-孔pcr板(rp)，扩增检测液滴入另一96-孔pcr板(pp)。
39.(2)外周血mirna靶标提取
40.收集患者外周静脉血，低温保存，随后将阳性对照、阴性对照、空白对照、血液样本放入96-孔深孔板(tp)，用加入洗涤液的kingfisher96-孔深孔磁头上磁头套，收集96-孔深孔板(tp)中磁珠，将磁珠放入含有500μl洗涤液的96-孔深孔板(wp1)，取下磁头，洗掉磁珠，
之后重复操作，直至磁珠全部转入96-深孔板(wp1)。再次用96-孔深孔板磁头和磁头套将96-孔深孔板(wp1)磁珠转入96孔kingfisher板(wp2)，操作同前。后用96-孔pcr磁头套将96孔kingfisher板(wp2)磁珠转入含洗脱液96-孔pcr板(ep)中，操作同前，用pcr封板摸密封，启动热循环仪，温度定为70℃，之后从96-孔pcr板(ep)收集磁珠，吸移5μl洗脱产物，加入有10μl反转录反应液的96-孔pcr板(rp)。加样完毕后，用封板膜密封rp板。
41.(3)mirna反转录为cdna
42.在扩增检测区，混匀96-孔pcr板(rp)液体后，低速离心，放入热循环仪进行反转录。
43.(4)pcr扩增
44.在扩增检测区，将稀释缓冲液加入96-孔pcr板(rp)中，稀释反转录产物，使用移液枪吹打混匀；之后在pcr板(pp)中相应的反应孔中加入稀释的反转录产物；加样完毕后，用封板膜密封pcr板(pp)，在混匀仪上混匀后，低速离心，再放入pcr热循环仪，进行扩增和荧光检测。
45.(5)高精尖仪器检测
46.反应结束后，收集数据，与阳性对照、阴性对照、空白对照三组进行对照，计算出所检测基因的综合评估值。同时，在利用mirna诊断过程中，需要使用热循环仪、离心机、荧光检测仪等精端仪器。团队实验人员熟练掌握各仪器使用，将对各个环节进行精确把控，提高精准度。
47.(6)严格遵循检测要求
48.调节温度、混匀试剂、洗涤样本、进行反转录和扩增、分析结果等步骤，都拥有严格操作要求，包括时间间隔、操作手法、温度调控、分析指标等。在检测过程中，团队遵循检测要求，做到严谨、精确，有效提高检测成功率及准确率。
49.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种肺腺癌筛查mirna标志物，其特征在于，所述所述标志物为hsa-let-7b-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-130b-3p、hsa-mir-139-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-mir-107、hsa-mir-1277-3p、hsa-mir-1283、hsa-mir-1178-3p、hsa-mir-1183、hsa-mir-1203、hsa-mir-1205、hsa-mir-1236-3p、hsa-mir-1254、hsa-mir-1269a、hsa-mir-1270、hsa-mir-1302、hsa-mir-1322。2.一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1的标志物。3.根据权利要求2所述的一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录反应液、扩增检测液、核酸提取试剂、洗涤液、洗脱液、缓冲液、阳性对照、阴性对照。4.根据权利要求3所述的一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所的反转录反应液为dntps、反转录酶和引物。5.根据权利要求3所述的一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所述扩增检测液dntps、dna taq聚合酶、引物和荧光探针。6.根据权利要求3所述的一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂为磁珠、靶标捕获探针。7.根据权利要求3所述的一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所述洗涤剂为sds。8.根据权利要求3所述的一种肺腺癌检测用试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为tween-20。

技术总结
本发明公开一种肺腺癌筛查miRNA标志物及其试剂盒，属于生物和分子诊断技术领域，该试剂盒包括标志物、反转录反应液、扩增检测液、核酸提取试剂、洗涤液、洗脱液、缓冲液、阳性对照、阴性对照。本发明在血液miRNA试剂盒检测肺腺癌兼顾价格和准确性：利用血液miRNA筛查肺腺癌在减少患者费用的同时，还能有效增加筛查的准确性。相比甲基化DNA等血清指标，miRNA具有更高的特异性，尤其可在早期肺腺癌的筛查中发挥更关键的作用。挥更关键的作用。挥更关键的作用。


技术研发人员：唐宇星 陈罡 何融泉 黄志广 罗嘉嫄 李明杰 蔡开腾 黄婉英 刘羽晴 梁子谦
受保护的技术使用者：广西医科大学
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/12