一组封闭多核苷酸及其在单细胞全序列转录组中的应用的制作方法

1.本发明是关于一组封闭多核苷酸及其在单细胞全序列转录组中的应用，属于单细胞技术领域。


背景技术：

2.随着高通量测序技术的发展，转录组测序(rna-seq)已成为获得基因信息、分析基因结构及差异表达、发现新转录本、发现可变剪切等应用的重要手段。但对于绝大部分生物体，现有技术得到的总rna中含有大量核糖体rna(rrna)、看家基因(如细胞骨架肌动蛋白β-actin)以及其他高丰度rna(如血液总rna样本中的免疫球蛋白mrna)。不仅在rna-seq中，而且在单细胞全转录组测序中这些rna都将占用大量的测序数据，不但增加了测序成本，同时也会掩盖其他基因的表达丰富度，增加发现低丰度转录本的难度，非常不利于单细胞转录组序列的研究。因此，如何在测序前针对不同物种有效地去除冗余rna，已成为研究核心技术问题。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的在于提供一组去除核糖体rna(rrna)及线粒体rna(mt rna)的多核苷酸。
4.本发明的另一个目的在于提供上述多核苷酸的应用。
5.根据本发明的一个方面，本发明提供了一组多核苷酸，其包括一条或多条多核苷酸，每条多核苷酸分别与rrna和/或mt rna的核苷酸序列的一部分片段相同；并且，每条多核苷酸的长度为18-100个核苷酸。
6.本发明的多核苷酸主要是用于封闭核糖体rna(rrna)和/或线粒体rna(mt rna)，因此也称为封闭多核苷酸。
7.根据本发明的具体实施方案，本发明的多核苷酸，每条多核苷酸的长度为18-60个核苷酸，进一步优选为30-40个核苷酸。
8.根据本发明的具体实施方案，本发明的多核苷酸，其包括1-50条多核苷酸，优选包括1-29条多核苷酸，进一步优选地包括seq id no.1至seq id no.29所示多核苷酸中的1条、2条或更多条(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25、26、27、28或29条)。
9.进一步优选地，本发明的多核苷酸包括以下组别中的一组或多组：
10.组一：seq id no.1至seq id no.8所示8条多核苷酸中的一条或多条(例如2、3、4、5、6、7或8条)；
11.组二：seq id no.9所示1条多核苷酸；
12.组三：seq id no.10至seq id no.15所示6条多核苷酸中的一条或多条(例如2、3、4、5或6条)；和/或
13.组四：seq id no.16至seq id no.29所示14条多核苷酸中的一条或多条(例如2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14条)。
14.进一步优选地，所述多核苷酸包括以下组别中的一组或多组：
15.组一：seq id no.1至seq id no.8所示8条多核苷酸；
16.组二：seq id no.9所示1条多核苷酸；
17.组三：seq id no.10至seq id no.15所示6条多核苷酸；和/或
18.组四：seq id no.16至seq id no.29所示14条多核苷酸。
19.seq id no.1：gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtac
20.seq id no.2：cctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttc
21.seq id no.3：ttggtcaatttcgtgccagccaccgcggtcacacgatt
22.seq id no.4：cctacgtgatctgagttcagaccggagtaatccaggtcgg
23.seq id no.5：gcccgtgaagaggcgggcataacacagcaagacgagaaga
24.seq id no.6：cattctcctccgcataagcctgcgtcagatt
25.seq id no.7：cctaccgagcctggtgatagctggttgtccaagatagaatc
26.seq id no.8：cctggcgcaatagatatagtaccgcaagggaaagatg
27.seq id no.9：cgactcttagcggtggatcactcggctcgtgcgtcgatga
28.seq id no.10：caccgcccgtcgctactaccgattggatggtttagtgagg
29.seq id no.11：ggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtc
30.seq id no.12：gctcgtagttggatcttgggagcgggcgggcgg
31.seq id no.13：ttcgcgggggggatgcgtgcatttatcagatcaaaacc
32.seq id no.14：ggtgaaattcttggaccggcgcaagacggaccagagcg
33.seq id no.15：gacggggaatcagggttcgattccggagagggagcctgag
34.seq id no.16：cggcagcgccgcggagcctcggttggcctcggatagccgg
35.seq id no.17：ccgtcgccggcagtcgagagtggacgggagcggcgggg
36.seq id no.18：cggcggagcgagcgcacggggtcggcggcgacgtcgg
37.seq id no.19：gggggcgcgccggcgtctcctcgtgggggggcc
38.seq id no.20：cgggagggcgcgcgggtcggggcggcggcggcggtggc
39.seq id no.21：ataactggcttgtggcggccaagcgttcatagcgacgtcg
40.seq id no.22：agtctggcacggtgaagagacatgagaggtgtagaataag
41.seq id no.23：ctagcagccgacttagaactggtgcggacca
42.seq id no.24：atatccgcagcaggtctccaaggtgaacagcctctggc
43.seq id no.25：tgaacatgggtcagtcggtcctgagagatgggcgagcgc
44.seq id no.26：tccgaagtttccctcaggatagctggcgctctcgcagac
45.seq id no.27：gggtgcgggggtgggcgggcggggccgggggtggggtc
46.seq id no.28：tggtaaactccatctaaggctaaataccggcacgagaccg
47.seq id no.29：gaaactaaccaggattccctcagtaacggcgagtgaacag。
48.根据本发明的具体实施方案，本发明的多核苷酸，其可以是经过修饰的dna序列，所述修饰选自由间臂修饰、双脱氧核苷酸修饰、反向dt修饰、硫代修饰、锁核苷酸修饰和磷酸化修饰中的一种或多种。
49.根据本发明的另一方面，本发明还提供了本发明的多核苷酸在单细胞全序列转录
71.(seq id no.30)
72.其中，ctacacgacgctcttccgatct为read1 sequencing primer，jjjjjjjjjjjjjjjjj为cell barcode，nnnnnnnnnnnn为分子标签，ttnnn为逆转录序列，可与rna序列随机结合，其中，每个j、n和n均选自atcg中的任一碱基。
73.2.1.2按照表1配置反应体系
74.表1
75.组分体积/样本3x rt buffer26.6μlrt enzyme5.2μltso2μlreducing buffer1.6μltotal35.4μl
76.根据细胞浓度计算细胞数为3000时的上样体积(μl)和补加nuclease-free water体积(μl)，先加入相应的nuclease-free water至mix吹打混匀后，再加入单细胞悬液(细胞悬液加入前需吹打混匀)，最终单细胞混合液总体积为80μl。
77.2.2按照dd全序列单细胞转录组文库构建试剂盒说明书向芯片中加入对应试剂；
78.芯片通道1：吸取78μl步骤2.1中的细胞相试剂，避免产生气泡；
79.芯片通道2：将室温平衡好的barcoded beads充分振荡30sec，瞬时离心5sec，确保barcoded beads液体内没有气泡，用移液器吸取40μl，吸头尖插入对应的孔位底部，缓慢注入，不要产生气泡；
80.芯片通道3：吸取240μl carrier oil，插入标签3对应的孔位，缓慢注入，不要产生气泡。
81.2.3将gasket挂载于芯片夹具上层，确保gasket孔和芯片孔对齐。
82.2.4dd仪器运行
83.按照dd全序列单细胞rna文库构建试剂盒说明书操作流程将芯片放入dd仪器中，开始运行程序。
84.2.5油包水液滴转移
85.程序运行结束后，点击弹出按钮，取出芯片。使用移液器将对应孔内生成的油包水转移至新的0.2ml的pcr管中。
86.2.6逆转录
87.将步骤2.5中装有油包水的pcr管，放入pcr仪中运行表2所示程序，pcr热盖85℃，体积100μl。
88.表2
[0089][0090]
3.逆转录产物回收
[0091]
3.1反应结束后，向上述pcr管中加入100μl demulsion agent试剂，室温静置2min，瞬时离心；
[0092]
3.2从pcr管底部缓慢吸取120μl透明油相丢弃，不要吸到粉红色反应液；
[0093]
3.3加入180μl振荡混匀后的cleanup beads，轻轻缓慢吹打至少15次，室温孵育10min；
[0094]
3.4孵育结束后，将pcr管置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；
[0095]
3.5保持在磁力架上加入300μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0096]
3.6瞬时离心，用10μl移液器去除所有残留的上清；
[0097]
3.7室温静置2min使乙醇挥发，加入24.5μl nuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置2min；
[0098]
3.8置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清24.3μl至新的0.2ml pcr管中。
[0099]
4.cdna扩增与纯化
[0100]
4.1按照表3配制扩增反应体系，以不加blocker作为阴性对照组。
[0101]
表3
[0102]
组分实验组体积对照组体积2
×
pcr master mix25μl25μlrrna blockers0.35μl替换为h2ocdna primers0.4μl0.4μltotal25.75μl25.75μl
[0103]
上述rrna blockers包含序列seq id no.9到seq id no.29共计21条封闭多核苷酸。
[0104]
cdna primers包含正向引物(seq id no.31：acactctttccctacacgacgctcttccgat)和反向引物(seq id no.32：aagcagtggtatcaacgcagagt)。
[0105]
4.2将配制好的cdna扩增mix加入到3.8步骤纯化后的cdna产物中，吹打混匀10次，瞬时离心，然后进行pcr。设置pcr程序如表4：
[0106]
表4
[0107][0108]
4.3扩增产物纯化
[0109]
4.3.1pcr结束后，向pcr产物加入0.6x dna clean beads，轻轻缓慢吹打至少15次，室温孵育5min；
[0110]
4.3.2孵育结束后，将pcr管置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；
[0111]
4.3.3保持在磁力架上加入200μl 80％乙醇，约30sec后去除上清；重复此步骤一次；
[0112]
4.3.4瞬时离心，用10μl移液器去除所有残留的上清；
[0113]
4.3.5室温静置2min使乙醇挥发，加入24.5μl nuclease-free water充分悬浮磁珠，室温静置2min；
[0114]
4.3.6置于磁力架上吸附至溶液澄清，转移上清24.3μl至新的0.2ml pcr管中。
[0115]
4.4cdna二次扩增
[0116]
4.4.1按照表5配制扩增反应体系，以不加blocker作为阴性对照组。
[0117]
表5
[0118]
组分实验组体积对照组体积2
×
pcr master mix25μl25μlrrna blockers0.35μl替换为h2ocdna primers0.4μl0.4μltotal25.75μl25.75μl
[0119]
rrna blockers与cdna primers序列同前述第一次扩增。
[0120]
4.4.2将配制好的cdna扩增mix加入到4.3.6步骤纯化后的cdna产物中，吹打混匀10次，瞬时离心，然后进行pcr。设置pcr程序如表6：
[0121]
表6
[0122][0123]
4.4.3将步骤4.4.2产物使用0.6x dna clean beads纯化得到cdna产物，大小如图3所示，其长度主要集中在400-2500bp范围内。
[0124]
5.cdna产物使用北京寻因科技公司的dd单细胞全序列转录组文库构建试剂盒进行片段化、末端修复、连接及index添加，得到的文库片段大小如图4中所示，其长度主要集中在400-600bp范围内。
[0125]
6.illumina novaseq 6000测序分析结果如表7所示：
[0126]
表7
[0127] 阴性对照组实验组total reads count134075422810184rrna reads408259632603rrna reads占比30.45％1.16％
[0128]
如表7所示，阴性对照组rrna占比为30.45％，实验组占比为1.16％，rrna去除效率约96％。
[0129]
上述结果表明，本发明中的序列能够有效去除rrna。
[0130]
实施例2
[0131]
本实施例提供了一种去除人的细胞线粒体rna(简称mt rna)的方法。与实施例1的差异仅在于步骤4中cdna扩增中的blocker序列差异。本实施例所用blockers包含序列seq id no.1到seq id no.8共计8条封闭多核苷酸。
[0132]
根据实施例1步骤1-6构建mt rna去除的单细胞全序列转录组文库，illumina novaseq 6000测序分析结果如表8所示：
[0133]
表8
[0134] 阴性对照组实验组total reads count12780841260036mt rna reads871252437mt rna reads占比6.82％0.19％
[0135]
如表8所示，阴性对照组mt rna占比为6.82％，实验组占比为0.19％，mt rna去除效率约97％。
[0136]
实施例3
[0137]
本实施例提供了一种去除rrna和mt rna的方法。与实施例1的差异仅在于步骤1中的细胞类型及步骤4中cdna扩增中的blocker序列差异。本实施例所用细胞为人3000个pbmc细胞，所用blockers包含序列seq id no.1到seq id no.29共计29条封闭多核苷酸。结果见表9。
[0138]
表9
[0139] 阴性对照组实验组total reads count1340754214661734mt rna reads3133224131956mt rna reads占比23.37％0.9％
[0140]
如表9所示，阴性对照组占比为23.37％，实验组占比为0.9％，去除效率约96％。

技术特征：
1.一组多核苷酸，其包括一条或多条多核苷酸，每条多核苷酸分别与rrna和/或mt rna的核苷酸序列的一部分片段相同；并且，每条多核苷酸的长度为18-100个核苷酸。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，每条多核苷酸的长度为为18-60个核苷酸，进一步优选为30-40个核苷酸。3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其包括1-50条多核苷酸，优选包括1-29条多核苷酸，进一步优选地包括seq id no.1至seq id no.29所示多核苷酸中的1条、2条或更多条；更优选地，所述多核苷酸包括以下组别中的一组或多组：组一：seq id no.1至seq id no.8所示8条多核苷酸中的一条或多条；组二：seq id no.9所示1条多核苷酸；组三：seq id no.10至seq id no.15所示6条多核苷酸中的一条或多条；和/或组四：seq id no.16至seq id no.29所示14条多核苷酸中的一条或多条；seq id no.1：gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacseq id no.2：cctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcseq id no.3：ttggtcaatttcgtgccagccaccgcggtcacacgattseq id no.4：cctacgtgatctgagttcagaccggagtaatccaggtcggseq id no.5：gcccgtgaagaggcgggcataacacagcaagacgagaagaseq id no.6：cattctcctccgcataagcctgcgtcagattseq id no.7：cctaccgagcctggtgatagctggttgtccaagatagaatcseq id no.8：cctggcgcaatagatatagtaccgcaagggaaagatgseq id no.9：cgactcttagcggtggatcactcggctcgtgcgtcgatgaseq id no.10：caccgcccgtcgctactaccgattggatggtttagtgaggseq id no.11：ggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtcseq id no.12：gctcgtagttggatcttgggagcgggcgggcggseq id no.13：ttcgcgggggggatgcgtgcatttatcagatcaaaaccseq id no.14：ggtgaaattcttggaccggcgcaagacggaccagagcgseq id no.15：gacggggaatcagggttcgattccggagagggagcctgagseq id no.16：cggcagcgccgcggagcctcggttggcctcggatagccggseq id no.17：ccgtcgccggcagtcgagagtggacgggagcggcggggseq id no.18：cggcggagcgagcgcacggggtcggcggcgacgtcggseq id no.19：gggggcgcgccggcgtctcctcgtgggggggccseq id no.20：cgggagggcgcgcgggtcggggcggcggcggcggtggcseq id no.21：ataactggcttgtggcggccaagcgttcatagcgacgtcgseq id no.22：agtctggcacggtgaagagacatgagaggtgtagaataagseq id no.23：ctagcagccgacttagaactggtgcggaccaseq id no.24：atatccgcagcaggtctccaaggtgaacagcctctggcseq id no.25：tgaacatgggtcagtcggtcctgagagatgggcgagcgcseq id no.26：tccgaagtttccctcaggatagctggcgctctcgcagacseq id no.27：gggtgcgggggtgggcgggcggggccgggggtggggtcseq id no.28：tggtaaactccatctaaggctaaataccggcacgagaccg
seq id no.29：gaaactaaccaggattccctcagtaacggcgagtgaacag。4.根据权利要求1-3任一项所述的多核苷酸，其中，每条多核苷酸是经过修饰的dna序列，所述修饰选自由间臂修饰、双脱氧核苷酸修饰、反向dt修饰、硫代修饰、锁核苷酸修饰和磷酸化修饰中的一种或多种。5.权利要求1-4任一项所述的多核苷酸在单细胞全序列转录组检测中去除核糖体rna(rrna)和/或线粒体rna(mt rna)的应用。6.一种在单细胞全序列转录组检测中去除核糖体rna(rrna)和/或线粒体rna(mt rna)的方法，该方法包括：在构建单细胞全序列转录组文库的pcr扩增中，加入权利要求1-4任一项所述的多核苷酸。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述多核苷酸在pcr反应中浓度为0.02-10μm/条，进一步优选地，多核苷酸浓度为0.05-0.4μm/条。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述pcr反应是cdna扩增反应或文库构建过程中的扩增反应。9.根据权利要求6所述的方法，其中，pcr反应中，dna聚合酶不具有链置换活性，或者，dna聚合酶不具有5
’‑3’
外切酶活性。10.根据权利要求6所述的方法，其是用于人或者小鼠细胞中rrna和/或mt rna的去除。

技术总结
本发明提供了一组封闭多核苷酸及其在单细胞全序列转录组中的应用。本发明首先提供一组多核苷酸，其包括一条或多条多核苷酸，每条多核苷酸分别与rRNA和/或Mt RNA的核苷酸序列的一部分片段相同；并且，每条多核苷酸的长度为18-100个核苷酸。本发明还提供了所述的多核苷酸序列在单细胞全序列转录组检测中去除核糖体RNA(rRNA)和/或线粒体RNA(Mt RNA)的应用。用。


技术研发人员：桑国芹 石焕焕 罗云超 谢莹莹 焦少灼 李宗文
受保护的技术使用者：北京寻因生物科技有限公司
技术研发日：2022.12.30
技术公布日：2023/7/12