一种魁蚶血红蛋白抗菌肽SbHbpe及其应用

一种魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe及其应用。


背景技术：

2.在脊椎动物、无脊椎动物和植物体内广泛分布着一类具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的小分子多肽，称为抗菌肽(antimicrobial peptides,amps)。amps通常由10-60个氨基酸组成，大小从几个kda到十几个kda不等，具有α-螺旋(α-helix strcture)、β-折叠(β-sheetstructure)和延伸结构(extended structure)等多种结构(wang et al.,2018)。amps作为生物体产生的天然免疫成分，除了具有抗菌活性之外，还具有抗癌、抗病毒以及调节免疫等活性，已成为免疫学、分子生物学等众多领域的研究热点。
3.由于细菌耐药性的不断增加和化学防腐剂的潜在毒性，使得人们越来越迫切地需要一种新型的安全的抗菌剂来替代抗生素的使用，而抗菌肽因其具有广谱抗菌活性、独特的抗菌机制，且不易产生抗性突变等特点，显然在药物开发中更具优势，被认为是最有可能替代现有抗生素用于疾病防治的新型抗菌药物。
4.海洋生物约占全球生物多样性总量的一半，它们构成了天然生物活性分子的巨大而宝贵的资源，此外，海洋无脊椎动物具有独特的天然性免疫抵御机制，体内富含防御黏液，蕴藏着丰富的抗菌肽资源，已经从贻贝、牡蛎、文蛤等多种贝类中分离出具有抗菌活性的多肽。近年来，从蚶科贝类的血细胞中提取的某些多肽对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有抑菌作用，可用于医疗和食品等行业。魁蚶(scapharca broughtonii)属软体动物门(mollusca)，双壳纲(bivalvia)，列齿目(taxodonta)，蚶科(arcidae)，蚶属(arca)，具有广温广盐的特性，广泛分布于印度洋及太平洋的热带、亚热带近岸海域，从南非东海岸到中国沿海和日本北部沿海均有分布，是我国沿海重要的经济贝类之一。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种具有非常好的抗菌作用的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe。
6.本发明的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe，其氨基酸序列如下所示：
7.ala glu phe gly lys ile asn gly pro ile lys lys val leu ala，具体如seq id no.1所示。
8.本发明的第二个目的是提供上述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe在制备抗菌药物中的应用。
9.优选的，所述的抗菌药物是治疗海洋性细菌感染性疾病药物。
10.优选的，所述的抗菌药物是抗副溶血性弧菌2013v-1174或溶藻弧菌a056的药物。
11.本发明的第三个目的是提供一种抗菌药物，含有上述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe作为活性成分。
12.优选的，所述抗菌药物还含有药学上可接受的载体。
13.本发明的第四个目的是提供上述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe在制备饲料添加剂中的应用。
14.本发明的第五个目的是提供上述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe在制备防腐剂中的应用。
15.本发明的第六个目的是提供一种饲料添加剂，含有上述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe作为活性成分。
16.本发明的第七个目的是提供一种防腐剂，含有上述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe作为活性成分。
17.本发明通过在线软件对魁蚶血红蛋白序列进行抗菌肽预测并对其结构进行分析，随后对得到的抗菌肽进行抗菌检测，发现其抗菌效果显著。魁蚶抗菌肽sbhbpe对溶藻弧菌a056及副溶血性弧菌2013v-1174的mic分别为250μm、200μm，而且具有较好的α螺旋结构。本发明不仅为进一步了解魁蚶免疫防御机制，提高其应用价值奠定了基础，还为研制新型抗菌药物提供了一种新的途径。
附图说明
18.图1为抗菌肽sbhbpe对溶藻弧菌的抑制作用。
19.图2为抗菌肽sbhbpe对副溶血性弧菌的抑制作用。
20.图3为抗菌肽sbhbpe对溶藻弧菌的时间杀伤。
21.图4为抗菌肽sbhbpe对副溶血性弧菌的时间杀伤。
22.图5为抗菌肽sbhbpe的多肽螺旋图。
23.图6为抗菌肽sbhbpe在魁蚶血红蛋白中的位置的3d模型。
具体实施方式
24.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
25.本发明所涉及的菌种：大肠杆菌dh5α、溶藻弧菌a056、副溶血性弧菌2013v-1174均来自中国科学院南海海洋研究所。
26.本发明所涉及的抗菌肽sbhbpe先用无菌水稀释成浓度为0.01mol/l的母液，在进行mic实验前再稀释成所需浓度梯度的抗菌肽溶液(使用1
×
pbs稀释)。
27.实施例1
28.结合使用antibp server、camp和apd3三个在线软件预测魁蚶血红蛋白源抗菌肽。使用的三个在线软件中的第一个是抗菌肽服务器(antibp)(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/antibp/index.html)，它可以结合魁蚶血红蛋白序列寻找潜在的amps。然后利用抗菌肽收集服务器(camp)(http://www.camp.bicnirrh.res.in/)进一步筛选amps。最后用抗菌肽计算器和预测仪(apd3)(http://aps.unmc.edu/ap/)对amps进行验证，因为apd3可以得到amps的两亲性和电荷性。
29.如下表1所示，总共预测得到1.5～2.0kda的amps 18个。考虑到大量已知的amps具有近似α-螺旋的二级构象结构或β-旋转，通过apd3软件预测，选择其中可能具有α-螺旋结构的4个潜在的amps(s1、s2、s3和s4)。
30.表1.魁蚶血红蛋白抗菌肽的预测
[0031][0032][0033]
上述4个潜在的amps(s1、s2、s3和s4)中进行抗菌活性验证，具体步骤为：
[0034]
a、先将置于-80℃保存的致病菌(大肠杆菌dh5α、溶藻弧菌a056、副溶血弧菌2013v-1174)分别进行小量活化(用接种环蘸取少量菌液于lb培养基上进行平板划线)，37℃过夜培养后挑取平板上的单菌落于50ml lb液体培养基中，37℃下摇床培养6-8h直至对数生长期。最后置于4℃冰箱中保存。
[0035]
b、分别取1μl活化后的菌液，再加入1000μl 1
×
pbs进行稀释(原菌液为10
5-6
fu/ml)。
[0036]
c、稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μm、100μm、125μm、200μm、250μm、300μm、400μm)的稀释肽(pbs稀释)混合(菌体3μl+稀释肽3μl)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μl+稀释肽3μl)置于lb琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜。孵育结束后对菌落进行计数(以pbs作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如表2。
[0037]
表2.四个潜在抗菌肽的抑菌效果
[0038][0039]
注：-表示无抗菌活性
[0040]
由表2可知，魁蚶血红蛋白天然衍生抗菌肽对大肠杆菌dh5α、溶藻弧菌a056和副溶血弧菌2013v-1174均有抑制作用，但根据抑菌效果来看分别为：s2》s3》s1》s4。
[0041]
一、抗菌肽s2对溶藻弧菌a056最小抑制浓度(mic)的测定
[0042]
(1)分别取1μl活化后的溶藻弧菌a056，再加入1000μl 1
×
pbs进行稀释(原菌液为10 5-6
cfu/ml)。
[0043]
(2)稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μm、100μm、125μm、200μm、250μm、300μm、400μm)的抗菌肽s2混合(菌体3μl+稀释肽3μl)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μl+稀释肽3μl)置于lb琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以pbs作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如图1。由图1可知，抗菌肽s2对溶藻弧菌a056最小抑制浓度(mic)为250μm。
[0044]
二、抗菌肽s2对副溶血性弧菌2013v-1174最小抑制浓度(mic)的测定
[0045]
(1)分别取1μl活化后的副溶血性弧菌2013v-1174，再加入1000μl 1
×
pbs进行稀释(原菌液为10
5-6
cfu/ml)。
[0046]
(2)稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μm、100μm、125μm、200μm、250μm、300μm、400μm)的抗菌肽s2混合(菌体3μl+稀释肽3μl)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μl+稀释肽3μl)置于lb琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以pbs作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如图2。由图2可知，抗菌肽s2对副溶血性弧菌2013v-1174最小抑制浓度(mic)为200μm。
[0047]
三、抗菌肽s2对溶藻弧菌a056的时间杀伤实验
[0048]
(1)分别取1μl活化后的溶藻弧菌a056，再加入1000μl 1
×
pbs进行稀释(原菌液为10
5-6
cfu/ml)。
[0049]
(2)稀释后的菌液等体积与250μm的抗菌肽s2混合(菌体3μl+稀释肽3μl)，室温下分别孵育0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μl+稀释肽3μl)置于lb琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以pbs作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如图3。由图3可知，抗菌肽s2对溶藻弧菌a056的最佳杀伤时间为3h。
[0050]
四、抗菌肽s2对副溶血性弧菌2013v-1174的时间杀伤实验
[0051]
(1)分别取1μl活化后的副溶血性弧菌2013v-1174，再加入1000μl 1
×
pbs进行稀释(原菌液为10
5-6
cfu/ml)。
[0052]
(2)稀释后的菌液等体积与200μm的抗菌肽s2混合(菌体3μl+稀释肽3μl)，室温下分别孵育0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h。孵育结束后，将混合液(菌体3μl+稀释肽3μl)置于lb琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以pbs作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如图4。由图4可知，抗菌肽s2对副溶血性弧菌2013v-1174的最佳杀伤时间为3.5h。
[0053]
通过swissmodel在线服务器(https://swissmodel.expasy.org/interactive)对抗菌肽s2的氨基酸序列进行三维结构预测，如图5所示。随后在pymol软件中打开进行编辑，得到抗菌肽s2在魁蚶血红蛋白中的位置的3d模型如图6所示。
[0054]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe，其特征在于，氨基酸序列如下所示：ala glu phe gly lys ile asn gly pro ile lys lys val leu ala。2.权利要求1所述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe在制备抗菌药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物是治疗海洋性细菌感染性疾病药物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物是抗副溶血性弧菌2013v-1174或溶藻弧菌a056的药物。5.一种抗菌药物，其特征在于，含有权利要求1所述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe作为活性成分。6.根据权利要求5所述的抗菌药物，其特征在于，还含有药学上可接受的载体。7.权利要求1所述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe在制备饲料添加剂中的应用。8.权利要求1所述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe在制备防腐剂中的应用。9.一种饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe作为活性成分。10.一种防腐剂，其特征在于，含有权利要求1所述的魁蚶血红蛋白抗菌肽sbhbpe作为活性成分。

技术总结
本发明公开了一种魁蚶血红蛋白抗菌肽SbHbpe及其应用。所述的抗菌肽SbHbpe的氨基酸序列如下所示：Ala Glu Phe Gly Lys Ile Asn Gly Pro Ile Lys Lys Val Leu Ala。本发明对抗菌肽SbHbpe进行抗菌检测，发现其抗菌效果显著：抗菌肽SbHbpe对溶藻弧菌A056及副溶血性弧菌2013V-1174的MIC分别为250μM、200μM，而且具有较好的α螺旋结构。本发明不仅为进一步了解魁蚶免疫防御机制，提高其应用价值奠定了基础，还为研制新型抗菌药物提供了一种新的途径。径。径。


技术研发人员：查珊洁 刘宏星 袁春 郑长锐 包永波
受保护的技术使用者：浙江万里学院
技术研发日：2022.12.26
技术公布日：2023/7/12