一种可用于白血病筛查的分子靶标的制备及其应用

1.本发明属于生命科学与临床医学检测技术领域，具体涉及一种可用于白血病筛查的分子靶标的制备及其应用。


背景技术：

2.白血病是一种严重危害人类生命健康的恶性血液性疾病。目前，白血病的诊断主要依赖于骨髓穿刺术并进行病理活检，对患者伤害性较大。筛选新的白血病早诊靶标并建立可在临床推广的新技术，对于白血病患者提前预警并采取有效的治疗意义重大，也是当前白血病诊疗过程中亟待解决的问题。
3.人类内源性逆转录病毒(human endogenous retroviruses，hervs)是数百万年前感染人类祖先的逆转录病毒的残余，最终整合到人类基因组中，约占人类基因组的8％-9％。在健康人的正常细胞中，herv-k的表达通常受到抑制，几乎不表达或转录水平很低，处于沉默状态。但通过研究，人们发现病理状态下的患者，体内herv-k异常激活。在包括类风湿型关节炎和多发性硬化症在内的自身免疫性疾病中，研究人员发现，与健康人群相比，患者体内herv-kgag和env的表达均显著增加。研究人员在生殖细胞肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤等多种疾病中，检测到患者体内herv-k基因表达水平的显著升高。
4.由于herv-k在肿瘤患者体内的异常表达，因此人们开始逐渐研究herv-k能否作为一种全新的诊断标记物。目前，已经有研究证明herv-k具有诊断肺癌、乳腺癌的潜力。但是这一诊断方法存在局限性，其中，最显著的就是herv-k作为诊断标记物的特异性问题。作为一种逆转录病毒，herv-k在人类进化的过程中，不断进行着扩增和转位，导致其在整个人类基因组中广泛分布。在肿瘤患者中，多个herv-k整合位点均能异常表达和转录。研究显示，在不同种类的恶性肿瘤中，herv-k的激活位点可能并不一致。例如：在前列腺癌细胞系中，研究人员检测到3q12.3位点转录本的表达；而在套细胞淋巴瘤细胞系中，则检测到1q21.12位点转录本的显著升高。其他恶性肿瘤是否也存在和疾病类型相关的特异性herv-k位点的表达，是herv-k作为疾病诊断靶点的关键，同时仅依据herv-k表达水平的升高，无法作为单一疾病的诊断依据，更为关键的是确定疾病相关的herv-k序列，并确定该序列是否异常表达。


技术实现要素：

5.本发明的目的是如何筛查白血病。
6.本发明首先保护用于检测特异dna分子的物质在制备用于筛查白血病的产品中的应用；
7.所述特异dna分子的核苷酸序列如seq id no:3所示。
8.上述应用中，所述用于检测特异dna分子的物质可为(a1)或(a2)：
9.(a1)用于检测所述特异dna分子的特异性扩增引物对；
10.(a2)用于检测所述特异dna分子的探针；所述探针的核苷酸序列与所述特异dna分
子的核苷酸序列互补或反向互补。
11.上述应用中，所述用于检测特异dna分子的物质具体可为引物herv-k f和引物herv-kr组成的引物对；所述引物herv-kf的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述引物herv-kr的核苷酸序列如seq id no:2所示。
12.上述任一所述的应用中，所述用于筛查白血病的产品的使用方法可如下：以待测者血浆的cdna为模板，采用所述引物herv-kf和所述引物herv-kr组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，将该pcr扩增产物进行测序，进行如下判断：如果测序结果中含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者为或疑似为白血病患者；如果测序结果中不含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者不为或疑似不为白血病患者。
13.本发明还保护一种用于筛查白血病的试剂盒，包括用于检测特异dna分子的物质；
14.所述特异dna分子的核苷酸序列如seq id no:3所示。
15.上述试剂盒中，所述用于检测特异dna分子的物质可为(a1)或(a2)：
16.(a1)用于检测所述特异dna分子的特异性扩增引物对；
17.(a2)用于检测所述特异dna分子的探针；所述探针的核苷酸序列与所述特异dna分子的核苷酸序列互补或反向互补。
18.上述试剂盒中，所述用于检测特异dna分子的物质可为引物herv-kf和引物herv-kr组成的引物对；
19.所述引物herv-kf的核苷酸序列如seq id no:1所示；
20.所述引物herv-kr的核苷酸序列如seq id no:2所示。
21.上述任一所述试剂盒具体可由上述任一所述用于检测特异dna分子的物质组成。
22.上述任一所述试剂盒还可包括记载有判断标准的载体；所述判断标准为：如果待测者血浆cdna中含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者为或疑似为白血病患者；如果待测者血浆cdna中不含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者不为或疑似不为白血病患者。
23.上述任一所述试剂盒具体可由上述任一所述用于检测特异dna分子的物质和所述记载有判断标准的载体组成。
24.本发明还保护一种特异dna分子，其核苷酸序列如seq id no:3所示。
25.本发明还保护所述特异dna分子在作为白血病筛查标记物中的应用。
26.上述应用中，如果待测者血浆cdna中含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者为或疑似为白血病患者；如果待测者血浆cdna中不含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者不为或疑似不为白血病患者。
27.本技术的发明人在前期研究工作中发现，在白血病患者外周血中herv-k基因的表达水平存在异常升高的现象。因此，本技术的发明人尝试将白血病的发生与herv-k的异常表达相关联，寻找白血病早期筛查的新靶点。
28.为了解决herv-k诊断白血病的特异性问题，本技术的发明人将二代测序技术引入herv-k的研究中，筛选出白血病患者中特异性表达的herv-k序列(核苷酸序列如seq id no:3所示)，并将其作为白血病的筛查标记物。相比于骨髓穿刺术的病理活检，检测患者外周血中是否特异性表达核苷酸序列如seq id no:3所示的herv-k序列，具有创伤性小、患者
依从性高、检测特异性和灵敏度高、操作简单、取材方便等优点，从而实现对白血病早筛早治疗的目标。本发明对于白血病患者的早期筛查具有重要的应用价值。
附图说明
29.图1为实施例2中临床确诊的部分白血病患者pcr扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
30.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
31.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1、用于筛查白血病的标记物的发现
33.本发明的发明人经过大量实验，发现了用于筛查白血病的标记物，即seq id no:3所示的herv-k序列。
34.用于筛查白血病的标记物的检测步骤依次如下：
35.1、提取待测者外周血的总rna。
36.2、将步骤1得到的待测者外周血的总rna进行逆转录，得到待测者外周血的cdna。
37.反应体系为20μl，由1μl随机引物、4μl 5
×
缓冲液、1μl逆转录酶和无核酸酶水组成。
38.随机引物、5
×
缓冲液和逆转录酶为康为世纪公司的产品，产品目录号为cw2582m(100rxns)。
39.反应条件为：42℃40min；85℃5min。
40.3、以步骤2得到的待测者外周血的cdna为模板，采用引物herv-k f：
[0041]5’‑
ctgaggcaattgcaggagtt-3’(seq id no:1)和引物herv-k r：5
’‑
gctgtctcttcggagctgtt-3’(seq id no:2)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0042]
反应体系为50μl，由25μl premix ex taq
tm
(takara公司的产品，产品目录号为rr902a)、1μl引物herv-k f水溶液(浓度为10μm)、1μl引物herv-k r水溶液(浓度为10μm)、5μl待测者外周血的cdna和18μlrnase free dh2o组成。
[0043]
反应条件为：95℃5min；95℃15s，67℃15s，72℃10s，40个循环；72℃10min；4℃99min。
[0044]
4、将步骤3得到的pcr扩增产物进行纯化，之后核酸定量，最后进行二代测序(测序使用的引物为引物herv-k f或引物herv-k r)，得到测序结果。
[0045]
5、进行如下判断：如果测序结果中含有seq id no:3所示的herv-k序列，则待测者患有白血病；如果测序结果中不含有seq id no:3所示的herv-k序列，则待测者不患有白血病。
[0046]
实施例2、实施例1发现的用于筛查白血病的标记物的敏感性和特异性评估
[0047]
待测者分别为40例临床确诊的淋巴瘤患者、40例临床确诊的白血病患者和64例健康人。40例临床确诊的淋巴瘤患者组成淋巴瘤组。40例临床确诊的白血病患者组成白血病组。64例健康人组成健康组。
[0048]
每个待测者进行如下实验：
[0049]
1、提取待测者外周血的总rna。
[0050]
2、将待测者外周血的总rna进行逆转录，得到待测者外周血的cdna。
[0051]
反应体系为20μl，由1μl随机引物、4μl 5
×
缓冲液、1μl逆转录酶和无核酸酶水组成。
[0052]
反应条件为：42℃40min；85℃5min。
[0053]
3、以待测者外周血的cdna为模板，采用引物herv-k f和引物herv-k r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0054]
反应体系为50μl，由25μl premix ex taq
tm
、1μl引物herv-k f水溶液(浓度为10μm)、1μl引物herv-k r水溶液(浓度为10μm)、5μl待测者外周血的cdna和18μlrnase free dh2o组成。
[0055]
反应条件为：95℃5min；95℃15s，67℃15s，72℃10s，40个循环；72℃10min；4℃99min。
[0056]
4、将pcr扩增产物进行纯化，之后核酸定量，最后进行二代测序(测序使用的引物为引物herv-k f或引物herv-k r)，得到测序结果。
[0057]
5、对测序结果进行分析，包括与ucsc上的参考基因组(grch38/hg38)进行比对和分析测序结果中是否含有seq id no:3所示的herv-k序列。
[0058]
实验结果如下：
[0059]
(1)将含有seq id no:3所示的herv-k序列的测序结果与ucsc上的参考基因组(grch38/hg38)进行比对。结果表明，seq id no:3所示的herv-k序列可以匹配到多个人类基因组位点(即seq id no:3所示的herv-k序列在人类基因组的整合位点)，具体见表1所示。
[0060]
表1
[0061]
染色体起始位置终止位置chr8139460953139461076chr745834734583596chr745919774592100chr67771798477718107chr5156658753156658876chr192763866427638787chr125832850658328629chr1155627713155627836chr221894668218946805
[0062]
(2)分别将步骤3得到的pcr扩增产物、阳性对照(人工合成的dna双链分子，核苷酸序列如seq id no:3所示)和阴性对照(水)进行1％琼脂糖凝胶电泳。
[0063]
部分结果见图1(dl2,000为dnamarker，泳道1-7为临床确诊的白血病患者，+为阳
性对照，-为阴性对照)。结果表明，临床确诊的白血病患者的pcr扩增产物均与阳性对照的大小一致，且条带单一。由此可见，步骤3中的反应体系和反应条件适用于seq id no:3所示的herv-k序列的扩增。
[0064]
(3)在不同人群中，用于筛查白血病的标记物(即seq id no:3所示的herv-k序列)的检出率及占比情况的统计分析见表2和表3。统计结果表明，seq id no:3所示的herv-k序列在白血病患者中占比显著高于淋巴瘤患者(p《0.0001)和健康人群(p《0.0001)，说明seq id no:3所示的herv-k序列可以作为筛查白血病的标记物。并且该标记物在白血病患者中检测阳性率显著高于淋巴瘤患者(χ2＝13.115，p＜0.001)和健康对照人群(χ2＝20.708，p＜0.0001)，说明seq id no:3所示的herv-k序列在不同的疾病中存在表达差异，seq id no:3所示的herv-k序列的表达水平和检出率与白血病相关。
[0065]
表2.敏感性检测结果
[0066][0067]
表3.特异性检测结果
[0068][0069]
(4)进一步，本技术的发明人根据白血病患者的亚型，将白血病患者分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)，并且根据aml患者的分型，将aml患者进行进一步分组(分为aml m0-m2、aml m3-m4、aml m5、amlm6-m7)，对各组白血病患者的测序结果进行统计分析(one-wayanova)，结果见表4。统计结果表明，在不同亚型的白血病患者中均可以检测到用于筛查白血病的标记物(即seq id no:3所示的herv-k序列)，各组标记物之间的占比没有统计学差异；同时各亚型白血病的标记物占比均显著高于健康人群(p《0.0001)。
[0070]
表4.不同白血病分期中herv-k序列的检测情况
[0071][0072][0073]
上述结果表明，seq id no:3所示的herv-k序列具有白血病疾病特异性，能够用于白血病的筛查，同时筛查方法简单，检测成本低，敏感性与特异性高。
[0074]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.用于检测特异dna分子的物质在制备用于筛查白血病的产品中的应用；所述特异dna分子的核苷酸序列如seq id no:3所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测特异dna分子的物质为(a1)或(a2)：(a1)用于检测所述特异dna分子的特异性扩增引物对；(a2)用于检测所述特异dna分子的探针；所述探针的核苷酸序列与所述特异dna分子的核苷酸序列互补或反向互补。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于检测特异dna分子的物质为引物herv-kf和引物herv-kr组成的引物对；所述引物herv-kf的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述引物herv-kr的核苷酸序列如seq id no:2所示。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用于筛查白血病的产品的使用方法如下：以待测者血浆的cdna为模板，采用引物herv-k f和引物herv-k r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，将该pcr扩增产物进行测序，进行如下判断：如果测序结果中含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者为或疑似为白血病患者；如果测序结果中不含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者不为或疑似不为白血病患者。5.一种用于筛查白血病的试剂盒，包括用于检测特异dna分子的物质；所述特异dna分子的核苷酸序列如seq id no:3所示。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测特异dna分子的物质为(a1)或(a2)：(a1)用于检测所述特异dna分子的特异性扩增引物对；(a2)用于检测所述特异dna分子的探针；所述探针的核苷酸序列与所述特异dna分子的核苷酸序列互补或反向互补。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测特异dna分子的物质为引物herv-kf和引物herv-k r组成的引物对；所述引物herv-kf的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述引物herv-kr的核苷酸序列如seq id no:2所示。8.根据权利要求5至7任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括记载有判断标准的载体；所述判断标准为：如果待测者血浆cdna中含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者为或疑似为白血病患者；如果待测者血浆cdna中不含有核苷酸序列如seq id no:3所示的dna序列，则待测者不为或疑似不为白血病患者。9.一种特异dna分子，其核苷酸序列如seq id no:3所示。10.权利要求9所述特异dna分子在作为白血病筛查标记物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种可用于白血病筛查的分子靶标的制备及其应用。所述分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。如果待测者血浆cDNA中含有核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，则待测者为白血病患者；如果待测者血浆cDNA中不含有核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，则待测者不为白血病患者。本发明具有创伤性小、患者依从性高、检测特异性和灵敏度高、操作简单、取材方便等优点，对于白血病患者的早期筛查具有重要的应用价值。的早期筛查具有重要的应用价值。


技术研发人员：李林 李韩平 李天夫 李敬云 刘永健 韩婧婉 贾磊 王晓林 张伯寒
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/7/12