一种纳米催化剂及其制备方法及和应用

1.本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种纳米催化剂及其制备方法及和应用。


背景技术：

2.普鲁士蓝纳米粒子(prussianblue,pb)是一种常见的蓝色染料，于1706年被发现，其结构是由fe(ⅱ)和fe(ⅲ)与氰基(-cn-)相互配位作用而构成。普鲁士蓝具有优异的磁、电及光学性能。
3.具体地，pb具有优良的电催化性能，它能够高效催化h2o2的还原，而且这种催化作用即使在干扰物质存在的情况下仍具有很高的特异性，因此普鲁士蓝常被称为人工过氧化物酶，并被广泛用于生物传感器的构建。例如，pb能够催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)与过氧化氢反应产生蓝绿色的氧化型tmb，但其催化效率有待提高。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米催化剂及其制备方法及和应用，本发明的纳米催化剂催化tmb与过氧化氢反应产生蓝绿色的氧化型tmb的催化效率相对于pb有显著提高。
5.本发明提供了一种纳米催化剂，包括壳体和核体，所述核体为普鲁士蓝纳米粒子；所述壳体为血小板膜；所述血小板膜表面修饰有肿瘤细胞的适配体；在血小板膜表面还均匀的修饰有辣根过氧化物酶。
6.优选的，所述肿瘤细胞的适配体包括pd-l1适配体。
7.本发明还提供了上述方案所述纳米催化剂的制备方法，包括以下步骤：
8.将血小板膜和普鲁士蓝纳米粒子混合，得到pb/pm纳米粒子；
9.将生物素标记的辣根过氧化物酶、修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体和羧基活化剂混合，进行活化反应，得到活化产物；
10.将所述pb/pm纳米粒子和所述活化产物混合，进行脱水缩合反应，得到纳米催化剂。
11.本发明还提供了上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法制备得到的纳米催化剂在催化过氧化氢参与的氧化还原反应中的应用。
12.优选的，所述过氧化氢参与的氧化还原反应包括过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺的显色反应。
13.本发明还提供了上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法制备得到的纳米催化剂在制备检测肿瘤细胞的试剂或试剂盒中的应用。
14.优选的，所述肿瘤细胞包括4t1细胞、b16f10细胞、hepg2细胞或ct26细胞。
15.本发明还提供了一种肿瘤细胞检测试剂盒，包括修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板、上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法制备得到的纳米催化剂、过氧化氢和
3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
16.本发明还提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的非诊断目的的肿瘤细胞定性检测方法，包括以下步骤：
17.在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗；
18.在第一冲洗后的微孔板中加入上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗；
19.在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；
20.对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，若a-a0＞0，则表示待测样本中存在待测肿瘤细胞；若a-a0＝0，则表示待测样本中不存在待测肿瘤细胞。
21.本发明还提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的非诊断目的的肿瘤细胞定量检测方法，包括以下步骤：
22.在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗；
23.在第一冲洗后的微孔板中加入上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗；
24.在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；
25.对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，将所述a和a0的差值带入预定的标准曲线中得到待测肿瘤细胞浓度；所述预定的标准曲线为a和a0的差值与肿瘤细胞浓度之间的线性关系曲线。
26.本发明提供了一种纳米催化剂pb/pm/hrp/apt，包括壳体和核体，所述核体为普鲁士蓝纳米粒子；所述壳体为血小板膜；所述血小板膜表面修饰有肿瘤细胞的适配体；在血小板膜表面还均匀的修饰有辣根过氧化物酶。本发明的pb/pm/hrp/apt的类pod活性相比于pb有显著提升，这是由于pb和hrp的协同催化，为h2o2的催化提供了更多活性位点，使pb/pm/hrp/apt具有显著的催化性能。此外，本发明借助适配体的修饰和pm本身特异性靶向肿瘤细胞的能力，可以有效的到达肿瘤细胞部位，进而与肿瘤细胞结合以便于后续的催化反应。
附图说明
27.图1为纳米催化剂pb/pm/hrp/apt的制备过程；
28.图2为透射电子显微镜图像，其中a为pb的透射电子显微镜图像；b为pb/pm的透射电子显微镜图像；
29.图3为pb、pb/pm、pb/pm/hrp、pb/pm/hrp/apt的粒径分布；
30.图4为pb、pm、pb/pm、pb/pm/hrp、pb/pm/hrp/apt的电位变化；
31.图5为游离的pb/pm、fitc与pb/pm/hrp/apt的荧光光谱；
32.图6不同反应体系的紫外可见吸收光谱；
33.图7为pb/pm/hrp/apt+tmb+h2o2反应体系吸收曲线与时间的关系；
34.图8为pb/pm/hrp/apt+tmb+h2o2反应体系保持pb/pm/hrp/apt与tmb浓度不变，改变h2o2浓度得到的h2o2浓度与吸光度之间的线性拟合图像；
35.图9为4t1细胞的定量检测结果，其中a为pb/pm/hrp/apt浓度为0.2mg/ml时，l02细胞浓度与吸光度之间的关系；b为pb/pm/hrp/apt浓度为0.2mg/ml时，4t1细胞浓度与吸光度之间的线性拟合图像。
具体实施方式
36.本发明提供了一种纳米催化剂，以血小板膜为壳体，包裹有普鲁士蓝纳米粒子；所述血小板膜表面修饰有肿瘤细胞的适配体；在血小板膜表面还均匀的修饰有辣根过氧化物酶。
37.在本发明中，所述肿瘤细胞的适配体包括pd-l1适配体。
38.在本发明中，所述pd-l1适配体适用于表面过表达pd-l1的肿瘤；所述表面过表达pd-l1的肿瘤优选的包括肺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤中的一种或几种。
39.本发明的纳米催化剂借助血小板膜与pd-l1适配体对肿瘤细胞的亲和作用，纳米催化剂到达肿瘤细胞部位后，会借助其表面肿瘤细胞适配体与肿瘤细胞表面过表达的pd-l1进行结合，进而可以检测表面过表达pd-l1的肿瘤细胞。
40.本发明提供了一种纳米催化剂的制备方法，包括以下步骤：
41.将血小板膜和普鲁士蓝纳米粒子混合，得到pb/pm纳米粒子；
42.将生物素标记的辣根过氧化物酶、修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体和羧基活化剂混合，进行活化反应，得到活化产物；
43.将所述pb/pm纳米粒子和所述活化产物混合，进行脱水缩合反应，得到纳米催化剂。
44.本发明首先将血小板膜和普鲁士蓝纳米粒子混合，得到pb/pm纳米粒子。在本发明中，所述普鲁士蓝纳米粒子溶解于磷酸盐缓冲液(pbs)中；所述普鲁士蓝纳米粒子的工作浓度优选为0.2～0.6mg/ml，更优选为0.2mg/ml；所述血小板膜和普鲁士蓝纳米粒子的体积比优选为(1.2～1.5)：1。本发明对所述普鲁士蓝纳米粒子和血小板膜的来源没有特殊限制，采用本领域常规方法制备或者来源于常规市售即可。在本发明中，所述混合优选的包括超声混合，所述超声混合的时间优选为30～35min。在所述超声混合的过程中，优选的还包括在混合体系中加入冰，以保护膜蛋白的活性。在所述混合后，优选的还包括将混合后的物料放置在pbs缓冲液中于4℃过夜，对过夜后的物料离心，取沉淀，将沉淀溶于pbs缓冲液，重复离心和重悬沉淀的步骤3次，以去除多余的细胞膜，得到纯化的pb/pm纳米粒子；所述离心的转速优选为8000rpm；每次离心的时间优选为6min。在本发明中，所述pb/pm纳米粒子分散在pbs缓冲液中保存。
45.本发明将生物素标记的辣根过氧化物酶、修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体和羧基活化剂混合，进行活化反应，得到活化产物。
46.在本发明中，所述生物素标记的辣根过氧化物酶(hrp-bio)、修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体和羧基活化剂分别以溶液的形式添加；所述羧基活化剂包括n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基氨基丙基二酰亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；所述生物素标记
的辣根过氧化物酶的溶液和修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体的溶液的体积比优选为1：1；所述hrp-bio的溶液中hrp-bio的浓度优选为1mg/ml；所述适配体的溶液中适配体的浓度优选为10μmol/ml；所述生物素标记的辣根过氧化物酶的溶液和edc的溶液的体积比优选为5：1；所述edc的溶液中edc的浓度优选为0.5m；所述生物素标记的辣根过氧化物酶的溶液和nhs的溶液的体积比优选为5：1；所述nhs的溶液中nhs的浓度优选为0.5m。
47.在本发明中，所述活化反应的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h；所述活化反应的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述活化反应的作用是活化羧基，活化羧基后的hrp-bio、适配体和含有氨基的pb/pm(pm为血小板膜，膜上自带氨基)能够发生脱水缩合反应。
48.得到活化产物后，本发明将所述pb/pm纳米粒子和所述活化产物混合，进行脱水缩合反应，得到纳米催化剂。
49.在本发明中，所述pb/pm纳米粒子的工作浓度优选为0.2mg/ml；所述pb/pm纳米粒子和辣根过氧化物酶的质量比优选为(10～20)：1，更优选为15：1；所述pb/pm纳米粒子和修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体的质量比优选为(50～60)：1，更优选为55：1。
50.所述脱水缩合反应的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述脱水缩合反应的时间优选为10～15h，更优选为12h。在所述脱水缩合反应后，优选的还包括对脱水缩合的产物进行固液分离，收集固体组分，得到纳米催化剂；所述固液分离的方式优选为离心。在本发明中，所述离心的温度优选为4℃；所述离心的转速优选为12000rpm；所述离心的时间优选为5min。
51.本发明还提供了上述方案所述的制备方法制备得到的纳米催化剂在催化过氧化氢参与的氧化还原反应中的应用。
52.在本发明中，所述过氧化氢参与的氧化还原反应优选的包括过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺的显色反应。
53.本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的纳米催化剂在制备检测肿瘤细胞的试剂或试剂盒中的应用。
54.在本发明中，所述肿瘤优选为表面过表达pd-l1的肿瘤；所述表面过表达pd-l1的肿瘤优选的包括肺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤中的一种或几种；所述肿瘤细胞更优选的包括4t1细胞、b16f10细胞、hepg2细胞或ct26细胞。
55.本发明还提供了一种肿瘤细胞检测试剂盒，包括修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板、上述方案所述制备方法制备得到的纳米催化剂、过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
56.在本发明中，所述纳米催化剂的工作浓度优选为0.2mg/ml；所述过氧化氢的工作浓度优选为4mol/l；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的工作浓度优选为0.4mol/l。
57.本发明借助肿瘤细胞适配体和肿瘤细胞之间的结合相互作用，在微孔板上均匀的排列肿瘤细胞的适配体，从而有效实现肿瘤细胞的捕获；微孔板捕获肿瘤细胞后，在微孔板中加入具有良好催化性能的纳米催化剂pb/pm/hrp/apt，冲洗掉未结合的pb/pm/hrp/apt；随后加入h2o2以及tmb显色液；pb/pm/hrp/apt作为催化剂，可以催化tmb被h2o2氧化成蓝色产物oxtmb。然后将微孔板放入酶标仪中，根据标准曲线可以实现肿瘤细胞的定量分析。本发明为肿瘤细胞的检测提供了一种可行性较高的操作模式。这种结合检测方法作为一种很有前途的治疗策略，不仅操作简单明了，而且显著提高了对肿瘤细胞的捕获和定量分析能力。
58.在本发明中，所述微孔板利用生物素和亲和素的反应将肿瘤细胞的适配体修饰在微孔板上。
59.本发明还提供了本发明还提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的非诊断目的的肿瘤细胞定性检测方法，包括以下步骤：
60.在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗；
61.在第一冲洗后的微孔板中加入上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗；
62.在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；
63.对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，若a-a0＞0，则表示待测样本中存在待测肿瘤细胞；若a-a0＝0，则表示待测样本中不存在待测肿瘤细胞。
64.本发明首先在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗。
65.在本发明中，所述待测样本的加入量优选为1ml/孔；所述第一孵育的时间优选为4h；所述第一孵育的温度优选为37℃。在本发明中，所述第一冲洗采用的试剂优选为pbs缓冲液，所述第一冲洗的次数优选为三次，所述第一冲洗的作用是去除微孔板上未结合的细胞。
66.本发明对修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
67.本发明在第一冲洗后的微孔板中加入上述方案所述制备方法制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗。
68.在本发明中，所述纳米催化剂的工作浓度优选为0.2mg/ml；所述纳米催化剂的加入量优选为1ml/孔。
69.在本发明中，所述第二孵育的时间优选为2h；所述第二孵育的温度优选为37℃。
70.在本发明中，所述第二冲洗采用的冲洗剂优选为pbs缓冲液；所述第二冲洗的次数优选为3次；所述第二冲洗的作用是去除未结合的纳米催化剂。后续根据结合纳米催化剂的多少，催化反应的结果不同，从而起到定量分析的目的。
71.本发明在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，若a-a0＞0，则表示待测样本中存在待测肿瘤细胞；若a-a0＝0，则表示待测样本中不存在待测肿瘤细胞。
72.本发明还提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的非诊断目的的肿瘤细胞定量检测方法，包括以下步骤：
73.在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗；
74.在第一冲洗后的微孔板中加入上述方案所述的纳米催化剂或者所述的制备方法
制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗；
75.在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；
76.对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，将所述a和a0的差值带入预定的标准曲线中得到待测肿瘤细胞浓度；所述预定的标准曲线为a和a0的差值与肿瘤细胞浓度之间的线性关系曲线。
77.在本发明中，检测反应产物的450nm处的吸光度优选的采用酶标仪进行。通过酶标仪检测波长在450nm处的吸光度值，即可得到预定的标准曲线及定量结果。
78.在本发明中，所述预定的标准曲线优选为的式1所示；
79.y＝0.2664x+0.4241，r2＝0.991式1，式1中y表示a-a0，x表示待测肿瘤细胞浓度。
80.在本发明中，下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
81.实施例1
82.本实施例借助4t1细胞适配体和4t1细胞之间的结合相互作用，在微孔板上均匀的排列4t1细胞适配体as1411，从而有效实现4t1细胞的捕获。并构建了基于pb和天然辣根过氧化物酶(hrp)相结合的高效率催化剂，研究了pb/pm/hrp/apt的pod样活性，并用于检测和定量分析4t1细胞。pb作为一种高效的类过氧化物酶,被pm包裹，使其易于表面修饰。hrp的修饰可以与pb发挥良好的协同作用，达到更好的催化效果。此外，pd-li适配体在pb/pm/hrp上修饰，形成的pb/pm/hrp/apt具有靶向4t1细胞的能力(图1)。在纳米催化剂pb/pm/hrp/apt存在下，tmb被h2o2氧化成oxtmb。此外，还评估了功能化微孔板和纳米催化剂的性能，包括特异性、准确性和适用性。结果表明该策略可以有效地用于4t1细胞的检测和定量分析，这为4t1细胞的灵敏、准确检测提供了一个有效的平台。
83.1、方法
84.1)材料和试剂
85.聚乙烯吡咯烷酮(pvp)购自上海源叶生物科技有限公司。k3[fe(cn)6]购自上海麦克林生化科技有限公司。n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基氨基丙基二酰亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)购自上海阿拉丁生物化学技术有限公司。fitc标记链霉亲和素(fitc-avi)及hrp标记的生物素(hrp-bio)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0086]
pd-l1适配体序列：
[0087]
(5
’‑
cooh-acgggccacatcaactcattgatagacaatgcgtccact gcccgt-3’，seq id no.1)；
[0088]
as1411-bio序列：
[0089]
(5
’‑
bio-ggtggtggtggttgtggtggtggtgg-3’，seq id no.2)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0090]
hoechst33342由北京solarbio科技有限公司提供。所有其他试剂均为分析纯试剂，无需进一步纯化即可直接使用。实验中使用的所有水都是经过消毒的超纯水。所有玻璃器皿在使用前都用新鲜王水(hcl/hno3＝3:1，v/v)清洗。
[0091]
2)仪器
[0092]
用透射电镜(tem)对产物进行了表征(jem-2100，jeol)。使用f-4600荧光分光光度
计(hitachi)对样品荧光进行检测。使用安捷伦紫外可见分光光度计cary-60测定合成材料的紫外吸收光谱。通过动态光散射(dls)测量平均粒径和zeta电位，使用带有物镜(
×
20)的激光共聚焦扫描显微镜(clsm)(nikonc2plus)进行共焦荧光成像研究。利用美国biotekepoch全波长酶标仪实现细胞数量实验的分析测试。
[0093]
3)微孔板包被
[0094]
用碳酸盐缓冲液将亲和素配置至0.1mg/ml，取1000μl/孔加到微孔板，4℃条件下孵育12h后，用pbst缓冲溶液(pbst缓冲液:0.1mol/l，ph7.4，含2mmol/lmgcl2和0.12％吐温20)清洗3次，每次5min，拍干。然后加入1000μl/孔1％的牛血清白蛋白(bsa)反应1h，封闭孔板。用pbst洗涤3次得到亲和素修饰的微孔板。接下来，加入1000μlas1411-bio(10μmol/ml)，孵育2h。最后用pbst缓冲溶液清洗未结合的as1411-bio，即可得到适体包被的微孔板。
[0095]
4)pb的合成
[0096]
在25℃条件下，将3g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)加入250ml三颈烧瓶中，加80ml去离子水，并在连续搅拌下溶解。接下来，在连续搅拌的条件下加入264mgk3[fe(cn)6]和hcl(0.8ml，0.1mol/l)，搅拌30min混合均匀，然后在连续搅拌下将三颈烧瓶放入油温80℃的油浴锅中，在恒温油浴中不搅拌加热20h，20h后即可获得pbs。接下来，将pb用无水乙醇和去离子水离心洗涤5次。最后，将纯化后的pb分散在10ml的pbs中，密封保存于4℃。
[0097]
5)pm的获取
[0098]
取10ml小鼠全血1500rpm转速离心10min。上清液被分离为富含血小板的血浆(prp)。prp以3000rpm离心20min后，沉淀用pbs缓冲液洗涤并重复离心，然后获得血小板。血小板在-80℃下冷冻，在室温下解冻，此过程重复三次。通过以8000rpm离心10min获得膜，用含有蛋白酶抑制剂的pbs洗涤，并用超声处理5min，得到的pm分散1mlpbs中，-20℃保存备用。
[0099]
6)pb/pm纳米粒子的合成
[0100]
将上述配制的120μlpm溶液与100μlpb(0.2mg/ml)混合，超声35min，得到pb/pm。为了保持膜蛋白的活性，在超声过程中加入冰。最后，将新制备的pb/pm放置在pbs缓冲液中于4℃过夜。接下来，8000rpm离心6min，弃上清，将沉淀溶于pbs溶液。此过程重复三次以去除多余的细胞膜，得到纯化的pb/pm，将其分散在1mlpbs溶液中并放置。
[0101]
7)pb/pm/hrp/apt的合成
[0102]
为了完成pb/pm的表面修饰，首先将50μl浓度为0.5mg/ml的hrp-bio溶液，50μl浓度为10μmol/ml的pd-l1适配体溶液，10μl浓度为0.5m的edc溶液，10μl浓度为0.5m的nhs溶液，4℃条件下摇晃1h以活化羧基。然后将活化后的hrp-bio与pd-l1适配体转移至含有1ml浓度为0.5mg/ml的pb/pm的离心管中并混合均匀，4℃下摇晃12h。离心分离，弃上清液，得到pb/pm/hrp/apt。随后，将产物与10μl浓度为0.5mg/ml的fitc-avi溶液混合孵育1h，即可得到fitc荧光基团修饰的pb/pm/hrp/apt。
[0103]
8)细胞培养
[0104]
所有参与实验的4t1细胞和l02细胞在37℃恒温恒湿箱中培养，湿度为95％，co2浓度为5％。细胞培养基为dmem，含10％胎牛血清和1％双抗体(青霉素-链霉素)。
[0105]
9)检测细胞
[0106]
加入适体包被的微孔板中加入100μl不同浓度的细胞，孵育4h后采用pbs缓冲液反
复轻柔的洗涤3次,除去未附着的细胞。接下来每孔加入100μl的pb/pm/hrp/apt(0.2mg/ml)，随后加入10μl的h2o2(10mol/l)以及10μltmb显色液。反应5min后，最后用酶标仪对吸光度值进行测定。
[0107]
2、结果与讨论
[0108]
1)设计策略
[0109]
酸性环境中，以[fe(cn)6]
3-作为前体，pvp作为保护剂，可以缓慢释放亚铁离子并被氧化为铁离子。形成的铁离子可以与未分解的离子反应形成pbs。由于反应过程缓慢且np的单分散性高，因此该方法被认为是制备pb的最佳方法，并且制得的pb具有良好的催化性能。接下来，为了完成pb的表面修饰，利用反复冻融法从血小板中获得了血小板膜(pm)，并将pm通过超声法结合到pb的表面上。pm蛋白的伯胺为细胞表面工程提供了稳定的锚定。最后，通过edc、nhs做活化剂，活化hrp和pd-l1适配体上的羧基，通过脱水缩合反应在pb/pm上结合hrp和pd-l1适配体，从而获得纳米催化剂pb/pm/hrp/apt。在酸性条件下，pb可被h2o2氧化成柏林绿(bg)或普鲁士黄(py)，py/bg的氧化还原电位介于oxtmb/tmb和h2o2/h2o的氧化还原电位之间。因此，电子可以通过py/bg容易地从tmb转化为h2o2。从文献报道可知，tmb的pka约为4.2。因此，tmb在酸性介质中带正电荷。总的来说，在优化的反应条件下，zeta电位为负的pb可以吸附tmb并促进电子转移。hrp的负载为h2o2提供了更多的活性位点，这导致纳米催化剂对h2o2的亲和力显著增加，从而增强了纳米催化剂的过氧化物酶活性。
[0110]
此外，当不同种类的细胞被接种到经过适体包被的微孔板中时，由于微孔板的选择性，可以特异性的捕获4t1细胞并对其进行检测和定量分析。4t1细胞被成功捕获到微孔板中后，加入经过上述方法制备的具有良好催化性能的纳米催化剂pb/pm/hrp/apt。随后加入h2o2以及tmb显色液。pb/pm/hrp/apt作为催化剂，可以催化tmb被h2o2氧化成蓝色产物oxtmb。因此，我们利用纳米酶pb和hrp的协同作用，可以更好的发挥催化剂的功能。并借助适配体pd-l1适配体的修饰和pm本身特异性靶向肿瘤细胞的能力，可以有效的到达肿瘤细胞部位。此外，微孔板特异性捕获4t1细胞，起到严格筛选细胞的功能。二者的有效结合，可以有效的对4t1细胞实现定性和定量分析。
[0111]
2)pb/pm/hrp/apt的表征
[0112]
首先对纳米催化剂pb/pm/hrp/apt的理化性质进行表征。如图2中的a所示，透射电子显微镜(tem)成像观察到制备的pb的尺寸大小均一且分布均匀。如图2中的b所示，pb在包裹pm后的尺寸明显增大，且呈现核壳结构。使用动态光散射(dls)检测显示，在包裹pm后pb的流体动力学直径增加了约15nm,与tem成像观察到pb/pm核壳结构的尺寸相一致。接下来对经过hrp和pd-l1适配体的修饰后的纳米催化剂pb/pm/hrp/apt进行检测，其粒径最终约为239.3nm(图3)。zeta电位结果表明pm涂覆成功，因为pb核的表面电荷在涂覆后增加到大约pm的表面电荷(图4)。此外，荧光光谱显示，与游离的pb/pm相比，pb/pm/hrp/apt带有fitc荧光基团的特征吸收峰，这说明pb/pm/hrp/apt的成功制备(图5)。最后对纳米催化剂pb/pm/hrp/apt进行紫外可见吸收光谱(uv-vis)测定，在260nm出现pd-l1适配体的特征吸收峰。以上实验数据表明纳米催化剂pb/pm/hrp/apt的成功制备。
[0113]
4.2pb/pm/hrp/apt的类过氧化物酶(pod)活性
[0114]
在验证了pb/pm/hrp/apt的成功制备后，接下来进行pb/pm/hrp/apt催化的分解反应，以表征pb/pm/hrp/apt的催化性能。tmb作为一种典型的过氧化物酶底物，被用来表征
pb/pm/hrp/apt的类pod样活性。在h2o2存在下，pb/pm/hrp/apt催化tmb被氧化成oxtmb，最大吸光度约为652nm。如图6所示，当仅有pb和h2o2存在时完全无法在652nm处看到吸收峰，溶液不会显现蓝色。当pb和tmb同时存在时在652nm处有一个微弱的吸收峰，这是由于tmb单组份显色液中含有微量的h2o2，同时也可以证明pb有着类pod活性的特性，即使存在微量的h2o2都会被催化分解。当仅有h2o2和tmb存在时完全无法在652nm处看到吸收峰，溶液也不会显现蓝色。当pb/pm/hrp/apt，h2o2和tmb同时存在时，经过反应后可以在652nm处看到显著的吸收峰，溶液呈现明显的蓝色。通过上述实验，验证了这个反应的发生是需要pb/pm/hrp/apt的存在的，可以有效证明它的优异类pod活性。当pb，h2o2以及tmb显色液同时存在时，经过反应后在652nm处同样会显示出吸收峰，溶液变为蓝色。但pb存在时的峰位明显低于pb/pm/hrp/apt存在时的峰位，溶液颜色也比pb/pm/hrp/apt反应后溶液的颜色浅。这说明pb/pm/hrp/apt的类pod活性相比于pb有所提升,这归功于pb和hrp的协同催化作用，为h2o2的催化提供了更多活性位点。图7显示了在pb/pm/hrp/apt+tmb+h2o2的反应体系中，随着时间的增加反应体系在652nm处的吸收峰逐渐升高。此外，控制pb/pm/hrp/apt和tmb的浓度不变,改变h2o2的浓度,得到的吸收图如图8所示。随着h2o2浓度的增加，所对应的溶液在相同反应时间所得的吸收峰逐渐升高，溶液颜色变蓝的程度也随之加深。
[0115]
3)4t1细胞的定量检测
[0116]
为了实现对4t1细胞的有效捕获和精确地定量检测，首先在微孔板上利用生物素和亲和素的反应，将4t1细胞的适配体修饰在微孔板上。接下来，分别在微孔板中加入4t1细胞、l02细胞，孵育4h后用pbs冲洗三次，去除微孔板上未结合的细胞。随后加入pb/pm/hrp/apt催化剂，孵育2h后，加入pbs缓冲液冲洗3次，以除去未结合的纳米催化剂。随后加入h2o2和tmb进行显色一定时间后，加入终止剂终止反应。用酶标仪对450nm的吸光度进行检测。通过图9中的a可以看出，加入l02细胞这组，酶标仪中在450nm处的吸光度几乎可以忽略不计。因为微孔板难以实现除了4t1细胞之外其它细胞的捕获，具有良好的选择性。由于4t1细胞被成功捕获，因此酶标仪中450nm处的吸光度读数很强，如图9中的b。并且吸光度随着细胞数量的增加而增加，呈现良好的线性关系。以上数据表明微孔板具有良好的选择性和捕获能力，可以有效实现4t1细胞的定量分析。
[0117]
3、结论
[0118]
综上所述，功能性微孔板的制备可以有效捕获4t1细胞，并具有良好的选择性，这大大提高了检测结果的准确度。此外，一种新的纳米催化剂pb/pm/hrp/apt对细胞的靶向策略的提出，可有效提高纳米催化剂的富集能力及生物利用度。利用hrp修饰pb，并通过二者的协同作用，显著提高pb的类pod活性。在h2o2与tmb的辅助下定量检测4t1细胞的浓度。利用pb/pm/hrp/apt反应后的溶液颜色、紫外可见吸收光谱及酶标仪的检测，可以实现4t1细胞的目视比色和吸收峰双重检测。检测方法简单明了，4t1细胞检测范围可达1～100万个/ml，检测样品不需提前分离4t1细胞，检测时间短，检测精度佳。为4t1细胞的检测提供了一种可行性较高的操作模式。本发明的成果有望在生物技术和分析科学中发挥重要作用。
[0119]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种纳米催化剂，包括壳体和核体，所述核体为普鲁士蓝纳米粒子；所述壳体为血小板膜；所述血小板膜表面修饰有肿瘤细胞的适配体；其特征在于，在血小板膜表面还均匀的修饰有辣根过氧化物酶。2.根据权利要求1所述的纳米催化剂，其特征在于，所述肿瘤细胞的适配体包括pd-l1适配体。3.权利要求1或2所述纳米催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将血小板膜和普鲁士蓝纳米粒子混合，得到pb/pm纳米粒子；将生物素标记的辣根过氧化物酶、修饰有羧基的肿瘤细胞的适配体和羧基活化剂混合，进行活化反应，得到活化产物；将所述pb/pm纳米粒子和所述活化产物混合，进行脱水缩合反应，得到纳米催化剂。4.权利要求1或2所述的纳米催化剂或者权利要求3所述的制备方法制备得到的纳米催化剂在催化过氧化氢参与的氧化还原反应中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述过氧化氢参与的氧化还原反应包括过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺的显色反应。6.权利要求1或2所述的纳米催化剂或者权利要求3所述的制备方法制备得到的纳米催化剂在制备检测肿瘤细胞的试剂或试剂盒中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括4t1细胞、b16f10细胞、hepg2细胞或ct26细胞。8.一种肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包括修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板、权利要求1或2所述的纳米催化剂或者权利要求3所述的制备方法制备得到的纳米催化剂、过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺。9.一种基于权利要求8所述的试剂盒的非诊断目的的肿瘤细胞定性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗；在第一冲洗后的微孔板中加入权利要求1或2所述的纳米催化剂或者权利要求3所述的制备方法制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗；在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，若a-a0＞0，则表示待测样本中存在待测肿瘤细胞；若a-a0＝0，则表示待测样本中不存在待测肿瘤细胞。10.一种基于权利要求8所述的试剂盒的非诊断目的的肿瘤细胞定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：在修饰有肿瘤细胞适配体的微孔板中加入待测样本，进行第一孵育后，对微孔板进行第一冲洗；在第一冲洗后的微孔板中加入权利要求1或2所述的纳米催化剂或者权利要求3所述的制备方法制备得到的纳米催化剂，进行第二孵育后，对微孔板进行第二冲洗；在第二冲洗后的微孔板中加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行显色反应，
加入终止剂终止所述显色反应，得到反应产物；对所述反应产物的450nm处的吸光度进行检测，吸光度值记为a，不含肿瘤细胞的空白对照的吸光度值记为a0，将所述a和a0的差值带入预定的标准曲线中得到待测肿瘤细胞浓度；所述预定的标准曲线为a和a0的差值与肿瘤细胞浓度之间的线性关系曲线。

技术总结
本发明提供了一种纳米催化剂及其制备方法及和应用，属于体外诊断技术领域。本发明借助肿瘤细胞适配体和肿瘤细胞之间的结合相互作用，在微孔板上均匀的排列肿瘤细胞的适配体，从而有效实现肿瘤细胞的捕获；微孔板捕获肿瘤细胞后，在微孔板中加入具有良好催化性能的纳米催化剂PB/PM/HRP/Apt，冲洗掉未结合的PB/PM/HRP/Apt；随后加入H2O2以及TMB显色液；PB/PM/HRP/Apt作为催化剂，可以催化TMB被H2O2氧化成蓝色产物oxTMB。然后将微孔板放入酶标仪中，根据标准曲线可以实现肿瘤细胞的定量分析。析。析。


技术研发人员：郭英姝 李文鑫
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院）
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/17