吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用。


背景技术：

2.放射治疗作为腹盆腔肿瘤重要的治疗手段可显著提高患者生存率、延长存活时间，但放射性肠损伤的存在降低了患者的生活质量、限制了疗效的提高。研究发现放疗导致的急性肠道毒性症状的发生率达60-90％，典型症状包括腹泻、腹痛、腹胀、里急后重、大便失禁、直肠出血和体重减轻等。目前临床通过药物干预、手术等治疗放射性肠损伤，尚不能达到令人满意的效果，例如小肠移植的成功率约为60％，明显低于其他器官移植。对于放射性肠损伤的诊治，特别是防治药物的研发方面至今尚缺乏真正有效的、精准的治疗方案。因此，寻找有效的电离辐射致肠损伤防护药物具有重要意义。
3.研究表明，受到事故与治疗性照射的实验动物、病人(包括美国nasa宇航员)，肠道菌群结构和数量都有明显变化。一些肠道菌种(属)被发现对肠道辐射反应有调节作用，采用粪便移植或益生菌治疗等方法对辐射损伤有预防与治疗作用。肠道菌群对宿主的作用多数是通过其代谢物来发挥的。在肠道内，食物会被肠道菌群发酵以产生短链脂肪酸、支链氨基酸、色氨酸及吲哚衍生物等代谢物。其中，色氨酸属于人体必须的氨基酸之一，肠道是其主要代谢场所。色氨酸在肠道内的代谢主要经过三大途径：由肠道菌群介导的吲哚途径，和由机体介导的犬尿氨酸途径、五羟色胺途径。在吲哚途径中，色氨酸被肠道菌群代谢为吲哚-3-丙酸(ipa)、吲哚-3-乙酸(iaa)、吲哚-3-甲醛(i3a)等吲哚衍生物。值得注意的是，研究表明吲哚-3-甲醛具有显著的抗炎效果，同时对肠上皮细胞具有保护作用。此外，i3a是一种人体内源性的代谢产物，对生物体来说安全；其次，可结合益生菌益生元一起使用，降低患者对药物的抵触情绪，在临床上具有良好的应用前景。目前，i3a已被用于预防和治疗多种类型的疾病，中国专利cn202210149432.3公开了一种肠道菌群代谢物吲哚-3-甲醛在防治动脉粥样硬化中的应用；中国专利cn201910061852.4公开了吲哚-3-甲醛在制备治疗特应性皮炎药物中的用途，现有技术均未涉及此物质在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的新用途。
4.现已开发出多种类型的电离辐射致肠损伤防护药物，包括硫辛酸类化合物、氨疏基化合物、雌激素类化合物、细胞因子和植物多糖及中药复方等。除深入研究含硫化合物外，天然植物成分、细胞生长因子、免疫和生物生化制剂的研究亦占有重要位置。
5.目前对于电离辐射致肠损伤防护药物研究多处于临床前阶段，虽然部分药物有保护作用，但是存在显著缺点，主要包括：作用浓度高、活性偏低和存在明显的毒副作用，从而限制了临床应用。因此，寻找无毒或低毒、高效的电离辐射致肠损伤防护药物已成为放射医学领域的研究热点。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用。
7.本发明的第一个目的是提供一种吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用。
8.吲哚-3-甲醛的结构式如下所示：
[0009][0010]
在本发明的一个实施例中，所述电离辐射致肠损伤是由能引起物质发生电离的放射性物质或直线加速器发出的射线照射所导致的肠道损伤。
[0011]
在本发明的一个实施例中，所述电离辐射致肠损伤防护药物可提高全腹致死剂量照射小鼠的存活率，延长其存活时间、保护接受电离辐射照射小鼠的肠道组织结构。
[0012]
在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型为注射剂、悬浮剂、粉剂、片剂或颗粒剂。
[0013]
在本发明的一个实施例中，所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法给药。
[0014]
在本发明的一个实施例中，药物给药的导入机体为肌肉、皮内、皮下、静脉或粘膜组织。
[0015]
在本发明的一个实施例中，所述药物是由吲哚-3-甲醛溶解于二甲亚砜制备得到。
[0016]
在本发明的一个实施例中，所述药物中吲哚-3-甲醛的质量浓度为0.1mg/ml-10mg/ml，二甲亚砜作为稀释剂。
[0017]
在本发明的一个实施例中，所述药物的给药剂量为100mg/kg-200mg/kg，且在电离辐射前1天、1h及照射后24h各给药一次。
[0018]
本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，包括所述的药物。
[0019]
在本发明的一个实施例中，所述药物组合物还包括药学上或药理上可接受的载体。
[0020]
在本发明的一个实施例中，所述载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。
[0021]
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0022]
(1)本发明所述的应用中吲哚-3-甲醛可以保护肠道黏膜屏障，吲哚-3-甲醛是一种人体内源性的代谢产物，对生物体来说安全；其次，可结合益生菌益生元一起使用，降低患者对药物的抵触情绪，在临床上具有良好的应用前景。
[0023]
(2)本发明所述的应用采用c57bl/6j小鼠构建了放射性肠损伤模型，通过小鼠存活和体重以及肠道组织学变化评估吲哚-3-甲醛的预防及治疗的作用，结果表明吲哚-3-甲醛能够显著提高辐照小鼠存活率，同时能促进肠道干细胞增殖，并且吲哚-3-甲醛能激活
ahr信号通路，促进抑炎因子il-10表达发挥辐射防护效应。
[0024]
(3)本发明所述的应用提供了吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的用途、药剂形式和给药方式。本发明所提供的以吲哚-3-甲醛为活性成分的电离辐射致肠损伤防护药物具有价格低廉、毒副作用小、疗效显著、用药方便安全等优势，对于急性放射病患者、涉核从业人员、官兵、宇航员、放疗病人等不同人员均适用，在治疗前或执行任务、工作中均可用药。上述性能均显示出吲哚-3-甲醛在防护电离辐射致肠损伤中的独特之处，在我国医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0025]
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0026]
图1为本发明13gy x射线照射后吲哚-3-甲醛处理组和照射对照组小鼠存活和临床评分的变化；其中，a为生存曲线，b为小鼠临床评分。
[0027]
图2为本发明吲哚-3-甲醛对13gy x射线照射后小鼠肠道绒毛和隐窝结构的影响；其中，a为小鼠肠道组织绒毛he染色图，b为绒毛长度统计图。
[0028]
图3为本发明吲哚-3-甲醛对13gy x射线照射后小鼠肠道隐窝细胞增殖的影响；其中，a为肠道组织ki67免疫组化图，b为每个隐窝内ki67阳性细胞数统计图，c为肠道ki67阳性隐窝统计图。
[0029]
图4为本发明吲哚-3-甲醛对13gy x射线照射后小鼠肠道干细胞数量的影响；其中，a为肠道组织lgr5免疫组化图，b为每个隐窝内lgr5阳性细胞统计图。
[0030]
图5为本发明吲哚-3-甲醛对13gy x射线照射后小鼠肠道隐窝细胞凋亡的影响；其中，a为组织tunel免疫荧光图，b为每个隐窝内凋亡细胞统计图。
[0031]
图6为本发明吲哚-3-甲醛对x射线照射正常人肠道上皮细胞增殖的影响；其中，a为4gy剂量照射后细胞活力统计图，b为8gy剂量照射后细胞活力统计图。
[0032]
图7为本发明吲哚-3-甲醛对x射线照射正常人肠道上皮细胞克隆形成的影响；其中，a为i3a治疗后hiec-6克隆形成图，b为hiec-6的剂量-存活曲线。
[0033]
图8为本发明吲哚-3-甲醛对13gy x射线照射后小鼠肠道隐窝处ahr/il-10通路的激活；其中，a为elisa法检测肠组织il-10的表达，b为免疫组化检测肠组织il-10和ahr信号表达。
[0034]
图9为本发明吲哚-3-甲醛对x射线照射正常人肠道上皮细胞ahr/il-10通路激活的细胞水平验证；其中，a为wb法检测加入ahr抑制剂后hiec-6中ahr及il-10蛋白的表达，b为使用ahr抑制剂及i3a治疗后hiec-6克隆形成图，c为使用ahr抑制剂后hiec-6的剂量-存活曲线。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0036]
实施例1：吲哚-3-甲醛对13gy x射线全腹照射小鼠的保护作用
[0037]
(1)实验分组：选用6-8周龄c57bl/6雄性小鼠(体重23
±
2g)40只，随机分为两组：
照射对照组(20只)和照射+吲哚-3-甲醛(i3a)组(20只)。
[0038]
(2)给药处理：将吲哚-3-甲醛溶解于二甲基亚砜(dmso)，照射前1天、照前1h及照后24h采用灌胃给药(剂量按体重：200mg/kg)的方式处理照射+吲哚-3-甲醛组小鼠，照射对照组小鼠给予同等体积的dmso。
[0039]
(3)建立x射线辐射致肠道损伤小鼠模型：用x射线源对两组小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13gy。
[0040]
(4)吲哚-3-甲醛对照射小鼠一般情况和体征指标的影响：照射对照组小鼠在照射后1天即出现活动度显著下降，而照射+吲哚-3-甲醛组小鼠在照射后活动度显著优于照射对照组。对小鼠存活和体重进行分析发现，吲哚-3-甲醛可显著提高13gy x射线照射后小鼠生存率，减轻临床评分。因此，吲哚-3-甲醛可以改善受照小鼠的体征、提高受照小鼠存活率，如图1所示。
[0041]
实施例2：吲哚-3-甲醛对13gy x射线全腹照射所致肠损伤的保护作用
[0042]
(1)实验分组：选用6-8周龄c57bl/6雄性小鼠(体重23
±
2g)36只，随机分为三组：正常对照组(12只)、照射对照组(12只)和照射+吲哚-3-甲醛组(12只)。
[0043]
(2)给药处理：将吲哚-3-甲醛溶解于dmso溶液，照射前1天、照前1h及照后24h采用灌胃给药(剂量按体重：200mg/kg)的方式处理照射+吲哚-3-甲醛组小鼠，正常对照组和照射对照组小鼠给予同等体积的dmso处理。
[0044]
(3)建立x射线辐射致肠道损伤小鼠模型：用x射线源对照射对照组和照射+吲哚-3-甲醛组小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13gy。
[0045]
(4)吲哚-3-甲醛对照射小鼠肠道结构的影响：分别于照射后3天取小鼠小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后进行he染色。如图2所示，电离辐射明显导致小鼠小肠绒毛断裂、脱落；照射+吲哚-3-甲醛组肠道结构与正常对照组类似，绒毛整齐、完整。对绒毛长度进行定量分析，发现吲哚-3-甲醛可显著延长接受电离辐射照射小鼠的小肠绒毛长度。
[0046]
(5)吲哚-3-甲醛对照射小鼠肠道隐窝细胞增殖的影响：按照(4)中所述处理方式收集小鼠肠道组织，切片后用抗ki67抗体进行免疫组化染色，ki67是细胞增殖的标志分子之一。如图3所示，正常对照组小鼠肠道隐窝呈ki67阳性，表明隐窝细胞具有持续增殖能力，照射对照组小鼠照后3天的肠道ki67阳性隐窝数显著降低，每个隐窝中的ki67阳性细胞比率也显著下降。照射+吲哚-3-甲醛组小鼠肠道平均每个隐窝ki67阳性细胞数和ki67阳性隐窝数均明显高于照射对照组。
[0047]
(6)吲哚-3-甲醛对照射小鼠肠道干细胞数量的影响：按照(4)中所述处理方式收集小鼠肠道组织，切片后用抗lgr5抗体进行免疫组化染色，lgr5为肠道干细胞的标志物。发现照射对照组小鼠照后3天每个隐窝中lgr5阳性细胞比率显著下降。照射+吲哚-3-甲醛组小鼠肠道平均每个隐窝中lgr5阳性细胞数明显高于照射对照组，如图4所示。
[0048]
实施例3：吲哚-3-甲醛对13gy x射线全腹照射所致肠隐窝细胞凋亡的抑制作用
[0049]
(1)实验分组：选用6-8周龄c57bl/6雄性小鼠(体重23
±
2g)18只，随机分为三组：正常对照组(6只)、照射对照组(6只)和照射+吲哚-3-甲醛组(6只)。
[0050]
(2)给药处理：将吲哚-3-甲醛溶解于dmso溶液，照射前1天、照前1h及照后24h采用灌胃给药(剂量按体重：200mg/kg)的方式处理照射+吲哚-3-甲醛组小鼠，正常对照组和照射对照组小鼠给予同等体积的dmso处理。
[0051]
(3)建立x射线辐射致肠道损伤小鼠模型：用x射线源对照射对照组和照射+吲哚-3-甲醛组小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13gy。
[0052]
(4)吲哚-3-甲醛对照射小鼠肠道隐窝细胞凋亡的影响：于照射后6h取小鼠小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后进行tunel染色。如图5所示，电离辐射导致肠道隐窝细胞发生凋亡，破坏肠道结构的再生能力，而吲哚-3-甲醛可以显著抑制电离辐射诱发的小鼠肠道隐窝细胞凋亡。
[0053]
综上所述，吲哚-3-甲醛保护电离辐射后小鼠的肠道结构和功能。
[0054]
实施例4：吲哚-3-甲醛对正常人肠道上皮细胞的辐射防护作用
[0055]
(1)实验分组：选用目前体外研究肠损伤较为公认的正常人肠道上皮hiec-6为模型。随机分为三组：正常对照组、照射对照组和照射+0、20、50、100、200μmol/l吲哚-3-甲醛组。
[0056]
(2)给药处理：吲哚-3-甲醛溶解于二甲基亚砜中，母液浓度为2mmol/l，采用逐级稀释的方法配制使用浓度分别为0、20、50、100、200μmol/l吲哚-3-甲醛组，稀释液为培养细胞用的dmem培养液。对照组用等体积的二甲基亚砜处理。
[0057]
(3)照射处理：用x射线照射机对细胞进行单次均匀照射，照射剂量为4和8gy。
[0058]
(4)吲哚-3-甲醛对照射正常人肠道上皮细胞增殖的影响：hiec-6细胞接种于96孔板，在细胞处于对数生长期时于照射前30min分别加入0、20、50、100、200μmol/l吲哚-3-甲醛，照射处理24h后采用cck8试剂盒(购自于碧云天生物技术公司，操作方法遵循说明书)检测细胞生长情况。如图6所示，50、100μmol/l吲哚-3-甲醛组处理细胞后，对hiec-6细胞有明显的辐射防护作用。
[0059]
(5)吲哚-3-甲醛对照射正常人肠道上皮细胞克隆形成的影响：hiec-6细胞接种于6孔板，在细胞处于对数生长期时于照射前30min分别加入100μmol/l吲哚-3-甲醛溶液，照射处理后7d对细胞固定及结晶紫染色检测细胞克隆形成情况。如图7所示，100μmol/l吲哚-3-甲醛处理后的细胞表现出比对照细胞更高的克隆存活率。并根据hiec-6细胞克隆存活率，在graphpadprism软件中使用“多靶单击模型”拟合得到hiec-6细胞的剂量-存活曲线。发现吲哚-3-甲醛联合照射组的d0、dq值变大，代表hiec-6细胞的放射抗性增加。
[0060]
综上所述，吲哚-3-甲醛对正常人肠道上皮细胞具有辐射防护作用。
[0061]
实施例5：吲哚-3-甲醛激活ahr/il-10信号通路
[0062]
(1)实验分组：选用6-8周龄c57bl/6雄性小鼠(体重23
±
2g)36只，随机分为三组：正常对照组(12只)、照射对照组(12只)和照射+吲哚-3-甲醛组(12只)。
[0063]
(2)给药处理：将吲哚-3-甲醛溶解于dmso溶液，照射前1天、照前1h及照后24h采用灌胃给药(剂量按体重：200mg/kg)的方式处理照射+吲哚-3-甲醛组小鼠，正常对照组和照射对照组小鼠给予同等体积的dmso处理。
[0064]
(3)建立x射线辐射致肠损伤小鼠模型：用x射线源对照射对照组和照射+吲哚-3-甲醛组小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13gy。
[0065]
(4)吲哚-3-甲醛对照射小鼠ahr/il-10的影响：分别于照射后3天取小鼠小肠组织，elisa检测il-10的表达，切片后进行免疫组化。如图8所示，i3a治疗后显著提高电离辐射后il-10的表达，并且免疫组化同样发现吲哚-3-甲醛可显著促进肠隐窝处ahr和il-10蛋白表达。
[0066]
实施例6：吲哚-3-甲醛通过ahr/il-10信号通路发挥辐射防护作用
[0067]
(1)实验分组：选用目前体外研究肠损伤较为公认的正常人肠道上皮hiec-6为模型。随机分为四组：正常对照组、照射对照组、照射+100μmol/l吲哚-3-甲醛、照射+100μmol/l吲哚-3-甲醛+ahr抑制剂(ch-223191)组。
[0068]
(2)给药处理：将吲哚-3-甲醛溶解于二甲基亚砜中，母液浓度为2mmol/l，采用逐级稀释的方法配制使用浓度分别为0、20、50、100、200μmol/l吲哚-3-甲醛组，稀释液为培养细胞用的dmem培养液。对照组用等体积的二甲基亚砜处理。
[0069]
(3)建立x射线辐射致肠损伤细胞模型：用x射线照射机对细胞进行单次均匀照射，照射剂量为4gy。
[0070]
(4)体外验证吲哚-3-甲醛对ahr/il-10的影响：于照射后24h提取hiec-6细胞蛋白，wb检测ahr及il-10变化，同时使用ahr抑制剂ch-223191处理，验证i3a对ahr/il-10信号通路的影响。此外，使用ahr抑制剂ch-223191预处理hiec-6观察其对i3a治疗后克隆形成的影响。如图9所示，i3a治疗后显著提高电离辐射后ahr/il-10的表达，并且il-10的表达依赖于ahr的激活。此外，ahr抑制剂ch-223191预处理拮抗了i3a对hiec-6细胞克隆形成的促进作用。
[0071]
综上所述，吲哚-3-甲醛主要通过ahr/il-10通路发挥肠道辐射防护作用。
[0072]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述电离辐射致肠损伤是由能引起物质发生电离的放射性物质或直线加速器发出的射线照射所导致的肠道损伤。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、悬浮剂、粉剂、片剂或颗粒剂。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法给药。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是由吲哚-3-甲醛溶解于二甲亚砜制备得到。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物中吲哚-3-甲醛的质量浓度为0.1mg/ml-10mg/ml。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为100mg/kg-200mg/kg，且在电离辐射前1天、1h及照射后24h各给药一次。8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的药物。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上或药理上可接受的载体。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及一种吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用，属于医药技术领域。本发明所述的应用提供了吲哚-3-甲醛在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的用途、药剂形式和给药方式。本发明所提供的以吲哚-3-甲醛为活性成分的电离辐射致肠损伤防护药物具有价格低廉、毒副作用小、疗效显著、用药方便安全等优势，对于急性放射病患者、涉核从业人员、官兵、宇航员、放疗病人等不同人员均适用，在治疗前或执行任务、工作中均可用药。上述性能均显示出吲哚-3-甲醛在防护电离辐射致肠损伤中的独特之处，在我国医学领域具有广阔的应用前景。景。景。


技术研发人员：李明 谢黎伟 蔡尚 田野
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/17