一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂及其制备方法与应用与流程

1.本公开涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.柑橘溃疡病是一种毁灭性的世界检疫性病害，现已在世界多个国家和地区发生，对柑橘产业造成了极大的经济损失。柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种引起，起源于东南亚，在我国于华南地区首次被发现，之后在全国各个柑橘种植及基地陆续发生，华南地区最为严重，对柑橘产业造成了很大经济损失。
3.溃疡病的发生是以老叶上病斑为传染源，当温度和空气湿度适宜时溢出，通过风雨、昆虫传播，经寄主的气孔和伤口感染柑橘幼嫩组织。常规防治溃疡病的措施主要包括防治虫害，及时清园，剪除病枝病叶的方式减轻或者预防溃疡病的发生和蔓延，但是该方法成本高，效果无保障。
4.柑橘溃疡病的表现主要为叶片针头大小的黄色油浸状斑点，大部分在叶片背面随后逐渐扩大为圆形，四周凸起，中间凹陷，形似火山口；在果实上症状与叶片类似，在树枝上的程度较轻，但是无论在何部位，最终都会削弱树势，严重会导致柑橘早期落叶、落花，树势衰退，果实产量减少，品质降低，影响种植户经济收入。
5.随着柑橘种植面积的加大，品种的更新换代等，为柑橘溃疡病的快速传播提供了有力条件，因此，溃疡病的防治工作显得更加重要。
6.经过多年摸索实践，目前在田间仅铜制剂可以一定程度控制柑橘溃疡病的发生，其作用原理梳理如下：（1）建立物理屏障：铜颗粒隔断气孔、水空；（2）干扰酶的正常功能：铜离子与病原菌蛋白结合导致折叠等；（3）产生活性氧ros，刺激脂质过氧化作用，损伤蛋白和核酸致病原菌死亡。铜制剂的使用虽然一定程度上降低了柑橘溃疡病的危害，但是随着铜制剂的连年大量使用，其弊端也不断地显露：（1）降低了土壤和根际细菌的多样性，病原菌耐药性越来越强；（2）增加了土壤重金属污染；（3）果面光洁发亮，诱集螨类害虫，刺激螨类害虫大爆发；（4）果实铜元素超标，引发肝损伤等。
7.微生物是生物防治的重要组成部分，某些微生物能够通过分泌抗生素等次级代谢产物直接抑制病原菌的生长；某些微生物也可以通过分泌铁载体与病原菌竞争铁离子从而间接实现抑制病原菌的生长；某些微生物可以通过诱导植物产生系统抗性增强植物的抗病能力；微生物制剂具有对病虫害防治效果好，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留；对病虫的杀伤特异性强，不伤害天敌和有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分属天然产物，保证可持续发展；经申请人多次试验发现，使用枯草芽孢杆菌制剂能够有效防治柑橘溃疡病，最常用的枯草芽孢杆菌制剂有枯草芽孢杆菌可溶粉剂和枯草芽孢杆菌可湿粉剂，但是都存在粉尘飞扬的缺点。
8.水分散粒剂具有使用方便、无粉尘飞扬、不污染环境、安全等特点，能较快地崩解、分散，形成高悬浮的固液分散体系，能很好的解决微生物液剂、粉剂、颗粒剂的缺陷，是一种
优良的微生物肥料剂型，但是在制备水分散粒剂的过程中会加入有机润湿剂、分散剂、崩解剂、不溶载体等外源物质，这些物质基本不能被植物吸收利用，过多使用会对作物生长产生危害，且在使用中会起泡过多，影响使用，有机润湿剂、分散剂、崩解剂还会影响微生物水分散粒剂的活性，从而影响使用效果，还会增加微生物水分散粒剂的用量，虽然可以通过减少有机润湿剂、分散剂、崩解剂的加入，从而避免对微生物水分散粒剂的活性的影响，但是会降低微生物水分散粒剂的悬浮率，提高润湿时间、崩解时间和热贮分解率，不利于叶喷使用，且会造成局部浓度过高，对叶片产生灼伤。因此，研发一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，能够在提高对柑橘溃疡病的防治效果的同时，降低枯草芽孢杆菌水分散粒剂的用量，同时还能够提高枯草芽孢杆菌水分散粒剂的悬浮率，降低润湿时间、崩解时间和热贮分解率，是目前急需解决的技术问题。


技术实现要素：

9.本发明提供一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂及其制备方法与应用，能够在提高对柑橘溃疡病的防治效果的同时，降低枯草芽孢杆菌水分散粒剂的用量，同时还能够提高枯草芽孢杆菌水分散粒剂的悬浮率，降低润湿时间、崩解时间和热贮分解率。
10.为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂及其制备方法与应用，由以下步骤组成：菌种活化、种子液制备、一次发酵培养、二次发酵培养、制备枯草芽孢杆菌菌粉、混合、粉碎、造粒。
11.所述菌种活化的方法为，挑取保存在lb斜面培养基上的枯草芽孢杆菌，在lb固体培养基上进行三区划线，于35-37℃下培养23-25h，得到活化的菌株；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；所述种子液制备的方法为，从活化的菌株中挑取单菌落接种到种子培养基上，在260-280rpm的条件下摇床培养16-18h，控制摇床培养的温度为35-37℃，摇床培养结束得到种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：1.5-1.8份葡萄糖，1-1.5份蛋白胨，0.7-1份酵母粉，0.7-1份牛肉膏，0.5-0.8份氯化钠，93.9-96.6份去离子水；所述一次发酵培养的方法为，按照体积百分比为2.5-3.5%的接种量向发酵培养基中接入种子液进行一次发酵培养，控制一次发酵培养的通气量为1-1.2v／v
•
min，搅拌速度为300-320rpm，温度为36-38℃，培养时间为22-24h，得到一次发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：70-80份玉米淀粉,50-55份玉米浆干粉，4-6份葡萄糖，3-5份碳酸钙，1-3份硫酸镁，1-2份磷酸氢二钠，0.5-1份硫酸锰，0.5-1份硫酸锌，750-800份去离子水；所述一次发酵培养中，发酵培养基的ph为7-7.5；所述二次发酵培养的方法为，向一次发酵液中加入蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁进行二次发酵培养，控制二次发酵培养的通气量为1.2-1.4v／v
•
min，搅拌速度为310-330rpm，温度为34-36℃，培养时间为12-14h，得到二次发酵液；
60.04%，第二次施药后14d的防治效果为76.80-76.96%，第二次施药后21d的防治效果为81.49-81.86%，第二次施药后28d的防治效果为84.37-84.65%；在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌水分散粒剂用量为2g/株，第二次施药后7d的防治效果为60.13-61.07%，第二次施药后14d的防治效果为77.33-77.71%，第二次施药后21d的防治效果为82.11-82.43%，第二次施药后28d的防治效果为84.57-85.47%。
具体实施方式
15.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
16.实施例1一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，具体为：1.菌种活化：挑取保存在lb斜面培养基上的枯草芽孢杆菌，在lb固体培养基上进行三区划线，于35℃下培养23h，得到活化的菌株；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；2.种子液制备：从活化的菌株中挑取单菌落接种到种子培养基上，在260rpm的条件下摇床培养16h，控制摇床培养的温度为35℃，摇床培养结束得到种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：1.5份葡萄糖，1份蛋白胨，0.7份酵母粉，0.7份牛肉膏，0.5份氯化钠，93.9份去离子水；3.一次发酵培养：按照体积百分比为2.5%的接种量向发酵培养基中接入种子液进行一次发酵培养，控制一次发酵培养的通气量为1 v／v
·
min，搅拌速度为300rpm，温度为36℃，培养时间为22h，得到一次发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：70份玉米淀粉,50份玉米浆干粉，4份葡萄糖，3份碳酸钙，1份硫酸镁，1份磷酸氢二钠，0.5份硫酸锰，0.5份硫酸锌，750份去离子水；所述发酵培养基的ph为7；4.二次发酵培养：向一次发酵液中加入蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁进行二次发酵培养，控制二次发酵培养的通气量为1.2v／v
•
min，搅拌速度为310rpm，温度为34℃，培养时间为12h，得到二次发酵液；一次发酵液、蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁的重量比为280:2:20:0.5:0.2:0.1；5.制备枯草芽孢杆菌菌粉：将二次发酵液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥的进风温度为110℃，出风温度为60℃，喷雾干燥结束得到枯草芽孢杆菌菌粉；所述枯草芽孢杆菌菌粉的芽孢率为95.4%，发酵液活菌数为3.1
×
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10
cfu/ml；6.混合：将枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788混合均匀，得到混合物；
枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788的重量比为30:4:17:70:14:2:2；所述微孔化高岭土的制备方法为：将高岭土置于密闭容器中，将密闭容器抽真空至真空度为0.08mpa，然后向密闭容器中通入氮气至气体压力为0.04mpa，然后将密闭容器的温度升高至180℃，在180℃下热处理35min后将密闭容器的温度升高至400℃，在400℃下热处理45min，然后自然冷却至室温，得到微孔化高岭土；所述偶联化崩解剂的制备方法为：将焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550混合后均匀后置于50℃下静置15min，然后加入微晶纤维素继续混合均匀后，置于50℃下静置10min，得到偶联化崩解剂；焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550、微晶纤维素的重量比为10:15:3:0.5:2；7.粉碎：将混合物置于气流粉碎机中粉碎至100目，得到原料粉；8.造粒：将原料粉与去离子水混合后，搅拌捏合成可塑形状，然后通过孔径为1mm的挤出孔板进行挤压造粒，得到枯草芽孢杆菌水分散粒剂；原料粉与去离子水的重量比为85:10。
17.实施例2一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，具体为：1.菌种活化：挑取保存在lb斜面培养基上的枯草芽孢杆菌，在lb固体培养基上进行三区划线，于36℃下培养24h，得到活化的菌株；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；2.种子液制备：从活化的菌株中挑取单菌落接种到种子培养基上，在270rpm的条件下摇床培养17h，控制摇床培养的温度为36℃，摇床培养结束得到种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：1.6份葡萄糖，1.2份蛋白胨，0.8份酵母粉，0.8份牛肉膏，0.6份氯化钠，95份去离子水；3.一次发酵培养：按照体积百分比为3%的接种量向发酵培养基中接入种子液进行一次发酵培养，控制一次发酵培养的通气量为1.1v／v
•
min，搅拌速度为310rpm，温度为37℃，培养时间为23h，得到一次发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：75份玉米淀粉,52份玉米浆干粉，5份葡萄糖，4份碳酸钙，2份硫酸镁，1.5份磷酸氢二钠，0.8份硫酸锰，0.8份硫酸锌，780份去离子水；发酵培养基的ph为7.2；4.二次发酵培养：向一次发酵液中加入蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁进行二次发酵培养，控制二次发酵培养的通气量为1.3v／v
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min，搅拌速度为320rpm，温度为35℃，培养时间为13h，得到二次发酵液；所述二次发酵培养中，一次发酵液、蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁的重量比为290:3:22:0.6:0.4:0.2；
5.制备枯草芽孢杆菌菌粉：将二次发酵液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥的进风温度为112℃，出风温度为62℃，喷雾干燥结束得到枯草芽孢杆菌菌粉；所述枯草芽孢杆菌菌粉的芽孢率为95.6%，发酵液活菌数为3.3
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cfu/ml；6.混合：将枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788混合均匀，得到混合物；枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788的重量比为32:5:18:72:15:2.5:3；所述微孔化高岭土的制备方法为：将高岭土置于密闭容器中，将密闭容器抽真空至真空度为0.085mpa，然后向密闭容器中通入氮气至气体压力为0.05mpa，然后将密闭容器的温度升高至190℃，在190℃下热处理38min后将密闭容器的温度升高至420℃，在420℃下热处理48min，然后自然冷却至室温，得到微孔化高岭土；所述偶联化崩解剂的制备方法为：将焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550混合后均匀后置于52℃下静置18min，然后加入微晶纤维素继续混合均匀后，置于52℃下静置12min，得到偶联化崩解剂；焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550、微晶纤维素的重量比为12:15.5:4:0.7:3；7.粉碎：将混合物置于气流粉碎机中粉碎至150目，得到原料粉；8.造粒：将原料粉与去离子水混合后，搅拌捏合成可塑形状，然后通过孔径为1.1mm的挤出孔板进行挤压造粒，得到枯草芽孢杆菌水分散粒剂；原料粉与去离子水的重量比为88:12。
18.实施例3一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，具体为：1.菌种活化：挑取保存在lb斜面培养基上的枯草芽孢杆菌，在lb固体培养基上进行三区划线，于37℃下培养25h，得到活化的菌株；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778，在专利公开号为cn115927034a，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；2.种子液制备：从活化的菌株中挑取单菌落接种到种子培养基上，在280rpm的条件下摇床培养18h，控制摇床培养的温度为37℃，摇床培养结束得到种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：1.8份葡萄糖，1.5份蛋白胨，1份酵母粉，1份牛肉膏，0.8份氯化钠，96.6份去离子水；3.一次发酵培养：按照体积百分比为3.5%的接种量向发酵培养基中接入种子液进行一次发酵培养，控制一次发酵培养的通气量为1.2v／v
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min，搅拌速度为320rpm，温度为38℃，培养时间为24h，得到一次发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：80份玉米淀粉,55份玉米浆干粉，6份葡萄糖，5份碳酸钙，3份硫酸镁，2份磷酸氢二钠，1份硫酸锰，1份硫酸锌，800份去离子水；发酵培养基的ph为7.5；
4.二次发酵培养：向一次发酵液中加入蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁进行二次发酵培养，控制二次发酵培养的通气量为1.4v／v
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min，搅拌速度为330rpm，温度为36℃，培养时间为14h，得到二次发酵液；一次发酵液、蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁的重量比为300:4:25:0.8:0.5:0.3；5.制备枯草芽孢杆菌菌粉：将二次发酵液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥的进风温度为115℃，出风温度为65℃，喷雾干燥结束得到枯草芽孢杆菌菌粉；所述枯草芽孢杆菌菌粉的芽孢率为95.8%，发酵液活菌数为3.5
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cfu/ml；6.混合：将枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788混合均匀，得到混合物；枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788的重量比为33:6:20:75:16:3:4；所述微孔化高岭土的制备方法为：将高岭土置于密闭容器中，将密闭容器抽真空至真空度为0.09mpa，然后向密闭容器中通入氮气至气体压力为0.05mpa，然后将密闭容器的温度升高至200℃，在200℃下热处理40min后将密闭容器的温度升高至450℃，在450℃下热处理50min，然后自然冷却至室温，得到微孔化高岭土；所述偶联化崩解剂的制备方法为：将焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550混合后均匀后置于55℃下静置20min，然后加入微晶纤维素继续混合均匀后，置于55℃下静置15min，得到偶联化崩解剂；焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550、微晶纤维素的重量比为14:16:5:1:4；7.粉碎：将混合物置于气流粉碎机中粉碎至200目，得到原料粉；8.造粒：将原料粉与去离子水混合后，搅拌捏合成可塑形状，然后通过孔径为1.2mm的挤出孔板进行挤压造粒，得到枯草芽孢杆菌水分散粒剂；原料粉与去离子水的重量比为90:15。
19.对比例1采用实施例1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其不同之处在于：省略第4步二次发酵培养，即直接将第3步一次发酵培养制得的一次发酵液代替二次发酵液用于第5步制备枯草芽孢杆菌菌粉；第5步制备枯草芽孢杆菌菌粉中得到的枯草芽孢杆菌菌粉的芽孢率为90.3%，发酵液活菌数为1.8
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20.对比例2采用实施例1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其不同之处在于：第6步一次混合中使用高岭土等量代替微孔化高岭土，使用焦磷酸钠等量代替偶联化崩解剂。
21.试验例1对实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的润湿时间、悬浮率、崩解时间、分散性、ph值、含水率、热贮分解率进行测试，测试结果如下：
22.由上述结果可知，通过在一次混合中使用微孔化高岭土和偶联化崩解剂，能够提高枯草芽孢杆菌水分散粒剂的悬浮率，降低润湿时间、崩解时间和热贮分解率。
23.试验例2在广西南宁市武鸣区仙湖镇那溪村选取在低洼、潮湿、密闭、管理粗放的历年溃疡病发较重的6个果园用于试验，分别标为1-6号果园，保证每个果园中的柑橘树的树种、树龄、长势及水肥管理等条件一致，每个果园随机选择50棵柑橘树作为试验柑橘树。
24.分别将实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂稀释成800倍液，然后分别对1-5号果园中的试验柑橘树进行喷施处理，同时作为空白对照组，不对第6号果园中的试验柑橘树喷施任何农药。在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌水分散粒剂用量为0.5g/株。
25.分别于施药前和第二次施药后7d，14d，21d和28d调查防治效果，每株按东，西，南，北，中五点取样，每点调查10个果及两个叶梢上的全部叶片，记录总叶(果)数，各级病叶(果)数，叶(果)危害等级，并计算病情指数和防治效果，记录和计算方式及计算结果如下：叶(果)危害分级方法：0级：无病；1级：每个叶(果)有病斑1-5个；3级：每个叶(果)有病斑6-10个；5级：每个叶(果)有病斑11-15个；7级：每个叶(果)有病斑16-20个；9级：每个叶(果)有病斑21个以上；病情指数＝{[∑(各级病果数
×
相应级数值)]/调查总果数
×
9}
×
100；防治效果(%)＝[1-(空白对照组药前病情指数
×
喷施处理后病情指数)/(空白对照组药后病情指数
×
喷施处理前病情指数)]
×
100；
[0026]
试验例3在广西南宁市武鸣区仙湖镇那溪村选取在低洼、潮湿、密闭、管理粗放的历年溃疡病发较重的6个果园用于试验，分别标为1-6号果园，保证每个果园中的柑橘树的树种、树龄、长势及水肥管理等条件一致，每个果园随机选择50棵柑橘树作为试验柑橘树。
[0027]
分别将实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂稀释成800倍液，然后分别对1-5号果园中的试验柑橘树进行喷施处理，同时作为空白对照组，不对第6号果园中的试验柑橘树喷施任何农药。在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌水分散粒剂用量为1g/株。
[0028]
分别于施药前和第二次施药后7d，14d，21d和28d调查防治效果，每株按东，西，南，北，中五点取样，每点调查10个果及两个叶梢上的全部叶片，记录总叶(果)数，各级病叶(果)数，叶(果)危害等级，并计算病情指数和防治效果，记录和计算方式及计算结果如下：叶(果)危害分级方法：0级：无病；1级：每个叶(果)有病斑1-5个；3级：每个叶(果)有病斑6-10个；5级：每个叶(果)有病斑11-15个；7级：每个叶(果)有病斑16-20个；9级：每个叶(果)有病斑21个以上；病情指数＝{[∑(各级病果数
×
相应级数值)]/调查总果数
×
9}
×
100；防治效果(%)＝[1-(空白对照组药前病情指数
×
喷施处理后病情指数)/(空白对照组药后病情指数
×
喷施处理前病情指数)]
×
100；
[0029]
试验例4在广西南宁市武鸣区仙湖镇那溪村选取在低洼、潮湿、密闭、管理粗放的历年溃疡
病发较重的6个果园用于试验，分别标为1-6号果园，保证每个果园中的柑橘树的树种、树龄、长势及水肥管理等条件一致，每个果园随机选择50棵柑橘树作为试验柑橘树。
[0030]
分别将实施例1-3和对比例1-2制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂稀释成800倍液，然后分别对1-5号果园中的试验柑橘树进行喷施处理，同时作为空白对照组，不对第6号果园中的试验柑橘树喷施任何农药。在柑橘溃疡病发病初期进行第一次施药，第一次施药结束7天后进行第二次施药，每次施药时枯草芽孢杆菌水分散粒剂用量为2g/株。
[0031]
分别于施药前和第二次施药后7d，14d，21d和28d调查防治效果，每株按东，西，南，北，中五点取样，每点调查10个果及两个叶梢上的全部叶片，记录总叶(果)数，各级病叶(果)数，叶(果)危害等级，并计算病情指数和防治效果，记录和计算方式及计算结果如下：叶(果)危害分级方法：0级：无病；1级：每个叶(果)有病斑1-5个；3级：每个叶(果)有病斑6-10个；5级：每个叶(果)有病斑11-15个；7级：每个叶(果)有病斑16-20个；9级：每个叶(果)有病斑21个以上；病情指数＝{[∑(各级病果数
×
相应级数值)]/调查总果数
×
9}
×
100；防治效果(%)＝[1-(空白对照组药前病情指数
×
喷施处理后病情指数)/(空白对照组药后病情指数
×
喷施处理前病情指数)]
×
100；
[0032]
由试验例2-4的结果可知，实施例1-3制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂在0.5g/株的用量时，就已经达到很好的防治效果，后期将用量调整至1g/株和2g/株时，防治效果也有提升，但是提升效果不大，说明已经到了枯草芽孢杆菌的防治极限，因此，对于实施例1-3制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂来说，将用量控制在0.5g/株即可；而随着枯草芽孢杆菌水分散粒剂用量依次增大，对比例1和对比例2制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的防治效果相差较大，说明对于对比例1和对比例2制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂来说，需要控制在大用量的情况下才能够达到好的防治效果，说明通过二次发酵和在一次混合中使用微孔化高岭土和偶联化崩解剂，能够降低枯草芽孢杆菌水分散粒剂的用量；此外，对比例1制备的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的防治效果一直是最差的，说明通过二次发酵，能够提高枯草芽孢杆菌的芽孢率和发酵液活菌数，同时氮化硼还能够对枯草芽孢杆菌进行吸附，防止枯草芽孢杆菌的流失，从而提高水分散粒剂对柑橘溃疡病的防治效果。
[0033]
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
[0034]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：菌种活化、种子液制备、一次发酵培养、二次发酵培养、制备枯草芽孢杆菌菌粉、混合、粉碎、造粒；所述二次发酵培养的方法为，向一次发酵液中加入蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁进行二次发酵培养，控制二次发酵培养的通气量为1.2-1.4v／v
•
min，搅拌速度为310-330rpm，温度为34-36℃，培养时间为12-14h，得到二次发酵液；所述混合的方法为，将枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788混合均匀，得到混合物；所述混合中，枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂nno、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788的重量比为30-33:4-6:17-20:70-75:14-16:2-3:2-4；所述微孔化高岭土的制备方法为：将高岭土置于密闭容器中，将密闭容器抽真空至真空度为0.08-0.09mpa，然后向密闭容器中通入氮气至气体压力为0.04-0.05mpa，然后将密闭容器的温度升高至180-200℃，在180-200℃下热处理后将密闭容器的温度升高至400-450℃，在400-450℃下继续热处理，然后自然冷却至室温，得到微孔化高岭土；所述偶联化崩解剂的制备方法为：将焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550混合后均匀后置于50-55℃下静置，然后加入微晶纤维素继续混合均匀后，置于50-55℃下继续静置，得到偶联化崩解剂；所述偶联化崩解剂的制备中，焦磷酸钠、焦磷酸钾、硫酸钠、硅烷偶联剂kh550、微晶纤维素的重量比为10-14:15-16:3-5:0.5-1:2-4；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述菌种活化的方法为，挑取保存在lb斜面培养基上的枯草芽孢杆菌，在lb固体培养基上进行三区划线，于35-37℃下培养23-25h，得到活化的菌株。3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述种子液制备的方法为，从活化的菌株中挑取单菌落接种到种子培养基上，在260-280rpm的条件下摇床培养16-18h，控制摇床培养的温度为35-37℃，摇床培养结束得到种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：1.5-1.8份葡萄糖，1-1.5份蛋白胨，0.7-1份酵母粉，0.7-1份牛肉膏，0.5-0.8份氯化钠，93.9-96.6份去离子水。4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述一次发酵培养的方法为，按照体积百分比为2.5-3.5%的接种量向发酵培养基中接入种子液进行一次发酵培养，控制一次发酵培养的通气量为1-1.2v／v
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min，搅拌速度为300-320rpm，温度为36-38℃，培养时间为22-24h，得到一次发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：70-80份玉米淀粉,50-55份玉米浆干粉，4-6份葡萄糖，3-5份碳酸钙，1-3份硫酸镁，1-2份磷酸氢二钠，0.5-1份硫酸锰，0.5-1份硫酸锌，750-800份去离子水；所述一次发酵培养中，发酵培养基的ph为7-7.5。5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述二次
发酵培养中，一次发酵液、蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁的重量比为280-300:2-4:20-25:0.5-0.8:0.2-0.5:0.1-0.3。6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述制备枯草芽孢杆菌菌粉的方法为，将二次发酵液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥的进风温度为110-115℃，出风温度为60-65℃，喷雾干燥结束得到枯草芽孢杆菌菌粉。7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述粉碎的方法为，将混合物置于气流粉碎机中粉碎至100-200目，得到原料粉；所述造粒的方法为，将原料粉与去离子水混合后，搅拌捏合，然后通过孔径为1-1.2mm的挤出孔板进行挤压造粒，得到枯草芽孢杆菌水分散粒剂；所述造粒中，原料粉与去离子水的重量比为85-90:10-15。8.一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂，其特征在于，采用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得。9.一种权利要求8所述的枯草芽孢杆菌水分散粒剂在柑橘溃疡病中的应用。

技术总结
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂及其制备方法与应用，属于微生物菌剂技术领域，所述制备方法由以下步骤组成：菌种活化、种子液制备、一次发酵培养、二次发酵培养、制备枯草芽孢杆菌菌粉、混合、粉碎、造粒；所述二次发酵培养的方法为，向一次发酵液中加入蔗糖、豆粕粉、氮化硼、甜菜碱、硫酸镁进行二次发酵培养，得到二次发酵液；所述混合的方法为，将枯草芽孢杆菌菌粉、分散剂NNO、木质素磺酸钠、微孔化高岭土、偶联化崩解剂、十二烷基苯磺酸钙、聚乙烯醇1788混合均匀，得到混合物；本发明能够降低枯草芽孢杆菌水分散粒剂的用量，同时还能够提高枯草芽孢杆菌水分散粒剂的悬浮率，降低润湿时间、崩解时间和热贮分解率。润湿时间、崩解时间和热贮分解率。


技术研发人员：郭中信 李达 王茂超 王宏鑫 冀墨
受保护的技术使用者：山东京青农业科技有限公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/7/17