多肽PD-DP-005的有关物质分析方法与流程

005溶液，作为所述供试品溶液；步骤s2，设置色谱参数：在所述高效液相色谱仪系统上设置色谱条件的参数，包括，色谱柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；洗脱液包括流动相a和流动相b，所述流动相a为硫酸铵缓冲液，所述硫酸铵缓冲液的浓度为45~55mmol/l，用磷酸调ph为2.0~2.2；所述流动相b为乙腈；梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100%计，所述梯度洗脱的洗脱程序为第0-10 min，流动相a：流动相b体积比由90：10改变为75：25；第10-40 min，流动相a：流动相b体积比由75：25改变为71：29；第40-45 min，流动相a：流动相b体积比由71：29改变为35：65；第45-52 min，流动相a：流动相b体积比由35：65改变为90：10；第52-55 min，流动相a：流动相b体积比为90：10；流速为0.5~0.9ml/min；柱温58~62℃；检测波长为218nm~222nm；步骤s3，实施检测：将所述空白溶液和所述供试品溶液分别注入所述高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
7.进一步的，所述供试品溶液中含有多肽pd-dp-005的质量浓度0.5~1.0mg/ml。
8.进一步的，所述硫酸铵缓冲液的浓度为50mmol/l，用磷酸调ph为2.1。
9.进一步的，所述色谱柱包括phenomenex aeris peptide xb-c18柱，规格为250
×
4.6mm，2.6 μm。
10.进一步的，所述流速为0.7 ml/min，柱温为60℃。
11.进一步的，检测波长为220nm。
12.进一步的，步骤s3中，注入到所述高效液相色谱仪中的样品体积为10~20μl。
13.进一步的，步骤s3中，步骤s3中，实施检测过程中，主峰多肽pd-dp-005保留时间为21.02
±
0.5min，主峰峰纯度阈值大于990，且与相邻杂质峰的分离度不小于1.5。
14.进一步的，按照面积百分比计算各个有关物质的含量。
15.进一步的，所述高效液相色谱仪包括waters e2695高效液相色谱仪，配置dad检测器。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）本发明提供的有关物质分析方法以硫酸铵缓冲液为洗脱溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在特定的色谱条件下，能够检测出更多的杂质，可有效控制多肽pd-dp-005的质量，而且硫酸铵和十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱相较于现有多肽检测方法中用到的流动相和色谱柱，价格低廉，还可节约多肽pd-dp-005的分析检测成本；（2）本发明提供的多肽pd-dp-005的有关物质分析方法在色谱分离过程中，在流动相硫酸铵缓冲液和固定相十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的协同作用下，硫酸铵缓冲液使得色谱柱上的硅醇基的离子化受抑制，减少了固定相与多肽pd-dp-005样品的质子化溶质间不必要的相互作用，从而减少了色谱峰拖尾现象，在特定的色谱条件下，提高了
多肽pd-dp-005在固定相中的选择性和保留能力，改善了分离效果；（3）本发明提供的多肽pd-dp-005的有关物质分析方法在梯度洗脱过程中，通过调整有机相乙腈的比例变化，并控制柱温，使得多肽pd-dp-005的色谱峰更窄更对称，检测出更多的杂质，且多肽pd-dp-005与其相邻的杂质峰分离度不低于1.5；（4）通过对多肽pd-dp-005有关物质检测方法进行优化，建立更完善的分析方法，使之更加科学化、规范化，增强竞争力，具有重大的实际意义和学术价值。
附图说明
17.图1为本发明实施例1的典型谱图；图2为本发明对比例1的典型谱图；图3为本发明对比例2的典型谱图；图4为本发明对比例3的典型谱图；图5为本发明对比例4的典型谱图；图6为本发明对比例5的典型谱图；图7为本发明对比例6的典型谱图；图8为本发明对比例7的典型谱图；图9为本发明对比例8的典型谱图；图10为本发明对比例9的典型谱图；图11为本发明对比例10的典型谱图。
18.图中“usp”指美国药典委员会。
具体实施方式
19.以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
20.在本发明中，氨基酸残基以下列简写符号记载：丙氨酸(ala或a)，精氨酸(arg或r)，天冬酰胺(asn或n)，天冬氨酸(asp或d)，半胱氨酸(cys或c)，谷氨酰胺(gln或q)，谷氨酸(glu或e)，甘氨酸(gly或g)，组氨酸(his或h)，异亮氨酸(ile或i)，亮氨酸(leu或l)，赖氨酸(lys或k)，甲硫氨酸(met或m)，苯丙氨酸(phe或f)，脯氨酸(pro或p)，丝氨酸(ser或s)，苏氨酸(thr或t)，色氨酸(trp或w)，酪氨酸(tyr或y)，缬氨酸(val或v)，以及任意的氨基酸残基(xaa或x)。此外，在本说明书中，肽的氨基酸序列是依常法以氨基末端(以下称为n末端)位于左侧，羧基末端(以下称为c末端)位于右侧的方式加以记载，序列中氨基酸位置从左往右依次定义1、2、3
……
34。
21.本发明的多肽pd-dp-005的氨基酸序列为：cpqvcpaiyqpvfdefgrmysnscemqrarclrg。
22.本发明中所述的氧化复性/氧化折叠方法指的是含有二硫键的蛋白质的折叠过程被称作氧化复性或氧化折叠，在此过程中蛋白质形成正确的三级结构，同时多个半胱氨酸残基准确配对形成正确的二硫键。
23.本发明中多肽pd-dp-005的化学合成工艺如下：采用固相化学合成法合成。称取树脂0.2g放置于干燥洁净的反应管中，加入适量的n,n-二甲基酰胺（dmf），活化30min作用，将称取第一氨基酸残基1mmol，dmap150mg加入到反应管中，dmf做为溶剂反应3h。反应完毕后用dmf洗3-6次，加入适当的吡啶和乙酸酐，体积比为1:1，反应30 min。反应完毕后dmf洗3-6次。然后用哌啶洗脱氨基酸的保护基团fmoc，洗脱两次每次15min，再用dmf洗4次，甲醇洗2次。称第二个氨基酸3mmol，hbtu3mmol于反应管中，加入diea0.5ml，反应40分钟，用dmf洗3-6次，加入哌啶溶液两次洗脱氨基酸的保护基团fmoc，每次10分钟，再用dmf洗4次，甲醇洗2次。重复第二个步骤直到最后一个氨基酸残基，最后一个氨基酸反应完毕后，用三氟乙酸切割2小时，反应抽滤，得到多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，再用乙醚洗3-5遍，得到白色固体，经过hplc脱盐冻干得到多肽样本，采用制备色谱纯化，得到纯度高的多肽pd-dp-005。
24.采用氧化复性/氧化折叠方法形成二硫键。称取50ml复性液量的试剂，用45ml 去离子水溶解，调ph值到7.5，称取5mg纯化好的样品放入1.5ml ep管中，然后用1ml 去离子水溶解。将配好的复性液转移至用锡箔纸包好的50ml离心管中，将溶解好的样品缓慢滴入离心管中，待1ml样品滴完后，往ep管中再加两次去离子水继续滴入离心管中确保样品完全加入复性液中。盖好离心管盖子并用封口膜封好口放入4℃冰箱，24h后加入0.5 ml 50%tfa终止反应。
25.最终复性条件采用为gsh：gssg=1.5mmol/l:0.15mmol/l，ph7.2，温度28℃，24小时。进一步采用制备色谱纯化，然后冻干多肽样品，采用质谱对合成多肽纯度、氨基酸残基组成及分子量进行测定证实合成产物是目的多肽pd-dp-005，mw=3956.60。
26.本发明提供的多肽pd-dp-005有关物质的高效液相色谱分析方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
27.本发明提供的了一种多肽pd-dp-005的有关物质分析方法，采用高效液相色谱仪，该方法包括以下具体步骤：步骤s1、制备溶液：制备溶液的方法比较灵活，在这里不做限定，在本实施例中，按照如下描述进行溶液的制备：空白溶液：水；供试品溶液：取多肽pd-dp-005适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5~1.0mg的溶液；步骤s2、设置色谱参数：在高效液相色谱仪上设置色谱条件的参数。
28.色谱柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；色谱柱可以为phenomenex aeris peptide xb-c18柱，规格为250
×
4.6mm，2.6 μm。
29.洗脱液包括流动相a和流动相b，所述流动相a为硫酸铵缓冲液，所述硫酸铵缓冲液的浓度为45~55mmol/l，用磷酸调ph为2.0~2.2；所述流动相b为乙腈；梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100%计，所述梯度洗脱的洗脱程序为第0-10min，流动相a：流动相b体积比由90：10改变为75：25；第10-40 min，流动相a：流动相b体积比由75：25改变为71：29；第40-45 min，流动相a：流动相b体积比由71：29改变为35：65；第
45-52 min，流动相a：流动相b体积比由35：65改变为90：10；第52-55 min，流动相a：流动相b体积比为90：10；流速为0.5~0.9ml/min；柱温58~62℃；检测波长为218nm~222nm；硫酸铵缓冲液的配制：取6.6g硫酸铵于1l超纯水中使之溶解，用磷酸调节ph为2.0~2.2即得。
30.步骤s3、实施检测在本实施例中，空白溶液和供试品溶液分别注入所述高效液相色谱仪，各进样1针，记录色谱图时间50~55分钟。
31.色谱图处理的积分参数设置如下：峰宽为25、斜率为40、最小峰面积为100。
32.为了证明本发明提供的有关物质分析方法可靠，下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1本实施例提供的一种多肽pd-dp-005的有关物质分析方法。
33.供试品溶液：取多肽pd-dp-005适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液；硫酸铵缓冲液的配制：取6.6g硫酸铵于1l超纯水中使之溶解，用磷酸调节ph为2.1即得。
34.本实施例在高效液相色谱仪系统上设置的色谱参数如表1所示：表1.实施检测后的结果如图1，保留时间在21.02min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，dad检测峰纯度的阈值为998，表明为单一组分，供检测出的杂质个数为10个，各杂质的含量均不小于0.08%，相邻杂质峰与主峰的分离度分别为1.51和2.25，符合规定。
35.实施例2本实施例基本同实施例1，不同之处为，检测波长为218nm，流动相a：55mmol/l硫酸铵缓冲液（用磷酸调ph为2.2），柱温58℃。
36.实施例3
本实施例基本同实施例1，不同之处为，检测波长为222nm，流动相a：45mmol/l硫酸铵缓冲液（用磷酸调ph为2.0），柱温62℃。
37.实施例4本实施例基本同实施例1，不同之处为，流速为0.5ml/min。
38.实施例5本实施例基本同实施例1，不同之处为，流速为0.9ml/min。
39.对比例1样品配制同实施例1。
40.空白溶液：水；供试品溶液：取多肽pd-dp-005适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液；流动相a：取5.4g无水碳酸钠于1l超纯水中使之溶解，用磷酸调节ph为2.1即得。
41.本试验在高效液相色谱仪上设置的色谱参数同实施例1。
42.实施检测后的结果如图2所示，因30min后基本没有杂质洗脱出来，图2显示的是30min内的色谱图，保留时间在2.612min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，该方法主峰洗脱太快，导致杂质没有与主峰分离开，相邻杂质峰与主峰的分离度没有达到基线分离，不符合规定。碳酸缓冲盐溶液不适合用于多肽pd-dp-005的分离，对杂质的洗脱能力弱。
43.对比例2空白溶液：水；供试品溶液：取多肽pd-dp-005适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液；流动相a：取6.0g无水磷酸二氢钠于1l超纯水中使之溶解，用磷酸调节ph为2.1即得；本试验在高效液相色谱仪上设置的色谱参数同实施例1。
44.实施检测后的结果如图3所示，因30min后基本没有杂质洗脱出来，图3显示的是30min内的色谱图，保留时间在2.613min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，该方法主峰洗脱太快，导致杂质没有与主峰分离开，相邻杂质峰与主峰的分离度没有达到基线分离，不符合规定。磷酸缓冲盐溶液不适合用于多肽pd-dp-005的分离，对杂质的洗脱能力弱。
45.对比例3本对比例基本同实施例1，不同之处为，梯度洗脱程序不同。
46.本对比例提供的梯度洗脱程序如表2所示：表2.实施检测后的结果如图4所示，保留时间在17.810min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，相邻杂质峰与主峰多肽pd-dp-005没有达到基线分离，不符合规定。可见，有机相乙
dp-005，多肽pd-dp-005的纯度为94.6%，杂质个数为9个，各杂质的含量均不小于0.08%，位于主峰前面的相邻杂质峰与主峰多肽pd-dp-005没有达到基线分离，位于主峰后面的相邻杂质峰与主峰多肽pd-dp-005分离度为2.870，分离效果提高了，但仍不符合规定。
53.对比例7本对比例基本同实施例1，不同之处为，柱温不同。
54.本对比例提供的柱温为55℃。
55.实施检测后的结果如图8所示，保留时间在20.807min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，多肽pd-dp-005的纯度为92.22%，杂质个数为10个，各杂质的含量均不小于0.07%，相较于对比例6，本实施例条件下，检测到的杂质个数多，相邻杂质与主峰多肽pd-dp-005没有完全基线分离，不符合规定。
56.对比例8本对比例基本同实施例1，不同之处为，流动相a的ph不同。
57.本对比例提供的ph为3.1。
58.实施检测后的结果如图9所示，保留时间在16.698min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，多肽pd-dp-005的纯度为92.70%，杂质个数为8个，各杂质的含量均不小于0.10%，相邻杂质与主峰多肽pd-dp-005没有完全基线分离，不符合规定。
59.对比例9本对比例基本同实施例1，不同之处为，流动相a的ph不同。
60.本对比例提供的ph为4.1。
61.实施检测后的结果如图10所示，保留时间在15.217min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，多肽pd-dp-005的纯度为95.31%，杂质个数为7个，相邻杂质与主峰多肽pd-dp-005没有完全基线分离，不符合规定。可见，样品中的多肽pd-dp-005在该ph条件下，没有完全质子化，分配系数小，因此主成分多肽pd-dp-005与杂质难以实现完全分离。
62.对比例10本对比例基本同实施例1，不同之处为，流动相a的ph不同。
63.本对比例提供的ph为7.0。
64.实施检测后的结果如图11所示，保留时间在15.474min左右的峰为主成分多肽pd-dp-005，多肽pd-dp-005的纯度为93.24%，杂质个数为9个，相邻杂质与主峰多肽pd-dp-005没有完全基线分离，不符合规定。
65.通过比较实施例1和对比例8-10的色谱图和数据，可知，缓冲盐ph 2.1体系下纯度92.91%，杂质个数为10，主峰与杂质分离度1.51，对称因子1.060，理论塔板数为37598，而缓冲盐ph 3.1、4.1与7.0体系下主峰与杂质峰未分离开，且检测出的杂质个数均较ph2.1少，杂质洗脱能力较弱，因此选择ph 2.1作为本技术的流动相的ph。
66.以上未涉及之处，适用于现有技术。
67.虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技进行术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种多肽pd-dp-005的有关物质分析方法，所述多肽pd-dp-005的氨基酸序列为cpqvcpaiyqpvfdefgrmysnscemqrarclrg，采用高效液相色谱仪，其特征在于，所述有关物质分析方法包括以下具体步骤：s1、制备溶液：空白溶液：水；供试品溶液：取多肽pd-dp-005适量，加入空白溶液溶解稀释得多肽pd-dp-005溶液，作为所述供试品溶液；s2、设置色谱参数：在所述高效液相色谱仪上设置色谱条件的参数，包括，色谱柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；洗脱液包括流动相a和流动相b，所述流动相a为硫酸铵缓冲液，所述硫酸铵缓冲液的浓度为45~55mmol/l，用磷酸调ph为2.0~2.2；所述流动相b为乙腈；梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100%计，所述梯度洗脱的洗脱程序为第0-10min，流动相a：流动相b体积比由90：10改变为75：25；第10-40 min，流动相a：流动相b体积比由75：25改变为71：29；第40-45 min，流动相a：流动相b体积比由71：29改变为35：65；第45-52 min，流动相a：流动相b体积比由35：65改变为90：10；第52-55 min，流动相a：流动相b体积比为90：10；流速为0.5~0.9ml/min；柱温58~62℃；检测波长为218nm~222nm；s3、实施检测：将所述空白溶液和所述供试品溶液分别注入所述高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，记录色谱图。2.如权利要求1所述的有关物质分析方法，其特征在于，所述供试品溶液中含有多肽pd-dp-005的质量浓度为0.5~1.0mg/ml。3.如权利要求1所述的有关物质分析方法，其特征在于，所述硫酸铵缓冲液的浓度为50mmol/l，用磷酸调ph为2.1。4.如权利要求3所述的有关物质分析方法，其特征在于，所述色谱柱包括phenomenex aeris peptide xb-c18柱，规格为250
×
4.6mm，2.6 μm。5.如权利要求4所述的有关物质分析方法，其特征在于，所述流速为0.7 ml/min，柱温为60℃。6.如权利要求4所述的有关物质分析方法，其特征在于，检测波长为220nm。7.如权利要求4所述的有关物质分析方法，其特征在于，步骤s3中，注入到所述高效液相色谱仪中的样品体积为10~20μl。8.如权利要求4所述的有关物质分析方法，其特征在于，步骤s3中，实施检测过程中，主峰多肽pd-dp-005保留时间为21.02
±
0.5min，主峰峰纯度阈值大于990，且与相邻杂质峰的分离度不小于1.5。9.如权利要求1所述的有关物质分析方法，其特征在于，按照面积百分比计算各个有关物质的含量。
10.如权利要求1所述的有关物质分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪包括waters e2695高效液相色谱仪，配置dad检测器。

技术总结
本发明涉及多肽药物分析检测技术领域，特别涉及多肽PD-DP-005的有关物质分析方法。该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，硫酸铵缓冲液为流动相，硫酸铵缓冲液使得色谱柱上的硅醇基的离子化受抑制，减少固定相与多肽PD-DP-005样品的质子化溶质间不必要的相互作用，从而减少了色谱峰拖尾现象，在特定的色谱条件下，提高了多肽PD-DP-005在固定相中的选择性和保留能力，改善了分离效果，能够检测出更多的杂质，主成分多肽PD-DP-005的色谱峰更窄更对称，且与其相邻的杂质峰分离度不低于1.5。该方法可有效控制多肽PD-DP-005的质量，还可节约多肽PD-DP-005的分析检测成本。检测成本。检测成本。


技术研发人员：占培 容明强 谷陟欣
受保护的技术使用者：成都佩德生物医药有限公司
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/7/17