诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法与流程

1.本发明涉及一种诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，属于胚胎发育与组织再生医学技术领域。


背景技术：

2.糖尿病是一种全身性代谢疾病，能够引发多器官并发症，包括糖尿病肾病、眼底血管病变、糖尿病足等，是已知并发症最多的疾病，严重影响患者的生活质量。糖尿病患者若血糖控制不佳，可诱发酮症酸中毒和高渗性高血糖血症，威胁患者的生命。其中，ⅰ型糖尿病是由胰岛β细胞功能缺陷导致的胰岛素分泌不足所致，ⅱ型糖尿病则由体内胰岛素抵抗所导致的相对胰岛素不足所致。糖尿病患者的慢病管理过程漫长且繁琐，包括长期的生活干预、血糖检测、口服药物治疗和持续的胰岛素替代治疗，繁杂的治疗过程降低了患者的依从性。因此，近年来有许多研究探索细胞替代治疗的可行性。
3.胰岛直接移植是最早的细胞替代疗法，国外研究者从刚刚脑死亡的患者获取胰腺样本，往主胰管中注入胶原酶进行消化，然后在显微镜下分选胰岛，移植给糖尿病患者。但是，这样的方法有明显的弊端：首先，符合条件的脑死亡捐献者非常稀缺，因此胰岛的来源不足；其次，胶原酶消化胰腺的时间难以把握，并且在显微镜下手工分离胰岛的操作困难，对操作者的操作水平要求较高；再次，捐献者的胰岛在进入糖尿病患者体内后，会受到宿主免疫系统的攻击，因免疫排斥反应而存活率不佳。
4.干细胞来源充足，为糖尿病的细胞替代疗法开拓了新的思路。目前，世界上有几百项登记注册的干细胞治疗糖尿病临床试验。有些研究者将干细胞直接注射入糖尿病患者的血管或肝脏中，有的研究者则在体外诱导干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛细胞团后，再通过微囊包裹的方式移植到糖尿病患者体内。2006年，kevin等人建立了将esc诱导为类胰岛细胞团的方法，这项研究首次完成了干细胞在体外的诱导分化，并且得到了能够分泌胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等的细胞产品，具有里程碑意义。2014年，douglas等人建立了将ipsc诱导为类胰岛细胞团的方法，并证实该细胞团在移植到小鼠肾被膜下后，可分泌胰岛素进入血液循环。2023年3月10日，美国食品和药物管理局（fda）批准了vx-264启动临床试验，vx-264是一种由免疫保护装置包裹的干细胞衍生胰岛，在不需要使用免疫抑制剂的情况下，具有功能性治愈ⅰ型糖尿病的潜力。
5.但是，无论是胚胎干细胞（esc）还是诱导多能干细胞（ipsc），都存在安全性问题，即潜在的致瘤性。2022年3月，云南省肿瘤医院研究人员报告了一例在接受ipsc衍生细胞治疗后出现不成熟畸胎瘤的病例，且该畸胎瘤比一般的畸胎瘤更具侵袭性。干细胞因其多向分化潜能受到关注和重视，也因其分化不确定性而受到质疑。在2013年，王玲等人提出，esc是一群异质性细胞，分化过程中的残留现象可能是其固有的特性。而ipsc则在制备细胞过程中，就激活了“癌基因”，如c-myc等。除此之外，制备esc细胞时，种子细胞来源还可能涉及伦理学问题。
6.理想的干细胞衍生胰岛应满足以下四个条件：一、作为分化起点的干细胞，应该有
充足的来源，容易制备，且不涉及伦理学问题；二、作为分化终点的类胰岛细胞团，应该有充分的安全性保证，不会在移植后致瘤；三、分化过程简洁，可操作性强，各个分化阶段的培养基易于配制；四、分化效果稳定，有充足的证据表明类胰岛细胞团具有分泌胰岛素的功能。然而，目前制备干细胞衍生胰岛的方案，使用的大多是ipsc或esc，存在分化不确定性大，难以定向分化，致瘤风险高，分化步骤多且繁琐，分化效率低等不足之处。
7.中国发明专利申请cn 110423720 a公开了一种利用人羊膜上皮干细胞诱导分化为具有生物功能的胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：1)羊膜上皮干细胞的分离、培养、扩增、鉴定；2)体外诱导分化：实验选择第2～3代羊膜上皮干细胞，用含有尼克酰胺的培养基进行诱导分化。经体外14天分化得到能够表达胰岛β细胞特异性标志物及具有正常胰岛β细胞功能的胰岛素分泌细胞；3)体内移植：将诱导产生的胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病小鼠体内，可明显缓解小鼠高血糖状态。其分化使用了两种诱导培养基。


技术实现要素：

8.针对上述现有技术，本发明提供了一种诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法。
9.本发明是通过以下技术方案实现的：一种诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，包括以下步骤：（1）取间充质干细胞，接种至培养板中，加入干细胞基础培养基，37℃、5%co2条件下培养1天；（2）上述培养1天后，细胞贴壁，进入分化阶段1，将培养液换为含有10%（体积百分数）胎牛血清（fbs）的dmem/f12培养基，37℃、5%co2条件下共培养3天，培养过程中进行1次换液；（3）上述共培养3天后，进入分化阶段2，换液为神经细胞条件培养基（neuronal-conditioned medium, ncm），37℃、5%co2条件下共培养5天，培养过程中进行1次换液；（4）上述共培养5天后，进入分化阶段3，换液为分化培养基，37℃、5%co2条件下共培养9天，培养过程中每2天进行1次换液，共计加入分化培养基5次；即得类胰岛细胞团；所述分化培养基由以下组分组成：15～20 mm葡萄糖，8～12 mm烟酰胺，8～12 nm exendin-4（艾塞那肽），8～12 nm五肽胃泌素，80～120 pm肝细胞生长因子，8～12μm 5-羟色胺（5-ht），8～12μm丁酰胺，0.08～0.12 mg/ml tpo（促血小板生成素），1%～5%（体积百分数）的b27无血清添加剂，余量为dmem/f12培养基。
10.进一步地，所述步骤（1）中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
11.进一步地，所述步骤（1）中，接种密度为2
×
105细胞/孔。
12.进一步地，所述步骤（1）中，每孔加入2 ml的培养基。
13.进一步地，所述步骤（1）中，所述干细胞基础培养基为现有技术中已有的商品化培养基，可以选自达科为的达优间充质干细胞基础培养基（货号：6114011）。
14.进一步地，所述步骤（3）中，神经细胞条件培养基是通过以下方法制备得到的：取大鼠脑，置于含10% fbs的dmem/f12培养基中，匀浆将大鼠脑彻底磨碎，50μm细胞滤网过滤得细胞悬液；细胞悬液在37℃、5%co2条件下培养20～28小时；取出培养的上清，向上清中补加含10% fbs的dmem/f12培养基，37℃、5%co2条件下培养4天；收集培养的上清，离心，过
0.22μm细胞滤网，即得神经细胞条件培养基。
15.进一步地，所述步骤（4）中，分化培养基由以下组分组成：17.5 mm葡萄糖，10 mm烟酰胺，10 nm exendin-4，10 nm五肽胃泌素，100 pm肝细胞生长因子，10μm 5-羟色胺，10μm丁酰胺，0.1 mg/ml tpo，2%的b27无血清添加剂，余量为dmem/f12培养基。
16.本发明的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，采用临床上取材方便、来源丰富的脐带间充质干细胞，建立稳定的间充质干细胞分离和分化体系，以间充质干细胞为起点，诱导其分化为类胰岛细胞团。间充质干细胞分化不确定性相对较小，临床应用更加安全，而且提取间充质干细胞的过程也不会违背伦理学原则。尽管研究者也顾虑间充质干细胞的致瘤风险，但多年的临床应用显示，尚未有此类事件发生。以往诱导esc或ipsc分化的操作流程，大多分为4～6个分化阶段，历时一个月左右，每个分化阶段需要分别配制不同的分化培养基，配制过程繁琐。而本发明的诱导间充质干细胞分化的流程，只有3个分化阶段，历时17天即可完成，用时短，只需配制一种分化培养基，操作简便。本发明的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，效果显著，具有良好的应用前景，对糖尿病的细胞替代疗法的发展具有重要意义。
17.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
18.图1：间充质干细胞流式细胞鉴定结果示意图，其中，a：cd34-；b：cd45-；c：cd73+；d：cd90+。
19.图2：类胰岛细胞团的双硫腙染色结果示意图。
20.图3：分化阶段2细胞的神经巢蛋白染色结果示意图。
21.图4：分化阶段3类胰岛细胞团的胰岛素染色结果示意图。
22.图5：分化阶段3类胰岛细胞团的免疫荧光染色结果示意图。
实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
24.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
25.实施例1 脐带间充质干细胞的采集步骤如下：（1）用0.9%生理盐水洗涤脐带，然后放入10 cm培养皿中。向培养皿中加入75%乙醇溶液，浸没整根脐带，浸泡5 min。将脐带转入新的培养皿中，加入生理盐水洗涤，重复清洗直至血渍和酒精清理干净。
26.（2）将洗涤干净的脐带放入新的培养皿中，两端结扎部分剪掉，丢弃，剩余脐带剪成若干段2～3 cm长的小段。加入生理盐水清洗剪成小段的脐带，重复清洗直至血渍去除，洗涤液清澈。
27.（3）找到脐静脉，沿静脉血管的螺旋走向将小段脐带剪开，剔除脐带中的动静脉。用组织镊将华通氏胶撕下，将剥离出的华通氏胶转移到50 ml离心管中，离心管中预先加入适量的生理盐水防止华通氏胶变干。在离心管中将华通氏胶剪碎成1～8 mm3的小块。
28.（4）向离心管中加生理盐水至45 ml，离心750 g，10min，弃上清。
29.（5）向离心管中加生理盐水至45 ml，离心750 g，10min，弃上清。
30.（6）将华通氏胶接种到t75培养瓶中培养，每个t75培养瓶接种1 g华通氏胶，加入4 ml脐带细胞完全培养液。培养条件：温度37℃，co2浓度5%，饱和湿度。可观察到间充质干细胞从组织内爬出。
31.（7）所得间充质干细胞用mscbm培养基进行培养。
32.实施例2 间充质干细胞的鉴定采用流式细胞技术检测细胞表面标记物，间充质干细胞表面标记物：cd73+，cd90+，cd34-，cd45-，步骤如下：（1）将1 ml细胞悬液转移至1.5 ml离心管中。4℃、300 g离心5分钟，小心吸取，弃去上清。
33.（2）用适量pbs缓冲液清洗细胞，4℃、300 g离心5分钟，小心吸取，弃去上清。
34.（3）用预冷的pbs缓冲液重悬细胞，调整细胞终浓度为1
×
10
7 cells/ml，轻轻吹打混匀。
35.（4）取100μl细胞悬液作为空白对照组，取100μl细胞悬液作为同型对照组，加入同型对照抗体，取200μl作为实验组加入检测抗体，4℃孵育30分钟。
36.（5）加入适量pbs缓冲液清洗细胞，4℃、300 g离心5分钟，小心吸取，弃去上清。
37.（6）500μl pbs缓冲液重悬细胞，上机检测。
38.结果如图1所示，间充质干细胞的标志物：cd73+ 99.98%，cd90+ 99.26%。结果表明，实施例1培养的细胞为间充质干细胞，高表达cd73+，cd90+，低表达cd34-，cd45-。
39.实施例3 大鼠脑神经细胞条件培养基的制备步骤如下：（1）处死七日龄大鼠，取出鼠脑放入10 cm培养皿中，加入pbs缓冲液彻底洗去血渍。
40.（2）将鼠脑转移至新的10 cm培养皿中，加入含有10% fbs的dmem/f12培养基。用眼科剪将鼠脑切成小块后，转移至25 ml容积的玻璃组织匀浆器中，加入5 ml含10% fbs的dmem/f12培养基。将大鼠脑彻底磨碎后，往玻璃匀浆器中补加10 ml含10% fbs的dmem/f12培养基。
41.（3）取一个新的10 cm培养皿，在上面放置50μm孔径的细胞滤网。用胶头滴管吸取玻璃匀浆器中所得的细胞悬液，滴加在滤网上，过滤得到细胞悬液。样本放置于温度37℃、co2浓度5%条件下培养24小时。
42.（4）培养24小时后，观察培养物，上清中为神经细胞，而少突胶质细胞已经贴壁。因此，将上清转移到新的10 cm培养皿中，补加15 ml含10% fbs的dmem/f12培养基，继续培养四天。
43.（5）收集上清至50 ml离心管中，1000 g离心15分钟。用20 ml针筒分次抽取离心所得的上清，通过0.22μm的细胞滤网后，注射至新的50 ml离心管中，即得ncm。
44.实施例4 诱导间充质干细胞分化步骤如下：（1）将实施例1得到的脐带间充质干细胞接种在六孔板中，接种密度为2
×
105细胞/孔，每孔加入2 ml干细胞基础培养基（达科为的达优间充质干细胞基础培养基，货号：6114011），37℃、co2浓度5%条件下培养。
45.（2）待第二天细胞贴壁后，进入分化阶段1，换液为含有10% fbs的dmem/f12培养基，共培养3天，中间进行1次换液。
46.（3）进入分化阶段2，换液为实施例3制备的培养基，共培养5天，中间进行1次换液。
47.（4）进入分化阶段3，换液为分化培养基，共培养9天，中间每2天进行1次换液，共计加入分化培养基5次。
48.所述分化培养基由以下组分组成：17.5 mm葡萄糖，10 mm烟酰胺，10 nm exendin-4，10 nm五肽胃泌素，100 pm肝细胞生长因子，10μm5-羟色胺(5-ht),10μm丁酰胺，0.1 mg/mltpo(促血小板生成素），2%的b27无血清添加剂，余量为dmem/f12培养基。
49.（5）用针尖轻轻挑取六孔板中的细胞团块，即为类胰岛细胞团。
50.实施例5 体外分化效果观察间充质干细胞最初接种时，是平铺的单层细胞；而在进入分化阶段3后，会自发聚集形成类胰岛细胞团，直径在300～2000μm。针对这些细胞团，可进行相应的染色，以检测体外分化的效果。
51.（一）双硫腙染色双硫腙染色是鉴定胰岛最常用、简便的方法。胰岛β细胞含有的锌离子，可与双硫腙螯合形成樱桃红色复合物。
52.（1）取10 mg双硫腙溶于1 ml dmso中，然后按1:100用pbs缓冲液稀释，得到双硫腙染色工作液。
53.（2）往6孔板中加入双硫腙染色工作液，2 ml/孔，37℃孵育30分钟。
54.（3）用pbs缓冲液洗涤三次，然后加入甘油进行包被，光镜下观察。
55.结果如图2所示，分化所得的类胰岛细胞团双硫腙染色阳性。
56.（二）免疫组化染色（1）挑取分化所得细胞产品，加入4%多聚甲醛溶液，固定60 min。将固定好的细胞产品进行石蜡包埋，然后进行连续切片，每个切片的厚度在4μm，切片附着于载玻片上。
57.（2）依次将石蜡切片放入二甲苯
ⅰꢀ
10 min，二甲苯
ⅱꢀ
10 min，二甲苯
ⅲꢀ
10 min，无水乙醇
ⅰꢀ
5 min，无水乙醇
ⅱꢀ
5 min，90%乙醇溶液5 min，80%乙醇溶液5 min，70%乙醇溶液5 min，50%乙醇溶液5 min，梯度脱蜡。
58.（3）用 0.5％ triton x-100透化打孔 10 分钟。
59.（4）用pbs缓冲液洗涤切片3次，然后将切片在3%双氧水溶液（用甲醇稀释）中浸泡15 min，以封闭内源性过氧化物酶。
60.（5）将切片浸泡在10 mm柠檬酸溶液中，加热至100℃，10 min以修复抗原。然后将切片连同柠檬酸溶液放在室温缓慢、充分冷却。
61.（6）用pbs缓冲液洗涤切片3次，然后将切片转移至湿盒内，表面滴加10%牛血清白蛋白（bsa）溶液，室温封闭一小时。
62.（7）甩去封闭液，吸净水渍。分化阶段2的细胞，滴加神经巢蛋白抗体（cst，10959s，1:200稀释在pbs缓冲液中）；分化阶段3的细胞团，滴加胰岛素抗体（cst，3014s，1:1000稀释在pbs缓冲液中）。4℃孵育过夜。
63.（8）切片在室温复温一小时后，用pbs缓冲液洗涤切片3次，然后利用gtvision
tm detection system/mo＆rb（genetech，gk800511）进行显色，室温孵育10分钟。
64.（9）用pbs缓冲液洗去dab染色液，然后滴加苏木素，复染90秒。
65.（10）利用梯度过缸法进行脱水，然后用中性树脂进行封片。
66.（11）光镜下观察、拍照。
67.结果如图3、图4所示，分化阶段2所得的细胞，神经巢蛋白染色阳性。分化阶段3所得的类胰岛细胞团，胰岛素染色阳性。
68.结果分析：分化阶段2结束时，间充质干细胞已分化为神经内分泌细胞。分化阶段3结束时，间充质干细胞已分化出有产胰岛素功能的细胞。
69.（三）免疫荧光染色（1）样本的固定、包埋、切片、脱腊、打孔、过氧化氢酶封闭、热修复、封闭过程同上。
70.（2）分化阶段3的细胞团，分为两组，一组滴加胰岛素抗体（cst，3014s，1:1000稀释在pbs缓冲液中），一组滴加c肽抗体（cst，4593s，1:100稀释在pbs缓冲液中）。4℃孵育过夜。
71.（3）切片在室温复温一小时后，用pbs缓冲液洗涤切片3次，然后滴加荧光二抗（immunoway，rs3211，rs3811），室温避光孵育1小时。
72.（4）用pbs缓冲液洗涤切片3次，然后滴加dapi染色液，室温避光孵育10 min。
73.（5）用pbs缓冲液洗涤切片3次，然后滴加抗淬灭封片剂，封片。
74.（6）共聚焦显微镜下观察、拍照。
75.结果如图5所示，分化阶段3所得的类胰岛细胞团，胰岛素和c肽染色阳性。
76.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

技术特征：
1.一种诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取间充质干细胞，接种至培养板中，加入干细胞基础培养基，37℃、5%co2条件下培养1天；（2）上述培养1天后，细胞贴壁，进入分化阶段1，将培养液换为含有10%胎牛血清的dmem/f12培养基，37℃、5%co2条件下共培养3天，培养过程中进行1次换液；（3）上述共培养3天后，进入分化阶段2，换液为神经细胞条件培养基，37℃、5%co2条件下共培养5天，培养过程中进行1次换液；（4）上述共培养5天后，进入分化阶段3，换液为分化培养基，37℃、5%co2条件下共培养9天，培养过程中每2天进行1次换液，共计加入分化培养基5次；即得类胰岛细胞团；所述分化培养基由以下组分组成：15～20 mm葡萄糖，8～12 mm烟酰胺，8～12 nm exendin-4，8～12 nm五肽胃泌素，80～120 pm肝细胞生长因子，8～12μm 5-羟色胺，8～12μm丁酰胺，0.08～0.12 mg/ml tpo，1%～5%的b27无血清添加剂，余量为dmem/f12培养基。2.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，接种密度为2
×
105细胞/孔。4.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，每孔加入2 ml的培养基。5.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述干细胞基础培养基为达优间充质干细胞基础培养基。6.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，神经细胞条件培养基是通过以下方法制备得到的：取大鼠脑，置于含10% fbs的dmem/f12培养基中，匀浆将大鼠脑彻底磨碎，50μm细胞滤网过滤得细胞悬液；细胞悬液在37℃、5%co2条件下培养20～28小时；取出培养的上清，向上清中补加含10% fbs的dmem/f12培养基，37℃、5%co2条件下培养4天；收集培养的上清，离心，过0.22μm细胞滤网，即得神经细胞条件培养基。7.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，分化培养基由以下组分组成：17.5 mm葡萄糖，10 mm烟酰胺，10 nm exendin-4，10 nm五肽胃泌素，100 pm肝细胞生长因子，10μm 5-羟色胺，10μm丁酰胺，0.1 mg/ml tpo，2%的b27无血清添加剂，余量为dmem/f12培养基。

技术总结
本发明公开了一种诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，包括以下步骤：（1）取间充质干细胞，接种至培养板中，加入干细胞基础培养基，培养1天；（2）进入分化阶段1，将培养液换为含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养3天，培养过程中进行1次换液；（3）进入分化阶段2，换液为神经细胞条件培养基，培养5天，培养过程中进行1次换液；（4）进入分化阶段3，换液为分化培养基，培养9天，培养过程中每2天进行1次换液；即得类胰岛细胞团。本发明的诱导间充质干细胞分化为类胰岛细胞团的方法，只有3个分化阶段，历时17天即可完成，只需一种分化培养基，效果显著，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：荣耀星 钱云臻 于艳秋
受保护的技术使用者：沈阳汇智细胞产业技术创新研究院有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/7/17